Tài liệu ứng dụng kỹ thuật vi trung hòa trong xác định hiệu giá kháng thể igg trung hòa vi rút dengue

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc ------------------oOo--Tp. HCM, ngày 03 tháng 12 năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ CÔNG DUNG Giới tính : Nam / Nữ X Ngày, tháng, năm sinh : 06/03/1982 Nơi sinh : Tp. Hồ Chí Minh Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006 1- TÊN ĐỀ TÀI: Ứng dụng kỹ thuật vi trung hòa trong xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi-rút dengue-2 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu: Xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi rút dengue trong huyết thanh bệnh nhân sốt dengue và sốt xuất huyết dengue bằng kỹ thuật vi trung hòa. Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Nuôi cấy tế bào Vero 2. Tạo nguồn chủng vi-rút dengue có hiệu giá xác định 3. Xác định độ pha loãng kháng thể đơn dòng (IgG chuột) đặc hiệu với týp huyết thanh vi-rút dengue 4. Xác định độ pha loãng kháng thể IgG dê kháng IgG chuột gắn men HRPO 5. Xác định độ pha loãng chủng vi-rút dengue 6. Xác định độ lặp lại của kỹ thuật vi trung hòa 7. So sánh kỹ thuật vi trung hòa với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 01/2008 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11/2008 5- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. BS. VŨ THỊ QUẾ HƯƠNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua. Tháng 01 năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu: xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi rút dengue trong huyết thanh bệnh nhân sốt dengue và sốt xuất huyết dengue bằng kỹ thuật vi trung hòa. Kỹ thuật vi trung hòa dựa trên phương pháp miễn dịch gắn men (ELISA) đã được nghiên cứu và ứng dụng cho những loại vi-rút khác nhau [11] [50] [81] [82]. Theo kỹ thuật này, vi rút không bị trung hòa bởi kháng thể sẽ xâm nhập vào tế bào và được đánh giá bằng mật độ quang (OD). Kỹ thuật này giúp cho việc đọc kết quả thuận lợi và xử lý số liệu một cách khách quan. Nhằm tạo nguồn sinh phẩm cho các thử nghiệm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào Vero và thu được dòng tế bào cảm nhiễm khá tốt với vi-rút dengue-2. Trên dòng tế bào này, thực hiện gây nhiễm để tạo nguồn chủng vi-rút dengue-2 sử dụng cho các thử nghiệm của kỹ thuật vi trung hòa và kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử. Sử dụng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, sau 7 ngày nuôi cấy, xác định đúng chủng virút dengue-2, không bị tạp nhiễm và tế bào bị gây nhiễm có khả năng bắt màu huỳnh quang đạt yêu cầu. Từ đó tiến hành giữ chủng và xác định hiệu giá. Để xây dựng kỹ thuật vi trung hòa, chúng tôi tiến hành xác định độ pha loãng hai loại kháng thể sử dụng là kháng thể đơn dòng (IgG chuột) đặc hiệu với týp huyết thanh vi-rút dengue-2 và kháng thể IgG dê kháng chuột gắn men HRPO. Với độ pha loãng các kháng thể vừa tìm được, xác định độ pha loãng vi-rút dựa vào các yêu cầu cụ thể của kỹ thuật vi trung hòa. Sau khi đã có đủ các thông số của kỹ thuật vi trung hòa, thực hiện kỹ thuật này trên các mẫu huyết thanh bệnh nhân qua nhiều lần theo quy trình đưa ra để xác định độ lặp lại. Cuối cùng, sử dụng kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử trên mẫu huyết thanh bệnh nhân để so sánh với kỹ thuật vi trung hòa. Từ kết quả thu được, xác định hệ số tương quan giữa hai kỹ thuật làm cơ sở cho khằng định kỹ thuật vi trung hòa có khả năng thay thế kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử trong xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút dengue. MỤC LỤC Trang phụ bìa Nhiệm vụ luận văn thạc sĩ Lời cảm ơn Lời cam đoan Tóm tắt luận văn thạc sĩ Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị, sơ đồ MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 3 1.1. Vi-rút dengue ............................................................................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc ............................................................................................... 