Tài liệu Ứng dụng kỹ thuật prc để xác định listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN TRẦN VĂN TUẤN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 201 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, Trước tiên tôi xin gởi lời cam ơn đến Quí thầy cô thuộc Bộ Môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ luôn quan tâm tận tình đến tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Ngoài ra tôi đã nhận được sự giúp đở rất lớn từ Thạc sĩ Phạn Văn Hùng, Phó Giám Đốc Trung Tâm Nông lâm Thủy Sản vùng 6 và các cán bộ khác ở phòng kiểm nghiệm vi sinh của Trung Tâm. Bên cạnh đó còn có những người không thể nao không nhắc đến đó là gia đình và bạn bè tôi đã chăm sóc và luôn ủng hộ cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin chân thành tri ân đến tất cả mọi người! i TÓM LƯỢC Việc phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản ngày càng gia tăng trong thời gian gần đây. Đây là một loại vi khuẩn gây nhiều bệnh nguy hiểm trên người. Hiện nay việc xác định loại vi khuẩn này trong thủy sản chủ yếu là dùng Phương pháp ISO 11290-1:2004 nhưng thời gian cho kết quả kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp âm tính đến bảy ngày cho trường hợp dương tính. Điều này thật sự đã gây nhiều trở ngại cho hoạt động sản xuất mặt hàng thủy sản. Vì thế úng dụng các phương phân tích nhanh là rất cần thiết, trong đó có Phương pháp PCR. Phương pháp này có thể cho kết quả trong thời gian từ hai đến ba ngày. Để ứng dụng Phương pháp này vào thực tiển thì cần phải kiểm tra độ đặc hiệu đối với L.monocytogenes, độ lập lại của phương pháp và tính tương đồng của phương pháp so với Phương pháp ISO 11290-1:2004. Sau quá trình thí nghiệm từ tháng 1/2010 – 4/2010 ở Trung Tâm Nông Lâm Thủy Sản Vùng 6, kết quả cho thấy Phương pháp PCR đặc hiệu với L.monocytogenes, 100% số lần lập lại đều cho kết quả dương tính và phương pháp phân tích nhanh L.monocytogens bằng PCR cho kết quả tương đồng với phương pháp định tính L.monocytogenes theo ISO 11290-1:2004. Qua đó cho thấy có thể ứng dụng Phương pháp PCR một bước trong xác định nhanh L.monocytogenes vào thực tế kiểm nghiệm. Từ khóa : PCR; Listeria monocytogenes ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT L.mono L. innocua L.ivanoii R. equi S. aureus AOAC FDA ISO PCR HF ALOA SPW TSYEA TSYEB TSA BHI TBE Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria ivanoii Rodococcus equi Saphylococcus aureus Association of Analytial Communities (Hiệp hội các nhà phân tích) Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ) International Standard Organization (Tổ chức tiêu chuẩn Quốc Tế) Polymerase Chain Reacion Half Fraser Broth Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI Salty peptone water (Nước muối sinh lý) Trytone soya broth Yeast extract Agar Trytone soya broth Yeast extract Tryptic Soy Agar Brain Heart Infusion Tris- Borate EDTA iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .......................................................................................................i Tóm lược........................................................................................................ ii Danh mục từ viết tắt ...................................................................................... iii Mục lục ..........................................................................................................iv Danh sách bảng ..............................................................................................vi Danh sách hình..............................................................................................vii Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................1 1.1 Giới thiệu ................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu đề tài.......................................................................................... 2 1.3 Nội dụng nghiên cứu ................................................................................ 