3 1.1.2. Lịch sử ..................................................................................................... 3 1.1.3. Tương quan của vi-rút dengue với những vi rút khác ............................... 4 1.1.4. Phức thể vi-rút dengue ............................................................................. 5 1.1.5. Thành phần và cấu trúc của vi-rút ............................................................ 6 1.1.6. Chu kỳ vi-rút ........................................................................................... 8 1.1.7. Đặc điểm hóa sinh lý của vi rion .............................................................. 9 1.1.8. Chẩn đoán vi sinh vật ............................................................................. 10 1.1.9. Chẩn đoán huyết thanh ........................................................................... 11 1.2. Kháng thể và sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với vi rút dengue .. 12 1.2.1. Kháng thể IgG ....................................................................................... 13 1.2.2. Kháng thể IgM ....................................................................................... 13 1.3. Kỹ thuật vi trung hòa .............................................................................. 14 1.3.1. Các định nghĩa ....................................................................................... 14 1.3.2. Lịch sử ................................................................................................... 15 1.3.3. Các loại phản ứng trung hòa .................................................................. 17 1.3.4. Kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử ..................................................... 18 1.3.5. Kỹ thuật vi trung hòa ............................................................................. 20 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 27 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 27 2.1.1. Dụng cụ và trang thiết bị ........................................................................ 27 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 27 2.1.3. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm ............................................................ 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 30 2.2.1. Nuôi cấy tế bào Vero ............................................................................. 30 2.2.2. Tạo nguồn vi rút .................................................................................... 32 2.2.3. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút .................................................... 34 2.2.4. Kỹ thuật vi trung hòa ............................................................................. 37 2.2.5. Xác định độ pha loãng của kháng thể đơn dòng IgG đặc hiệu DEN-2 từ chuột và kháng thể kháng chuột gắn HRPO ..................................................... 40 2.2.6. Xác định độ pha loãng của vi rút DEN-2 ................................................ 43 2.2.7. Xác định độ lặp lại của kỹ thuật vi trung hòa ......................................... 44 2.2.8. So sánh kỹ thuật vi trung hòa với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 46 2.2.9. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu .................................................. 48 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 49 3.1. Nuôi cấy tế bào Vero ............................................................................... 49 3.2. Tạo nguồn vi-rút ...................................................................................... 51 3.3. Chuẩn độ hiệu giá stock vi-rút ................................................................ 54 3.4. Xác định độ pha loãng của CH1và CH2 dùng trong kỹ thuật vi trung hòa . 56 3.5. Xác định độ pha loãng vi-rút .................................................................. 60 3.6. Xác định độ lặp lại của kỹ thuật vi trung hòa ........................................ 61 3.7. So sánh với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử ................................. 65 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................ 70 4.1. Kết luận .................................................................................................... 70 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARN: Acid ribônuclêic ADN: Acid dezoxyribônuclêic CDC: Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention) CMRL: Chemically Defined Basal Medium CPE: Hiệu quả đáp ứng tế bào (Cytopathogenic effect) DEN: Dengue EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA: Phản ứng hấp phụ miễn dịch gắn men (Enzyme-linked immunosorbent assay) FCS: Fetal Calf Serum H+L: Chuỗi nặng (heavy) + chuỗi nhẹ (light) HI: Thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (HemagglutinationInhibition) HRPO: Horse raddish peroxidase IFA: Thử nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect Flourescent Antibody Test) IgG: Kháng thể G (Immune globulin G) IgM: Kháng thể M (Immune globulin M) kDa: Kilo Dalton KTĐD: Kháng thể đơn dòng MAC-ELISA: Thử nghiệm ELISA tóm bắt kháng thể IgM (IgM antibody-capture ELISA) PRNT: Kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (Plaque reduction neutralisation test) RT-PCR: Phản ứng dây chuyền polymerase-transcriptase ngược (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) SD: Sốt dengue SXHD: Sốt xuất huyết dengue TMB: 3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Bố trí các độ pha loãng vi rút trong bảng nhựa 6 giếng ..................... 36 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm trong bảng nhựa của giai đoạn vi rút tiếp xúc tế bào .... 42 Bảng 2.3. Vị trí cho CH1 và CH2 ở 2 khay nhựa liên tiếp ................................. 43 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm cho xác định độ pha loãng vi rút DEN-2 ............... 44 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm trên bảng nhựa 96 giếng trong kỹ thuật vi trung hòa ..... 46 Bảng 2.6. So sánh thông số kỹ thuật của kỹ thuật PRNT và vi TH .................... 47 Bảng 2.7. Vị trí các độ pha loãng huyết thanh của cùng một mẫu trên khay nhựa 6 giếng .......................................................................................................................... 48 Bảng 2.8. Bảng nhựa 6 giếng dùng cho chứng vi rút và tế bào .......................... 48 Bảng 3.1. Kết quả chuẩn độ vi rút trên bảng nhựa 6 giếng ................................ 54 Bảng 3.2. Kết quả xử lý thống kê của thử nghiệm xác định độ pha loãng vi-rút ..... 60 Bảng 3.3. Kết quả hiệu giá kháng thể của 9 mẫu huyết thanh. ........................... 64 Bảng 3.5. Hệ số tương quan của 2 kỹ thuật trên 3 mẫu huyết thanh .................. 67 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu trúc vi rút dengue ......................................................................... 6 Hình 1.2. Cấu trúc và các thành phần protein của vi rút DEN ............................. 7 Hình 1.3. Chu trình sống của Flavi vi-rút ............................................................ 8 Hình 1.4. Thảm tế bào được nhuộm màu còn các đám hoại tử không bắt màu, có hình tròn nhỏ .................................................................................................... 19 Hình 1.5. Tế bào bị gây nhiễm bởi vi-rút Herpes-simplex 1, tạo CPE ............... 20 Hình 1.6. Tế bào vero dưới kính hiển vi soi ngược ........................................... 22 Hình 2.1. Các chai tế bào .................................................................................. 31 Hình 2.2. Nguyên lý kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp ........................ 33 Hình 2.3. Kỹ thuật IFA trên lam 12 giếng ......................................................... 33 Hình 3.1. Tế bào Vero sau 1 ngày nuôi cấy ...................................................... 49 Hình 3.2. Tế bào Vero sau 5 ngày nuôi cấy ...................................................... 