2 1.4 Thời gian thực hiện đề tài ......................................................................... 2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................3 2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes ...................................................... 3 2.1.1. Phân loại hoc ................................................................................. 3 2.1.2. Hình thái học .................................................................................3 2.1.3 Đặc điếm sinh lý............................................................................. 4 2.1.4 Khả năng chịu đựng ........................................................................5 2.1.5 Phân bố nguồn lây nhiễm................................................................5 2.1.6 Đặc điểm gây bệnh ..........................................................................5 2.2. Các phương pháp .................................................................................... 7 2.2.1. Theo ISO 11290 -1:2004 ............................................................... 7 2.2.2. Theo phương pháp áp dụng kỷ thuật PCR.....................................11 Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ..........15 3.1 Phương tiện thí nghiệm............................................................................15 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................15 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu.....................................................................15 3.1.3. Mẫu thủy sản ................................................................................15 3.1.4. Chủng vi sinh ...............................................................................15 3.1.5. Môi trường, hóa chất ...................................................................15 3.1.6 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................15 3.2 Qui trình định tính L.monocytogenes bằng kỷ thuật PCR ......................16 3.2.1 Thuyết minh qui trình ....................................................................16 3.3. Phương pháp thí nghiệm................................................................................18 3.3.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ lập lại của phương pháp . ...................16 3.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy ..................................................20 3.3.3. Thí nghiệm 3 : Xác định độ lặp lại................................................22 3.3.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp...............23 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................26 4.1 Kết quả thí nghiệm 1 ........................................................................26 4.2 Kết quả thí nghiệm 2...........................................................................27 4.3 Kết quả thí nghiệm 3 ..........................................................................29 4.4 Kết quả thí nghiệm 4 .................................................................................30 iv Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.........................................................34 PHỤ LỤC HÌNH ........................................................................................ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 38 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1. Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria.....................4 Bảng 2.2. Một số thông số cơ bản của Listeria ................................................4 Bảng 3.1. Các giai doạn chính trong quá trình chạy PCR...............................17 Bảng 3.2. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm..................................20 Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm 1 xác định độ đặc hiệu…….............................26 Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy.............................................28 Bảng 4.3. Kết quả thí nghiệm xác định độ lặp lại ……….. ............................30 Bảng 4.4. Kết quả thí nghiệm 4 xác định độ tương đồng………… ................31 Bảng 4.5. Bảng so sánh các ưu khuyết điểm của hai phương pháp…….........32 vi Trang vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290 -1: 2004 ...............................................................................................................8 Hinh 2.2: Chu trình nhiệt trong máy luân nhiệt PCR ....................................12 Hình 3.1: Sơ đồ phân tích nhanh Listeria monocytogenes bằng kỷ thuật PCR..............................................................................................................16 Hình 3.2: Sơ đồ thí nghiệm 1 xác định độ nhạy ............................................19 Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm 2 xác định độ lặp lại ..........................................21 Hình 3.4: Sơ đồ thí nghiệm 3 xác định độ tương đồng..................................24 Hình 4.1: Ảnh chụp kết quả chạy điện di thí nghiệm 1 .................................27 Hình 4.2: Ảnh chụp kết quả chạy điện di thí nghiệm 2 ................................29 Hình 4.3: Ảnh chụp kết quả chạy điện di thí nghiệm 3..................................30 Hình 4.4: Ảnh chụp mẫu nhiễm Listeria monocytogenes trên ALOA ...........32 Hình 4.5: Ảnh chụp kết quả phân tích mẫu nhiễm Listeria monocytogenes trên PCR một bước..............................................................33 vii Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Thủy sản là một trong những ngành đóng góp vào nguồn thu ngoại tệ nhiều nhất nước ta, thế nhưng trong nhưng năm gần đây mặt hàng này đang gặp khó khăn về thị trường xuất khẩu do vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm còn chưa tốt, trong đó các trường hợp bị nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị phát hiện ngày càng gia tăng, năm 2007 khi phân tích loại vi khuẩn này trên sản phẩm cá tra đông lạnh thì có tới 21.5% cho kết quả dương tính, và tăng lên 30.36% vào năm 2008. với đặc tính gây ra nhiều bệnh nguy hiểm trên người như gây nhiễm trùng máu, viêm màng não ở trẻ em, đối với phụ nữ mang thai thì dễ bị sảy thai, để non và trẻ chết sau khi sinh…, Listeria monocytogenes đã trở thành mối quan tâm lớn của khách hàng và các trung tâm kiểm tra chất lượng trên thế giới. Hiện nay có nhiều phương pháp được ứng dụng để xác định Listeria monocytognens trong thực phẩm. Trong đó có các phương pháp truyền thống như: ISO 11290- 1:2004, BAM-FDA, USDA, ALOA có thể định danh Listeria.momocytogenes trong thực phẩm bao gồm nhiều bước phức tạp như tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và dùng các thử nghiệm hóa sinh để dịnh danh. Các phương pháp truyền thống này cần nhiều thời gian thực hiện từ ba đến bốn ngày cho các trường hợp âm tính và năm đến bảy ngày cho trường hợp dương tính. Do hạn chế này mà dẫn đến nhiều khó khăn, bất tiện trong hoạt động sản xuất kèm theo sản phẩm bị tổn thất và giảm chất lượng vì phải lưu kho trong thời gian dài để đợi kết quả phân tích. Hiện nay đang phát triển các phương pháp hiện đại như phương pháp miễn dịch ELISA, phương pháp phân tích nhanh RAPID`Lmono, ...để phát hiện nhanh Listeria monocytogenes. Khi tìm ra được gen đặc hiệu cho Listeria monocytogenes thì việc ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định Listeria monocytogenes đang có nhiều triển vọng có thể rút ngắn được thời gian xét nghiệm xuống còn từ 2-3 ngày trong khi đó có độ tin cậy cao và dễ thực hiện, từ đó mà khác phục được hạn chế lớn nhất của phương pháp ISO 11290- 1:2004. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu về “ ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản”. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài Kiểm tra khả năng ứng dụng kỹ thuật PCR một bước để phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản ở điều kiện phòng thí nghiệm thông qua phân tích các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu Độ nhạy Độ lặp lại Sự tương đồng của hai phương pháp PCR và ISO11290 – 1:2004 1.3 Nội dung nghiên cứu Xác định độ đặc hiệu bằng cách cho chạy PCR trên mẫu có chứa DNA của vi khuẩn Listeria monocytogenes và các mẫu có chứa DNA của các vi khuẩn Listeria spp khác không phải Listeria monocytogenes. Dựa trên sử dụng các chế phẩm chuyên dùng phân tích Listeria spp Xác định độ nhạy của bước khuếch đại DNA trong kỹ thuật PCR một bước bằng cách dựa vào độ đục chuẩn của McFarland để pha loảng chủng ra nhiều nồng độ sau đó tiến hành chạy PCR. Nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được vạch DNA trên ảnh gel doc là độ nhạy của phương pháp. Xác định độ lặp lại của kỹ thuật thông qua việc tiến hành phân tích nhiều lần lập lại các mẫu có chứa Listeria monocytogenes ở một nồng độ nhất định trong điều kiện phòng thí nghiêm để đánh giá được mức độ ổn định của kỹ thuật. Xác định độ tương đồng của phương pháp PCR và phương pháp ISO11290 – 1:2004 bằng cách tiến hành song song hai phương pháp để xác định Listeria monocytogenes 1.4 Thời gian thực hiên Từ tháng 1/2010 đến 5/2010 2 Chương 2: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về Listeria monocytogenes 2.1.1 Phân loại học 2.1.1.1 Phân loại theo kiểu hình Có sáu loài thuộc loại Listeria spp: L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii L.innocua và L. grayi. Loại L. grayi có hai loài phụ là L.grayigrayi và L. grayimurrayi. 2.1.1.2 Phân loại theo huyết thanh Dựa trên các tương tác của kháng nguyên O (somatic) và kháng nguyên (flagella) H với các kháng huyết thanh một hay nhiều hóa trị để tiến hành phân ra các tiếp huyết thanh chính và phụ. Có tất cả là 15 chủng huyết thanh trong đó có 12 chủng riêng và 3 chủng phức hợp, chủng I bao gồm serovars 1/2b, 3b, 4b, 4d và 4e, chủng II có chứa serovars 1 / 2a, 1/2c, 3a, 3c và chủng III gồm serovars 4a, 4c và có thể là 7. Gần đây, chủng III tiếp tục được chia thành ba nhóm con (IIIA, IIIB và IIIC), cụ thể là Listeria monocytogenes bao gồm các tiếp huyết thanh 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, “7”. L.ivanovii có kiểu huyết thanh 5. L.innnocua có 4ab, 6a, 6b, Una. L.welshimeri có 6a, 6b còn loài L.seeligeri cho kết quả dương tính với tiếp 1/2b, 4c, 4d, 6b, Un. khoảng 98% các trường hợp nhiểm bệnh listeriosis cho kết quả dương tính với kiểu huyết thanh thuộc nhóm một (1/2a, 1/2b) và nhóm (4b) (Microbiology, Dr Luudongyou, 8/2008). 2.1.2. Hình thái học Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ tiêm mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn. Khi kiểm tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng chúng là vi khuẩn Streptococci. Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể trông giống corynebacteria. Ở nhiệt độ phòng(không lớn 37 0C) vi khuẩn này có khả năng tạo tiêm mao (flagella), di động theo thể thức lộn nhào và tạo hình tán dù trong môi trường motility agar. Hoạt tính tiêu huyết(heamolysis) trên môi trường thạch máu được dùng làm chỉ dấu để phân biệt Listeria monocytogenes trong số các loài khác thuộc giống Listeria spp, nhưng đây không phải là tiêu chí để xác định loài này. Để phân biệt các loại thuộc Listeria spp cần thêm các đặc tính sinh hóa. 3 Bảng 2.1: Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria spp TÊN LOÀI L. monocytogens L. innocua L. ivanovii L. seeligeri L. welshimeri L. grayi loài phụ grayi L. grayi loài phụ murrayi Các phản ứng phân biệt Listeria spp. Cata Gram Di Henry Man động (a) Rham + + + + + + + + + + + + + + + + + + Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh + + V V - + + + - + + + Xanh + V - Xyl Tan huyết CAMP test S.aureus R.equi + + (+) - + (+) - + - - - - V : phản ứng có thể xảy ra (+): phản ứng yếu + : >90% phản ứng dương tính -: phản ứng không xảy ra (a) tham khảo theo USFDA/CFSAN BAM- chương 10. Ghi chú: Cata: catalase, Henry: Henry illumination, Man: manitol, Rham: Rhamnose, Xyl: Xylose. 