49 Hình 3.3. Tế bào Vero bị vi rút dengue-2 xâm nhập tạo CPE ............................ 51 Hình 3.4. Kết quả nhuộm IFA của nuôi tế bào Vero nhiễm vi rút DEN-2 dương tính với KTĐD NGC 3H5-1-21 ............................................................................... 52 Hình 3.5. IFA tế bào Vero sau 14 ngày cấy vi rút DEN-2 ................................. 53 Hình 3.6. Hình ảnh chuẩn độ vi-rút theo đơn vị PFU/mL trên khay nhựa 6 giếng ... 54 Hình 3.7. Hình ảnh khay nhựa 96 giếng ở bước đọc kết quả bằng OD trong thí nghiệm xác định độ pha loãng CH1, CH2 ......................................................... 56 Hình 3.8. Hình ảnh khay nhựa 96 giếng ở bước đọc kết quả bằng OD trong thí nghiệm xác định độ lặp lại của kỹ thuật vi trung hòa. ....................................... 61 Sơ đồ 1.1. Sự xuất hiện kháng thể IgM và IgG ở người nhiễm vi-rút dengue theo thời gian ........................................................................................................... 12 Sơ đồ 1.2. Sơ đồ trình bày cơ chế trung hòa vi-rút ............................................ 15 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ kỹ thuật vi trung hòa .............................................................. 38 Đồ thị 3.1. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên OD của chứng vi rút dựa trên độ pha loãng CH2 và CH1 ........................................................................................... 58 Đồ thị 3.2.Đồ thị biểu diễn sự biến thiên OD của chứng tế bào dựa trên độ pha loãng CH2 (c), CH1 (d) ................................................................................... 59 Đồ thị 3.3. Giá trị OD trung bình của mẫu 1, đợt 2. .......................................... 62 Đồ thị 3.4. Sự biến thiên giá trị OD theo độ pha loãng huyết thanh .................. 66 Đồ thị 3.5. So sánh về điểm pha loãng cuối đạt 50% trung hòa ......................... 66 Đồ thị 3.6. Mối tương quan về hiệu giá giữa 2 kỹ thuật trên 3 mẫu huyết thanh. ..... 67 1 MỞ ĐẦU Vi-rút dengue thuộc họ Flaviviridae, nhóm này có khoảng 70 loại vi-rút. Trong đó, chỉ có một số ít loại đáng chú ý đối với sức khỏe cộng đồng (là vi-rút dengue, vi-rút sốt vàng, vi-rút viêm não St. Louis, vi-rút Tây sông Nile và vi-rút viêm não Nhật Bản). Hầu hết các vi-rút nói trên là những vi-rút gây ra dịch bệnh cho người [12]. Bên cạnh đó, phản ứng chéo giữa những kháng nguyên thuộc nhóm này cũng gây khó khăn cho việc chẩn đoán và giám sát dịch ở những vùng cùng lúc lưu hành từ 2 loại vi-rút thuộc nhóm flavivi-rút trở lên cụ thể như vi-rút dengue và vi-rút sốt vàng ở Châu Phi và Nam Mỹ, vi-rút dengue và vi-rút viêm não Nhật Bản ở Châu Á, vi-rút viêm não St. Louis và vi-rút Tây sông Nile ở Bắc Mỹ. Mặc dù sự đáp ứng miễn dịch đối với mỗi vi-rút là đặc hiệu týp huyết thanh virút, tuy nhiên các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học trong từng trường hợp cụ thể có thể không phân biệt được các týp huyết thanh vi-rút. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu [14] và phương pháp miễn dịch gắn men (ELISA) phát hiện kháng thể IgG [18] [53] có phản ứng chéo trong cùng nhóm flavivi-rút và trong việc chuẩn độ kháng thể dựa vào kháng nguyên tương ứng cho chứng dương khá cao. Hơn nữa, các kỹ thuật đó yêu cầu gắt gao về thời điểm lấy mẫu từ bệnh nhân [29]. Phương pháp ELISA thu bắt kháng thể IgM (MAC-ELISA) được sử dụng nhiều nhất trong chẩn đoán phòng thí nghiệm của nhóm flavivi-rút cũng cho phản ứng chéo giữa các týp huyết thanh vi-rút dengue, mặc dù giúp phân biệt giữa virút dengue và vi-rút viêm não Nhật Bản (CDC, tài liệu nội bộ). Kỹ thuật cố định bổ thể đặc hiệu týp huyết thanh với nhóm vi-rút dengue nhưng lại dựa trên kháng thể không bền và hiện nay hiếm khi được sử dụng. Phản ứng trung hòa vi-rút được biết đến nhiều qua kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT). Đây là kỹ thuật đặc hiệu cho týp huyết thanh vi-rút dengue, thường được sử dụng và đáng tin cậy. Trong kỹ thuật PRNT, huyết thanh bệnh nhân được pha loãng, vi-rút được chuẩn độ và sử dụng ở một mức hiệu giá cố định để có 2 thể đếm được các đám hoại tử (plaque). Kỹ thuật này cần ống nghiệm pha loãng và nhiều khay (plate) tế bào 6 giếng cho mỗi mẫu huyết thanh, chất phủ, chất nhuộm, đồng thời tốn nhiều thời gian và đòi hỏi kỹ thuật viên thành thạo cho thao tác thử nghiệm, đếm plaque và tính kết quả. Vì thế, đã có những nghiên cứu tiền khởi cho việc phát triển kỹ thuật vi trung hòa đã được công bố trên thế giới [54] [77]. Những nghiên cứu này bao gồm việc đếm ít plaque hơn hoặc sử dụng loại giếng nhỏ hơn để nuôi tế bào cảm nhiễm nhằm tiết kiệm sinh phẩm một cách hợp lý, giảm thời gian nhưng vẫn cho kết quả chính xác và hiệu quả không giảm. Kỹ thuật vi trung hòa dựa trên phương pháp miễn dịch gắn men (ELISA) đã được nghiên cứu và ứng dụng cho những loại vi-rút khác nhau [11] [50] [81] [82]. Theo kỹ thuật này, vi rút không bị trung hòa bởi kháng thể sẽ xâm nhập vào tế bào và được đánh giá bằng mật độ quang (OD) nhờ đó việc đọc kết quả thuận lợi, xử lý số liệu một cách khách quan. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật vi trung hòa trong chẩn đoán xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi-rút dengue”. Mục tiêu của luận văn này nhằm xác định hiệu giá kháng thể IgG trung hòa vi rút dengue trong huyết thanh bệnh nhân sốt dengue và sốt xuất huyết dengue bằng kỹ thuật vi trung hòa khi sử dụng plate 96 giếng và bước miễn dịch gắn men. Sau khi số liệu được thu nhận, hiệu quả kỹ thuật được đánh giá bằng cách so sánh với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử. Nội dung luân văn bao gồm các bước sau: 1. Nuôi cấy tế bào Vero 2. Tạo nguồn chủng vi-rút dengue có hiệu giá xác định 3. Xác định độ pha loãng kháng thể đơn dòng (IgG chuột) đặc hiệu với týp huyết thanh vi-rút dengue 4. Xác định độ pha loãng kháng thể IgG dê kháng IgG chuột gắn men HRPO 5. Xác định độ pha loãng chủng vi-rút dengue 6. Xác định độ lặp lại của kỹ thuật vi trung hòa 7. So sánh kỹ thuật vi trung hòa với kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi-rút dengue. 1.1.1. Nguồn gốc. Vi-rút dengue là nguyên nhân gây ra bệnh sốt dengue và sốt xuất huyết dengue. Có nhiều tranh luận xung quanh vấn đề nguồn gốc của vi-rút dengue. Một vài tác giả gần đây cho rằng nguồn gốc từ Châu Phi và lan rộng khắp thế giới qua việc buôn bán nô lệ [38] [24]. Gần hơn nữa, đã có ý kiến cho rằng vi-rút xuất phát từ chu trình rừng (forest cycle) cùng với động vật bậc thấp và muỗi canopy-dwelling ở Malay Peninsula [61] [30]. Cả 4 týp huyết thanh vi-rút đều được chứng minh là có ở chu trình rừng ở Châu Á, trong khi chỉ có 1 chủng vi-rút dengue 2 (DEN-2) tìm thấy ở Châu Phi [61] [15]. Quan điểm hiện tại cho rằng vi-rút có thể có nguồn gốc từ Châu Á, dẫn chứng bằng điều tra huyết thanh ở miền quê Malaysia vào thập niên 50 [28]. 1.1.2. Lịch sử. Năm 1779, những vụ dịch được cho là dengue (“sốt nói chung”) đầu tiên đồng loạt bùng nổ ở Batavia (Jakarta) và Cairo [75]. Tiếp đó, dịch dengue được báo cáo ở Philadelphia (1780), Zanzibar (1823 và 1870), Calcutta (1824, 1853, 1871, 1905), Tây Ấn (1827), và Hồng Kông (1901) [71]. Người ta cho rằng khả năng tất cả những trận dịch đó gây ra do vi-rút dengue nhiều hơn là do vi-rút chikungunya mặc dù biểu hiện lâm sàng trên người của chúng gần giống nhau [13] [51]. Tuy nhiên, khoảng thời gian các vụ dịch dengue xảy ra trong thế kỷ này đều có sự xuất hiện của véc-tơ truyền bệnh là muỗi. Vài vụ dịch lớn đã xảy ra ở Mỹ (1922), Úc (1925 – 1926), Hi-lạp (1927 – 1928) và Nhật (1942 – 1945) [68]. 