2.1.3 Đặc điểm sinh lý 2.1.3.1 Thông số phát triển Bảng 2.2: Một số thông số cơ bản của Listeria spp Thế nước pH tối pH cực NaCl(%) (aw) cực đại thiểu đại cực đại 0,92-0,95 4,6 9,6 8-12 T0C tối T0C cực Nhu cầu oxy thiểu đại 0-2 45 Kỵ khí tùy nghi 2.1.3.2 Trong thực phẩm thủy sản. Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm sống, đông lạnh, xông khói, trong các sản phẩm chưa được tiệt trùng.. Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông khói đóng gói chân không được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 100C, trong nhiều trường hợp chúng còn gia tăng số lượng tế bào. Ví dụ: trong tôm, thịt cua, surimi và cá được bảo quản ở nhiệt độ 7 0C trong vòng 14 ngày, Listeria monocytogenes gia tăng đến 10.000 tế bào trên một gam sản phẩm. (Nguồn: Baron’s Medical Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof)). Sự phát triển của chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, pH và các loại thịt cũng như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật. 4 2.1.4 Khả năng chịu đựng Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng phát triển ở nhiệt độ 2 - 80C (nhiệt độ của tủ lạnh), pH tối thiểu là 4,6; chúng có khả năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân không hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic. Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong nguồn nước công cộng ở nhiệt độ 28- 300C và từ 7 đến 110 ngày ở nhiệt độ 5 đến 100C. Ở nước ao chúng có khả năng sống đến 8 tuần với nhiệt độ không khí từ -260C đến 90C. Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3 tuần hoặc lâu hơn nữa. Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ và chủng vi khuẩn này. Trong môi trường chế biến thực phẩm với độ ẩm là 75% và ở 150C, hỗn hợp vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp. Listeria monocytogenes là vi khuẩn điển hình không sinh bào tử có khả năng kháng khá tốt các tác động trong bảo quản thực phẩm như đông lạnh, làm khô và gia nhiệt. 2.1.5 Phân bố, nguồn lây nhiễm Trước đây Listeria được cho là không liên quan đến bệnh ở người và động vật khác nhưng sau này người ta bắt đầu phân lập được nhiều loài thuộc giống Listeria bao gồm cả các loài gây bệnh như Listeria monocytogenes và L. ivanovii từ nhiều nguồn khác nhau. Đến nay vi khuẩn này được công nhận là phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Ít nhất có 42 loài động vật có vú hoang dã và thuần dưỡng, 17 loài chim bao gồm thuần dưỡng và gà chọi là nơi ẩn náo của Listeria. Có khoảng từ 5 – 10% trong số chúng ta có Listeria monocytogenes hiện diện trong đường ruột nhưng không biểu hiện bất cứ triệu chứng nào về bệnh do listeria. Listeria cũng được phân lập từ giáp xác, cá, sò, ve ký sinh và ruồi. Ngoài ra có thể phân lập vi khuẩn này từ đất, thức ăn, phân động vật và các nguồn khác từ môi trường. 2.1.6 Đặc điểm gây bệnh Trong 6 loài Listeria spp thì chỉ có L. ivanovii và L. monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho người và động vật khác. Tuy nhiên chỉ có loài L. monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho người. Bệnh do L. ivanovii và L. seeligeri thì rất hiếm khi xảy ra ở người. 5 Thuật ngữ bệnh do listeria (listeriosis) bao gồm nhiều triệu chứng bệnh giống nhau ở người và động vật. Listeria monocytogenes gây bệnh ở người và động vật; L.ivanovii chỉ gây bênh ở động vật, chủ yếu ở cừu. Bệnh viêm màng não là hình thức bệnh thường gặp nhất ở động vật nhai lại. Ở những động vật còn nhỏ, thường xuất hiện nhiễm trùng nội tạng hoặc nhiễm trùng máu. Nhiễm trùng cổ tử cung ở bào thai qua đường nhau thường làm cừu và gia súc đẻ non. Theo Fs southwick và DL Purich thì cơ chế lây nhiễm của Listeria monocytogenes vào tế bào chủ là dựa vào quá trình thực bào, do đặc điểm sống của chúng là sống nội bào tức là đa số đời sống của tế bào Listeria monocytogenes diễn ra trong tế bào chủ, vi khuẩn sẽ sản xuất ra chất internalins (protein) trên bề mặt tế bào chất này sẽ tăng cường thúc đẩy cho quá trình thực bào, sau khi tấn công vào tế bào chúng tiến hành phân chia và phát triển liên tục trong tế bào chất (tăng gấp đôi trong một giờ) chúng tiến ra ngoại vi màng tế bào chất và tiến hành tiết ra một số chất như là LLO, ACTA phối hợp với internalins A và B hổ trợ cho việc thoát khỏi tế bào, khi đó hình thành các FILOFODS có dạng thuôn và dài để cho các tế bào xung quanh thực bào nhờ đó mà chúng tấn công tiếp vào các tế bào khác do cơ chế này mà Listeriosis hầu hết chỉ xuất hiện ở những người có hệ thống miễn dịch kém như phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và người bị HIV cụ thể: Phụ nử mang thai: có nguy cơ nhiểm Listeriosis cao hơn người bình thường 20 lần. Trẻ sơ sinh, thai nhi có khả năng nhiểm cao nhưng thấp hơn người mẹ Các bệnh nhân liên quan đến phổi và da. Người bị AIDS có nguy cơ nhiễm cao hơn người thường là 300 lần Người sử dụng thuốc cootizon (cortisone). Hình thức bệnh nghiêm trọng thể hiện rõ ràng nhất là ở bệnh viêm màng não và thường đi kèm theo nhiễm trùng máu. Tuy nhiên ở phụ nữ mang thai, mặc dù triệu chứng thường xuất hiện là bệnh giống như cúm nhẹ không bị viêm màng não, nhưng dễ có khả năng thai nhi bị bệnh và dẫn đến phải phá bỏ hoặc sinh non. Ở người bệnh do listeria spp biểu hiện rỏ ràng nhất là do L. monocytogenes thường ít xảy ra, nhưng đã xuất hiện những đợt bùng phát thành dịch. Vào năm 1981, xuất hiện đợt bùng phát liên quan đến 100 người ở Canada. Ba phần tư những trường hợp bị nhiễm bệnh là phụ nữ mang thai, trong trường hợp này có 9 thai nhi bị chết, 23 trẻ sơ sinh bị nhiễm trùng và 2 trẻ còn sống khỏe mạnh. Trong số 77 người trưởng thành không mang bầu bị nhiễm khuẩn 6 đã biểu hiện bệnh do listeria một cách rõ ràng, tỷ lệ chết gần 30%. Nguồn bùng phát là từ xà lách trộn được sản xuất tại một nhà máy tại địa phương. Listeria monocytogenes gây ra một số triệu chứng lâm sàng như nhiễm huyết trùng, nhiễm trùng trọng tâm của xương, khớp, mắt , tủy sống và túi mật, Đối với triệu chứng viêm màng não (hay gọi là hội chứng meningoencephalitis) là biểu hiện rỏ nhất cho việc nhiễm Listeria monocytogenes kèm theo đó là những biểu hiện về run, co giật, cảm cúm... 2.2 Các phương pháp phân tích Listeria monocytogenes trong thực phẩm 2.2.1 Theo ISO 11290 -1:2004 Phương pháp này (tham chiếu theo ISO 11290-1:2004) được áp dụng để định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm dành cho người và thức ăn gia súc. 2.2.1.1 Nguyên lý Phương pháp này thực hiện qua các giai đoạn: Tăng sinh: giai đoạn này là cần thiết vì Listeria monocytogenes thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và dễ bị tổn thương trong quá trình chế biến cùng sự tồn tại một số lượng các loại vi sinh vật khác, do đó bước tăng sinh đầu tiên rất quan trọng làm tăng sự phát triển của vi khuẩn. Phân lập: Mục đích của giai đoạn này nhằm phân biệt vi khuẩn Listeria monocytogenes và các vi khuẩn không phải là Listeria spp thông qua các đặc điểm của khuẩn lạc. Do đó, môi trường phân lập có chứa các thành phần sao cho Listeia spp có thể sinh trưởng tạo thành các khuẩn lạc rời rạc đồng thời ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn không phải là Listeria spp tồn tại được trong giai đoạn tăng sinh. Phân lập trên hai môi trường chọn lọc là ALOA, Oxford (hoặc Palcam). Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc Listeria monocytogenes nghi ngờ sang thạch không chọn lọc để làm thuần vi khuẩn và thực hiện các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa để định danh. Khẳng định là Listeria spp bằng các thử nghiệm Henry-illumination, catalase, nhuộm Gram, khả năng di động phương pháp giọt treo. Sau khi các thử nghiệm trên đều nghiệm đúng Listeria spp, kế tiếp khẳng định Listeria monocytogenes qua các thử nghiệm bổ sung sau: khả năng tan huyết, khả năng biến dưỡng đường, thử nghiệm CAMP, di động trong ống nghiệm tạo hình tán dù. 7 2.2.1.2 Sơ đồ quy trình phân tích theo ISO 11290-1:2004 A.Tăng sinh lần 1 25 g mẫu + 225ml Half Fraser (II) (I) B.Tăng sinh lần 2 0,1ml dịch tăng sinh lần 1 + 10ml