4 Năm 1922, dịch sốt dengue ở miền nam nước Mỹ đã ảnh hưởng 1 đến 2 triệu người [67]. Vi-rút dengue đầu tiên được Sabin A.B. tìm ra trong Thế chiến II (1944) trong những binh lính ở Calcutta, New Guinea và Hawaii [69]. Các vi-rút phân lập ra ở Ấn độ, Hawaii và một chủng ở New Guinea có kháng nguyên giống nhau được gọi là DEN-1. Ba chủng khác còn lại ở New Guinea có kháng nguyên khác với chủng trên, được gọi là DEN-2 và được coi là các chủng mẫu (DEN-1 Hawaii, DEN-2 New Guinea). Sau đó, hai týp huyết thanh khác là DEN-3 và DEN-4 lần lượt được Hammon W. McD. tìm ra từ bệnh nhân mắc sốt xuất huyết ở Manila, 1956 [31]. Cho tới nay đã có rất nhiều vi-rút dengue được tìm ra ở nhiều nơi trên thế giới, song tất cả đều nằm trong 4 týp huyết thanh đã phân loại. Các vi-rút dengue có kháng nguyên gần giống các flavivi-rút khác như vi-rút Tây sông Nile, vi-rút viêm não Nhật Bản, vi-rút sốt vàng và sinh thái học còn tương tự một Togavi-rút, như là vi-rút Chikungunya [3]. 1.1.3. Tương quan của vi-rút dengue với những vi-rút khác. Vi-rút dengue thuộc loại Flavivi-rút trong họ Flaviviridae, có 4 týp huyết thanh gọi là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4. Sau khi mắc bệnh, bệnh nhân không có bảo vệ chéo, có nghĩa là một người sống trong khu vực có lưu hành virút dengue, trong đời mình có thể mắc bệnh tới bốn lần, mỗi lần do một týp huyết thanh khác gây ra. Các kháng nguyên dengue trong phần lớn các phản ứng huyết thanh có phản ứng chéo rất mạnh, nhất là sau khi mắc lần hai hoặc ba và cũng có phản ứng chéo với các Flavivi-rút khác. Do có phản ứng chéo trong huyết thanh, nên đã thấy có sự lẫn lộn trong các điều tra huyết thanh dịch tễ học. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (NNKHC) thường được dùng trong các điều tra huyết thanh học đã không phát hiện được týp huyết thanh đặc hiệu vì phần lớn các Flavivi-rút có phản ứng chéo trong thử nghiệm này. Vì vậy, thật là khó để kết luật đây là kháng thể của vi-rút dengue hay của các Flavivi-rút khác nếu như ở trong khu vực điều tra cũng có lưu hành các vi-rút này. Trong số các phản ứng huyết 5 thanh, chỉ có phản ứng trung hòa là đặc hiệu hơn cả và đã được dùng để phân biệt kháng thể dengue với kháng thể của các Flavivi-rút khác. Mặc dù 4 týp vi-rút dengue có kháng nguyên khác nhau, song trong huyết thanh học vẫn tìm thấy mối liên hệ giữa các kháng nguyên này. Ví dụ, vi-rút DEN-1 và vi-rút DEN-3 có vài thành phần kháng nguyên giống nhau phát hiện được bằng kháng thể đơn dòng trong phản ứng trung hòa và miễn dịch huỳnh quang. Gần đây sử dụng kỹ thuật que dò lai ghép cDNA đã thấy giữa vi-rút DEN1 và vi-rút DEN-4 có liên quan về di truyền rất gần nhau, hai týp này có tới 70% trình tự cấu trúc gien giống nhau, trong khi đó chỉ có khoảng 23 - 36% trình tự cấu trúc gien của vi-rút DEN-2 là giống với các týp huyết thanh khác; và một phát hiện mới nữa là vi-rút DEN-2 có tới 71% sắp xếp gien giống với vi-rút Edge Hill, cũng là một Flavivi-rút, song có sinh thái học hoàn toàn khác mà trước đây khoa học chưa biết là nó đã có cấu trúc gien gần giống vi-rút dengue [3]. 1.1.4. Phức thể vi-rút dengue. Có thể nhận thấy rằng vi-rút dengue thuộc loại phức thể vi-rút dễ nhận biết dựa trên các đặc điểm về bệnh học, sinh học và miễn dịch học. Báo cáo ban đầu cho thấy thực sự đã xác định được kháng nguyên đặc hiệu với phức thể dựa vào phương pháp trung hòa của Smithburn năm 1954 [76]. Russel và cs. (1970) đã chứng minh có sự tồn tại của kháng nguyên đặc hiệu phức thể dengue trên protein phi cấu trúc NS1 (kháng nguyên gắn kháng thể hòa tan) theo phương pháp cố định bổ thể (complement fixation) và phân tích kết tủa miễn dịch (immunoprecipitation analysis) [62]. Sử dụng phương pháp trung hòa giảm đám hoại tử cải tiến, De Madrid và Porterfield đã chứng minh chắc chắn bằng nghiên cứu toàn diện rằng các týp huyết thanh vi-rút dengue được cấu thành từ những phức thể đơn lẻ của virút [19]. Thử nghiệm này còn được xác minh khi Henchal và cộng sự đã tìm thấy những vị điểm kháng nguyên (epitope) đáp ứng đặc hiệu với phức thể trên các kháng nguyên cấu trúc và phi cấu trúc bằng cách dùng kháng thể đơn dòng từ chuột [33] [34]. Kể từ khi nhận biết được sốt xuất huyết dengue và sốc dengue có 6 liên quan đến các phản ứng miễn dịch trong các phức thể vi-rút dengue thì có thể xác định kháng nguyên dựa vào sinh bệnh miễn dịch học của bệnh [36]. 1.1.5. Thành phần và cấu trúc của vi-rút dengue. Cũng như những Flavivi-rút khác, những virion dengue trưởng thành chứa bộ gien ARN sợi đơn với khối lượng phân tử là 3,8.106 Dalton, bao bọc bởi nucleocapsid cấu thành bởi 32 capsomer, đường kính 30 nm. Nucleocapsid này được bao phủ bởi một lớp vỏ lipid dày 10 nm. Một virion hoàn chỉnh sẽ có hình cầu, đối xứng hình khối, đường kính khoảng 50 nm. Virion đo bằng phương pháp ly tâm cân bằng với sự biến thiên gradient sucrose oxít đơtrium và mức độ lắng trong khoảng 210 S20,w [66]. Tỷ lệ ARN/Protein/lipid/glucid bằng 6/66/17/9, tỷ lệ này có thể thay đổi chút ít do kỹ thuật tinh chế và loại tế bào vi-rút xâm nhiễm. Hình 1.1: Cấu trúc của vi-rút dengue. (Nguồn: Marianneau, 1997) [87] Phần chính của bộ gien là một khung đọc duy nhất mã hóa cho một polyprotein khoảng 3400 axít amin bao gồm toàn bộ các protein của vi-rút [17]. Các virion trưởng thành chứa 3 protein cấu trúc. Protein lõi C khoảng 13kDa, tạo nên một cấu trúc hình khối hai mươi mặt, bao lấy ARN. Kế tiếp, lõi được bao quanh bởi protein vỏ E (50-60 kDa) và protein màng M (7-8 kDa). Các virion chưa trưởng thành trong nội bào cũng chứa protein tiền màng prM (19-20 kDa) và protein vỏ E. 7 Các protein cấu trúc C, prM/M và E của virion được mã hóa từ đầu 5’ của bộ gen vi-rút, tiếp theo sau với 7 protein không cấu trúc gọi là NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5. Chức năng của một số protein không cấu trúc hiện nay vẫn còn chưa rõ. So sánh trình tự nucleotide và phân tích sinh hóa gợi ý rằng protein NS3 có thể có 3 chức năng và có hoạt tính enzym protease, helicase và ARN triphosphatase [43] [83] [84]. Hoạt tính enzym ARN polymerase phụ thuộc ARN của protein NS5 đã được chứng minh trong in vitro [79]. Cuối cùng, dường như glycoprotein NS1 nội bào có thể tham gia trong quá trình nhân lên của vi-rút [47] [59], trong khi dạng protein NS1 hiện diện trên bề mặt tế bào nhiễm vi-rút hoặc được bài tiết trong môi trường nuôi cấy có thể tham gian trong những giai đoạn khác của chu kỳ vi-rút [25]. Hình 1.2: (nguồn Đỗ Quang Hà, 2003) [3] 8 Có thể nuôi cấy vi-rút dengue trên các tế bào nuôi như Vero, Hela, KB và tế bào muỗi C6/36. 1.1.6. Chu kỳ vi-rút dengue. Chu kỳ vi-rút của các Flavivi-rút được nghiên cứu trong in vitro. Như phần lớn các Flavivi-rút, vi-rút dengue có thể nhân lên trong nhiều tế bào động vật hoặc côn trùng. Chu kỳ vi-rút bao gồm nhiều giai đoạn: virion hấp phụ và xâm nhập vào tế bào, nhân bộ gien vi-rút, tổng hợp và trưởng thành các protein vi-rút, hình thành và phóng thích các virion [9]. Giai đoạn tiếp xúc với tế bào, vi-rút gắn vào thụ quan của tế bào chủ. Sau khi tiếp xúc, vi-rút đi vào bên trong nhờ màng tế bào bao lấy vi-rút ở pH thấp (pH = 6,5). Hình dạng các bộ ba của protein vỏ E của vi-rút bị biến đổi thành bộ hai. Màng vi-rút hoà vào màng nội bào giải phóng capsid nhân ra tế bào chất. Tiếp đến là phá vỡ lớp vỏ capsid nhân và ARN của vi-rút được giải phóng ra ngoài. ARN đi đến mạng lưới nội chất nhám để thực hiện dịch mã và tổng hợp polyprotein. CHU TRÌNH SỐNG CỦA FLAVIVI-RÚT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Xâm nhiễm Nhập bào pH thấp Cởi bỏ Dịch mã Sao chép RNA Trưởng thành Phóng thích Hình 1.3: Chu trình sống của Flavivi-rút. 9 Sự dịch mã protein xảy ra nhờ những ribosome chất nguyên sinh trên bề mặt của lưới nội chất nhám. ARN vi-rút được dịch mã thành polyprotein với 3000 axít amin đơn lẻ [88]. Polyprotein này chia ra dịch mã cùng thời điểm và cùng vị trí nhờ những enzym protease của vi-rút và tế bào chủ. Tại màng bao nhân, ARN bắt đầu sao chép. Sợi ARN dương được sao chép tạo sợi âm là sản phẩm tạm thời của phân tử ARN sợi dương phức tạp, có thể gọi đây là những bộ gien sơ khởi. Tiếp đó, trong khoang của lưới nội chất nhám capsid nhân của vi-rút mới thực sự hình thành. ARN vi-rút mới được tạo thành tương tác với protein C để tạo thành capsid nhân. Capsid nhân đó tiếp tục đi xuyên qua lưới nội chất tạo nên lớp vỏ ở vị trí màng từ những protein D và PrM và hình thành nên virion non trong túi nguyên sinh chất. Đám virion non được chuyển đến thể Golgi để cất giữ. Phần đường còn lại được thêm vào cùng với các protein trưởng thành tạo nên vi-rút hoàn chỉnh đi ra khỏi thể Golgi. Vi-rút hoàn chỉnh được chuyển đi bằng các túi và phóng thích ra bề mặt tế bào bằng cơ chế tiết dịch ngoại bào [88]. 