Fraser C. Cấy ria trên ALOA + Palcam hoặc Oxford C. Cấy ria trên ALOA + Palcam hoặc Oxford D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB F. Khẳng định G. Đọc kết quả F. Khẳng định: Henry illumination Catalase Gram Tan huyết Khả năng sử dụng đường Xylose, Rhamnose - Thử nghiệm CAMP - Di động - G. Đọc kết quả Hình 2.1 Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Quy trình (I) và (II) thực hiện song song nhau. Nếu quy trình (I) cho kết quả dương tính thì ngưng không tiếp tục thực hiện quy trình (II), nếu quy trình (I) cho âm tính thì phải tiếp tục quy trình (II). Thời gian cho kết quả của phương pháp từ 4- trên 7 ngày. 8 2.2.1.3 Thuyết minh quy trình phân tích A. Tăng sinh lần 1: Cân 25gam mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml Half Fraser. Đồng nhất mẫu trong khoảng 30-60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu. Ủ dịch mẫu trong tủ ủ ở 30 ± 10C trong 24 ± 2giờ. Sau bước tăng sinh lần 1 thực hiện hai quy trình (I), (II). B. Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml từ dịch tăng sinh lần 1 sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường Fraser để tăng sinh lần 2. Ủ ống nghiệm trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. C. Cấy ria trên ALOA, Oxford hoặc Palcam: Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy nhựa vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lần 1 theo quy trình (I) và dịch mẫu tăng sinh lần 2 theo quy trình (II) sang môi trường thạch ALOA và Oxford hoặc Palcam sao cho khuẩn lạc mọc rời, ủ trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford hoặc Palcam. Thường sau 24 giờ ủ phải kiểm tra. Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ tiếp 48 giờ. Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên các loại môi trường thạch. E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ Listeria monocytogenes trên mỗi loại môi trường phân lập dùng que cấy lấy ½ khuẩn lạc cấy ria trên môi trường TSYEA (ủ ở 37 ± 10C trong 1824 ± 2 giờ) và ½ khuẩn lạc còn lại cấy vào TSYEB (ủ ở 25 ± 10C trong 1824 ± 2 giờ). F. Khẳng định Thử nghiệm Henry-illumination Kiểm tra khuẩn lạc Listeria spp bằng nguồn sáng trắng, kiểm tra khuẩn lạc theo hướng vuông gốc với đĩa thạch hoặc trực tiếp bằng mắt thường hoặc qua kính hiển vi phân tích (có gương riêng) hoặc kính hiển vi có độ phân giải thấp. Nguồn sáng chiếu vào đĩa thạch với góc nghiêng 450, quan sát theo hướng vuông góc với đĩa thạch. Trên môi trường TSYEA khuẩn lạc Listeria spp. điển hình qua nguồn ánh sáng trắng có màu xanh óng ánh (xanh xám đến xanh). Thử nghiệm Catalase Thực hiện: Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng sau 18-24 giờ ủ. Chuyển sinh khối lên miếng lam. Nhỏ lên sinh khối một giọt 9 H2O2 3% (dùng ống nhỏ giọt hoặc pipette Pasteur). Quan sát nhanh sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả. Bỏ miếng lam vào dung dịch khử trùng. Kết quả: Dương tính khi có hình thành bọt khí (O2). Âm tính khi không có hình thành bọt khí. Xác định loại Gram (thử nghiệm KOH) Thử nghiệm KOH dùng để phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm: nhỏ 1-2 giọt KOH 3% lên lam kính, sau đó lấy khuẩn lạc đã được làm thuần từ TSYEA trộn vào thuốc thử KOH trên lam. Sau khi trộn nếu gặp hiện tượng đặc quánh kéo thành dây thì dùng khuyên cấy nhích lên là phản ứng dương tính và ngược lại là phản ứng âm tính. Vi khuẩn gram (-): thử nghiệm KOH dương tính Vi khuẩn gram (+): thử nghiệm KOH âm tính Listeria spp cho phản ứng gram (+) Thử tính di động Khả năng di động phương pháp giọt treo: Lấy một khuyên dịch từ TSYEB đặt lên lamem và quan sát dưới kính hiển vi. Listeria spp là những tế bào hình que, mảnh, ngắn và thể hiện những chuyển động xoay quanh trục thân thành từng đợt (luân phiên nghĩ và động) rất đặc trưng. Thử tính di động trong ống nghiệm: Lấy vi khuẩn đã được làm thuần từ TSYEA đâm sâu vào thạch của ống nghiệm chứa môi trường Motility agar. Ủ ở 250C ± 10C trong 48 giờ. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường cấy đâm sâu. Thử nghiệm là dương tính khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm môi trường có màu đỏ cam và tạo hình tán dù. Thử nghiệm tan huyết Dùng que cấy ria lấy sinh khối từ khuẩn lạc trên môi trường làm thuần TSYEA cấy ria lên đĩa thạch Blood Agar. Ủ đĩa trong tủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 2 giờ. Kết quả: Listeria monocytogenes cho thấy vùng sáng, trong và hẹp (dung huyết beta) Thử nghiệm sử sụng đường Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSYEB cấy lần lược sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Xylose và sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Rhamnose. Ủ các ống trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ. 10 Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng. Âm tính khi dung dịch đường không đổi màu. Listeria monocytogenes Xylose (-), Rhamnose (+). Thử nghiệm CAMP Cấy ria 2 đường chủng vi khuẩn S.aureus và Rhodococcus equi theo các đường thẳng đứng song song, cách nhau 4 cm trên mặt thạch máu cừu. Sau đó cấy ria thẳng góc ở giữa các chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes đã được làm thuần từ TSYEA lên thạch máu, gần như không chạm vào 2 đường cấy S.aureus và Rhodococcus equi khoảng 1-2mm. Cấy đồng thời các chủng chứng L.monogenes, L.innocua, L.ivanovi để kiểm tra trên cùng một đĩa. Ủ ở 370C ± 1 0C trong 18- 24h. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết phát triển ngay tại ranh giới giữa chủng cần thử với các chủng R.equi và S.aureus. Phản ứng CAMP (+) với R.equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng 5-10mm và có hình dạng đầu mũi tên, phản ứng (-) vùng tan huyết yếu và nhỏ (khoảng 1mm). Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn. Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và CAMP (-) với R.equi. G. Đọc kết quả: Phát hiện hay không phát hiện Listeria monocytogenes trong 25 gam mẫu. 2.2.2 Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) 2.2.2.1 Lịch sử của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được phát minh bởi tiến sỉ sinh hóa người nhật Kary Mullis, Ông đã được nhận giải Nobel hóa học vào tháng 10 năm 1993 vì thành công trong việc nhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men . Sau này qui trình được cải tiến liên tục và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là sinh học và y học như là ứng dụng cho mục đích phát hiện các bệnh di truyền, chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống… 2.2.2.2 Nguyên lý của kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes. PCR sẻ khuếch đại một đoạn DNA ngắn đặc hiệu cho Listeria monocytogenes đã được xác định từ trước, từ một mẫu ban đầu lên hàng tỷ bản sao nhờ vào các enzyme DNA – polymerase, sau đó các sản phẩm khuếch đại (amplicons) được phát hiện và xác định trên máy điện di gel aragose. 11 Kỹ thuật PCR căn bản gồm có PCR một bước(Fist - PCR) và PCR tổ (Nested PCR), Realtime PCR. Tuy theo điều kiện mục đích yêu cầu của người sử dụng mà có cách lựa chon kỹ thuật PCR nào phù hợp Kỹ thuật Fist PCR (PCR một bước) thì cần ít thời gian hơn để thực hiện và ít nguy cơ bị nhiễm bẩn hơn, tuy nhiên có khuyết điểm là độ nhạy không cao sử dụng cho các trường hợp mẫu nhiễm có nồng độ hiện diện của đối tượng càn nghiên cứu cao Kỹ thuật Nested PCR (PCR tổ) thì cần nhiều thời gian và nguy cơ bị nhiễm bẩn cao hơn nhưng các thao tác có thể thực hiện dưới tia UV để tiệt trùng, Ngoài ra kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn kỹ thuật một bước đến 10 lần và có thể phát hiện mẫu nhiễm có nồng độ loãng Kỹ thuật Real time PCR: Kỹ thuật này phức tạp hơn nhiều so với hai kỹ thuật trên nhưng kỹ thuật này có tính năng vượt trội là phương pháp vừa định tính vừa định lượng. 2.2.2.3 Các giai đoạn chính trong quá trình chạy PCR Khi đưa vào máy luân nhiệt thì sẽ xảy ra các quá trình sau đây Hình 2.2 Chu trình nhiệt trong máy luân nhiệt (Nguồn:Cao Xuân Hiếu, Trương Quốc Phong, chương 18, Cẩm nang sinh học phân tủ, 2006) 12