1.1.7. Đặc điểm hóa sinh lý của virion. Nuôi cấy: Vi-rút dengue dễ dàng nhân lên trong não chuột nhắt trắng 1-3 ngày tuổi, virút phát triển làm cho chuột bị liệt từ ngày thứ 3 trở đi. Người ta còn nuôi cấy vi-rút vào cơ thể muỗi Toxorhynchites và Aedes aegypti. Khả năng đề kháng: Vi-rút dengue nhạy cảm với các dung môi hoà tan lipid như ether, natri desoxycholat, formalin… dưới tác dụng của tia cực tím, vi-rút bị phá hủy dễ dàng. Ở 60ºC, vi-rút bị tiêu diệt sau 30 phút, ở 4ºC bị tiêu diệt sau vài giờ, nhưng nếu ở trong dung dịch glycerol 50% hay đông lạnh bảo quản ở -70ºC thì vi-rút có thể sống được vài tháng tới vài năm. 10 Các yếu tố V trong huyết thanh bò và thỏ giúp cho việc bảo quản vi-rút được vững bền hơn. Tính chất kháng nguyên: Vi-rút dengue có kháng nguyên kết hợp bổ thể, trung hòa và ngăn ngưng kết hồng cầu. Dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định kháng nguyên, người ta chia vi-rút dengue ra làm 4 týp khác nhau, được ký hiệu là: DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4. Mặc dù 4 týp vi-rút dengue có tính chất kháng nguyên khác nhau nhưng chắc chắn chúng có một số quyết định kháng nguyên chung, nhất là các kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu, nên chúng có hiện tượng nhưng kết chéo giữa các týp. Trong phản ứng ngưng kết hồng cầu, pH 6,4 là thích hợp nhất cho vi-rút ngưng kết với hồng cầu. 1.1.8. Chẩn đoán vi sinh vật: Bệnh phẩm: Lấy 2 – 4 mL máu bệnh nhân trong giai đoạn sốt chưa quá 4 ngày kể từ khi khởi sốt, có chất chống đông. Ở tử thi, lấy tổ chức gan, lách, hạch lympho… cần lấy ngay sau khi chết chưa quá 6 giờ, được bảo quản bởi glycerin 50%. Véc-tơ: Bắt 20 – 40 con muỗi A. Aegypti. Bệnh phẩm được bảo quản lạnh, riêng muỗi giữ cho sống, ghi rõ tên, tuổi, giới tính, số bệnh phẩm, địa chỉ, ngày phát bệnh, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm và những dấu hiệu lâm sàng chính rồi gửi ngay tới phòng xét nghiệm. Phân lập vi-rút: Hiện nay người ta thường dùng 3 kỹ thuật để phân lập vi-rút dengue: - Kỹ thuật phân lập trên chuột bạch từ 1 – 3 ngày tuổi: Bệnh phẩm được tiêm vào não chuột bạch từ 1 – 3 ngày tuổi, theo dõi hàng ngày. Nếu chuột bị bệnh, chuột sẽ liệt 2 chi sau. Mổ lấy não để tiêm tiếp hai lần nữa. Sau khi gây nhiễm 1 tuần, nếu 11 chuột không ốm cũng mổ để lấy não phát hiện vi-rút. Dùng kỹ thuật này, người ta đã phân lập được cả 4 týp vi-rút dengue, nhưng kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, độ nhạy thấp, lại tốn kém, do đó ít được dùng. - Kỹ thuật phân lập trên muỗi sống: Bệnh phẩm tiêm vào ngực muỗi Toxorhynchites. Sau khi tiêm, nuôi muỗi trong lồng ở 28ºC trong 14 ngày, bắt những con muỗi còn sống, giữ trong -70ºC để xác định vi-rút. Phương pháp này có độ nhạy cao nên được dùng trong các trường hợp quan trọng như: Xuất huyết nặng, hoặc những trường hợp nguy kịch có thể dẫn đến tử vong. - Kỹ thuật phân lập trên tế bào nuôi: Cho bệnh phẩm vào tế bào nuôi một lớp muỗi A. albopictus dòng C6/36. Sau 7 ngày, thu hoạch tế bào để xác định vi-rút. Phương pháp này giúp cho việc phân lập vi-rút được nhanh hơn và ít tốn kém hơn, tuy nhiên nó không nhạy bằng phương pháp gây nhiễm trực tiếp vào muỗi. Định loại vi-rút: Sau khi nuôi cấy phân lập được vi-rút, chúng ta phải định loại vi-rút. Hiện nay có 4 kỹ thuật thường dùng: - Kỹ thuật kết hợp bổ thể. - Kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử: Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc là khi vi-rút nhiễm vào tế bào thì vi-rút sẽ tạo ra những đám hoại tử (plaque) trên các tế bào nuôi cấy một lớp cảm thụ. Những đám hoại tử này bị trung hòa bởi sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu đã biết. - Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. - Kỹ thuật khuếch đại ADN/ARN (PCR). 1.1.9. Chẩn đoán huyết thanh. Bệnh phẩm: