Tài liệu ứng dụng chế tạo, thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida và streptococcus suis gây ở lợn tại tỉnh bắc giang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––– HOÀNG VĂN MINH ỨNG DỤNG CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM VACCINE ĐA GIÁ NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY Ở LỢN TẠI TỈNH BẮC GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––– HOÀNG VĂN MINH ỨNG DỤNG CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM VACCINE ĐA GIÁ NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY Ở LỢN TẠI TỈNH BẮC GIANG Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, ngày tháng 11 năm 2017 Tác giả Hoàng Văn Minh ii LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành chương trình khoá học với luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Thú y về đề tài “Ứng dụng chế tạo, thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ở lợn tại tỉnh Bắc Giang”. Để hoàn thành khoá học và công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được sự dạy bảo tận tình và định hướng của giảng viên hướng dẫn GS.TS Nguyễn Quang Tuyên; Sự quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi của tập thể giảng viên khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng quản lý Sau đại học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên; Công ty Cổ phần thuốc thú y Đức Hạnh (Marphavet); Ban lãnh đạo và tập thể Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Giang. Nhân dịp này cho phép tôi được trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự giúp đỡ tận tình, quý báu đó. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn hội đồng chấm luận văn đã giúp đỡ và cho phép tôi được bảo vệ bản luận văn này. Tôi xin được cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, người thân và gia đình đã động viên, tạo điều kiện về thời gian, về vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành tốt khoá học. Thái Nguyên, ngày tháng Tác giả Hoàng Văn Minh năm 2017 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN....................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ...........................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................. vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ...............................................................................ix MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tế ............................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn .................................. 3 1.1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae ................................................ 3 1.1.2. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae ....................10 1.2. Vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P. multocida gây ra ...........13 1.2.1. Vi khuẩn P. multocida ................................................................................13 1.2.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P. mutocida .........................................17 1.3. Vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra ..........20 1.3.1. Vi khuẩn S. suis..........................................................................................20 1.3.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra ......................................24 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................ 28 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................................28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................28 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................28 2.1.3. Thời gian nghiên cứu .................................................................................28 2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................28 iv 2.3. Nguyên vật liệu .............................................................................................28 2.3.1. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu phòng viêm phổi ở lợn............................................................................28 2.3.2. Động vật thí nghiệm ...................................................................................29 2.3.3. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm ...................................................................29 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................29 2.4.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn ..................................................29 2.4.2. Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn ..................29 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của đàn lợn sau tiêm phòng vaccin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và S. suis ................................31 2.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................32 2.5.1. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ ...................................................32 2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu ..........................................................................32 Chương 3: KẾT QUẢ GHIÊN CỨU ................................................................33 3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo vaccine thử nghiệm .............................................................................................33 3.1.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được .......................................................................................................33 3.1.2. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ......................................................................................................35 3.1.3. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ...........37 3.2. Kết quả chế tạo vaccine thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn ...............38 3.2.1. Chọn giống vi khuẩn chế tạo vaccine thử nghiệm.......................................38 3.2.2. Kết quả chế tạo vaccine thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn ................39 3.3. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của vaccine thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang ..................................................................................51 3.3.1. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vaccine thử nghiệm .........................51 v 3.3.2. Kết quả xác định hiệu lực của vaccine thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang .............................................................................................................62 KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ ......................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................67 PHỤ LỤC ............................................................................................................75 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADN AGID A. pleuropneumoniae Apx BHI Bp CAMP CFU CPS Cs DNT ELISA H. pleuropneumoniae HIP HLTP IHA LPS LD MR NAD OMPs PBS PCR PPLO P. multocida RR Sta. aureus S. suis TYE TSA TSB VP YE : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Acid Deoxyribonucleic Agargel Immuno Diffuse Actinobaccillus pleuroneumoniae Apx - Toxins Brain Heart Infusion Base pair Chiristie - Atkinson - Munch - Peterson Colony Forming Unit Capsule polysaccharide Cộng sự Dermanecrotic toxin Enzyme - linked Immuno sorbant assay Haemophilus pleuropneumoniae Acid hippuric Hiệu lực tiêm phòng Indirect Haemagglutination test Lypopolysaccaride Lethal dose Methyl red Nicotinamide Adenine Dinucleotide Outer membrane proteins Phosphat buffer solution Polymerase Chain Reaction Pleuropneumonia - like organism Pasteurella multocida Relative Risk Staphylococcus aureus Streptococcus suis Tryptone Yeast Extract Broth Tryptic Soya Agar Tryptone soya broth Voges Prokauer Yeast Extract vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được .......................................................34 Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ......................................................................................36 Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ......37 Bảng 3.4: Các chủng vi khuẩn được chọn để chế tạo vaccine thử nghiệm................39 Bảng 3.5: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng chế tạo vaccine thử nghiệm .............................................................................40 Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng sử dụng chế tạo vaccine thử nghiệm .............................................................................42 Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra vô trùng 3 lô vaccine chế tạo thử nghiệm ................43 Bảng 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn của vaccine thử nghiệm trên chuột bạch .....44 Bảng 3.9: Kết quả xác định hiệu lực của vaccine thử nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn A. pleuropneumoniae ..........................45 Bảng 3.10: Kết quả xác định hiệu lực của vaccine thử nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn P. multocida ...............................46 Bảng 3.11: Kết quả xác định hiệu lực của vaccine thử nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 2 ........................47 Bảng 3.12: Kết quả xác định hiệu lực của vaccine thử nghiệm trên lợn bằng phương pháp công cường độc .............................................................50 Bảng 3.13: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn được tiêm Vaccine thử nghiệm sau một tháng .....................................................53 Bảng 3.14: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn được tiêm Vaccine thử nghiệm sau hai tháng ......................................................54 Bảng 3.15: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm được tiêm vaccine thử nghiệm sau ba tháng .......................................56 viii Bảng 3.16: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm được tiêm Vaccine thử nghiệm sau bốn tháng ....................................58 Bảng 3.17: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm được tiêm Vaccine thử nghiệm sau năm tháng ...................................60 Bảng 3.18: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc viêm phổi ở vùng tiêm và vùng không tiêm Vaccine thử nghiệm .........................................................62 Bảng 3.19: Nguy cơ lợn mắc viêm phổi do không tiêm Vaccine thử nghiệm so sánh giữa nhóm lợn được tiêm và nhóm lợn không tiêm ...............63 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. So sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm được tiêm vaccine thử nghiệm sau ba tháng ..........................57 Hình 3.2. So sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm được tiêm vaccine thử nghiệm sau bốn tháng ........................59 Hình 3.3. So sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm được tiêm vaccine thử nghiệm sau năm tháng .......................61 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn ở tỉnh Bắc Giang nói riêng đã có những bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ trọng đáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa đói giảm nghèo. Tuy nhiên, bệnh dịch ở lợn cũng phát sinh, phát triển, diễn biến đa dạng và phức tạp đã gây nhiều thiệt hại cho các hộ chăn nuôi lợn và làm giảm hiệu quả, thu nhập kinh tế. Trong các bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn hiện nay ngoài các bệnh truyền nhiễm thì bệnh viêm phổi đóng một vai trò quan trọng trong việc gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn ở nước ta. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây chết nhiều lợn tại các địa phương hiện nay, do nhiều căn nguyên gây bệnh và bệnh lại rất đa dạng, triệu chứng bệnh khác nhau. Bệnh Viêm phổi màng phổi của lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (App.) và Pasteurella multocida (P. multocida) gây ra dưới thể viêm phổi đã gây chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn mắc bệnh viêm phổi màng phổi bị chết tại các cơ sở chăn nuôi. Ngoài ra, vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) là một trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng ở lợn, là nguyên nhân gây ra bệnh ở các thể cấp tính như bại huyết, viêm não, viêm màng trong tim, viêm khớp, viêm phổi, thường dẫn đến chết ở lợn, đặc biệt là giai đoạn lợn đã cai sữa và lợn trưởng thành. Vì vậy, việc nghiên cứu, chế tạo vaccine phòng bệnh Viêm phổi màng phổi cho lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, P.multocida và Streptococcus suis gây ra là rất cần thiết nhằm giảm tổn thất cho người chăn nuôi lợn tại nước ta. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu chế tạo vaccin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn và virus gây ra, như vaccine Porcilis phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida typ A, D và Bordetella bronchiseptica , vaccine M+ PAC và vaccin Myco Shield phòng bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae (Hãng Intervet), vaccin đa giá Donoban 10... Vaccine của các hãng sản xuất tiêu thụ ở Việt Nam là vaccin phòng bệnh viêm phổi ở lợn được chế tạo từ chủng vi khuẩn 2 Actinobacillus hoặc Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida,... Kết quả nghiên cứu của Dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà nước đã được nghiệm thu năm 2014 và đưa vào sản xuất của Viện Thú y là vaccie đa giá vô hoạt có bổ trợ phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis (type 2) gây ra. Hiện nay tại Việt Nam chưa có loại vaccine viêm phổi đa giá phòng bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn A.pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis gây ra sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu. Vaccine đa giá nhũ dầu sẽ tăng hiệu lực phòng bệnh, đặc biệt là thời gian miễn dịch được kéo dài hơn nhiều nên việc ứng dụng chế tạo vaccine đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn từ ba loại vi khuẩn trên là vấn đề đòi hỏi cần thiết của sản xuất ngành chăn nuôi lợn hiện nay. Vì vậy, để có cở sở khoa học cho việc nghiên cứu, xây dựng biện pháp phòng bệnh viêm phổi cho lợn bằng vaccine, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng chế tạo, thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ở lợn tại tỉnh Bắc Giang”. 2. Mục tiêu của đề tài - Tuyển chọn chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis sử dụng chế tạo thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn. - Xác định hiệu lực của vaccine đa giá phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis gây ra tại Bắc Giang. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tế 3.1. Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu chế tạo vaccin đa giá nhũ dầu từ các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis phân lập được. - Xác định hiệu lực của vaccin đa giá nhũ dầu lần đầu tiên được nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm trong thực tế là cơ sở khoa học để xây dựng các biện pháp phòng bệnh viêm phổi hiệu quả cho đàn lợn. 3.2. Ý nghĩa thực tế - Sử dụng vaccine đa giá nhũ dầu tiêm phòng cho đàn lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang góp phần giảm tỷ lệ lợn mắc bệnh viêm phổi và tăng hiệu quả, thu nhập cho người chăn nuôi. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn 1.1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 1.1.1.1. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn. A. pleuropneumoniae là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thước khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm. Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô, tuy nhiên một số chủng không có giáp mô cũng đã được quan sát thấy. Dưới kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5-2 x 60-450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, còn loại không có vỏ thì ít tìm thấy hơn. A. pleuropneumoniae là một loại vi khuẩn khó phân lập trên các môi trường thông thường và thường phụ thuộc vào yếu tố V. Do vậy, khi nuôi cấy A. pleuropneumoniae cần các môi trường giàu dinh dưỡng. Trên môi trường thạch máu vi khuẩn không phát triển trên môi trường thạch máu thông thường mà chỉ có thể mọc trên thạch máu đã được bổ sung NAD hoặc có cấy kèm vi khuẩn Sta. aureus. Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc mọc xung quanh đường cấy Sta. aureus với kích thước 0,5-1 mm và hình thành một vùng dung huyết β. Vùng dung huyết này thường được quan sát rõ hơn trên môi trường thạch có bổ sung 5-7 % máu cừu. Ngoài ra, vi khuẩn A. pleuropneumoniae còn gây một vùng dung huyết tăng cường trong vùng dung huyết bán phần, xung quanh đường cấy Sta. aureus có độc tố dung huyết β gọi là hiện tượng CAMP (Kilian, 1976) [50]. Hiện tượng CAMP này liên quan tới sự có mặt của 3 loại độc tố của A. pleuropneumoniae bao gồm ApxI, ApxII và ApxIII. Trên môi trường TSA: Trong thành phần của môi trường này được bổ sung Yearst Extract (YE) và huyết thanh ngựa. Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dưới ánh sáng đèn điện có màu xám xanh. Trên môi trường thạch chocolate: Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhầy, màu trắng xám. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae thuộc biotype 1 4 có thể phân biệt được với H. parasuis bởi khả năng gây dung huyết trên thạch máu khi có Sta. aureus cấy kèm (Kilian, 1976) [50]. 1.1.1.2. Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn A. pleuropneumoniae lên men đường glucose, xylose, mannitol, mannose và không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. Dương tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G; âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey (Trịnh Quang Hiệp và cs, 2004 [6]; Cù Hữu Phú và cs, 2005 [11]; Đặng Xuân Bình và cs, 2007 [2]; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010 [5]). 1.1.1.3.Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ lâu đã được nhiều nghiên cứu xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn và được chia thành 2 biotype chính dựa trên nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Biotype 1 cần có NAD, còn biotype 2 thì không đòi hỏi NAD trong quá trình nuôi cấy, song vẫn cần có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2. Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào. Ở biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen và cs, 1997) [60]. Blackall và cs (2002) [22] đã phát hiện ra serotype 15 thuộc biotype 1 ở 9 chủng vi khuẩn phân lập được tại Australia. 1.1.1.4. Các yếu tố độc lực Nhiều nghiên cứu đã cho thấy độc lực ở các serotype khác nhau của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn được quyết định bởi các ngoại độc tố mà chúng sản sinh ra (Devenish và cs, 1990 [28]; Frey và Bosse, 1993 [36]). Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt, yếu tố bám dính, ngoại độc tố và một vài loại enzym có liên quan cũng đóng vai trò quan trọng đối với độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Hiểu biết về thành phần và cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính, độc lực của vi 5 khuẩn sẽ cung cấp các thông tin quan trọng, là cơ sở khoa học cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh đặc hiệu cũng như chế tạo vaccine phòng bệnh. - Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin): Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn (Devenish và cs, 1990 [28]. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố. Các độc tố này được xếp vào nhóm RTX-toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII (Frey và Bosse, 1993) [36]; Cho và Chae, 2001 [25]). Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae. + ApxII là độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình và có trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey và Nicolet, 1988) [34]. Trước đây ApxII được gọi là HlyII, ClyII hay CytII (Frey và Nicolet, 1990) [35]. Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp và cs, 1994 [49]; Rayamajhi và cs, 2005 [65]). Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tương ứng. Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3. + ApxIII là độc tố không làm tan huyết, nhưng lại là độc tố dung giải tế bào mạnh với trọng lượng phân tử 120 kDa. Trước kia ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) (Rycroft và cs, 1991a [68]; Macdonald và Rycroft, 1992 [54]; Jansen và cs, 1993 [47]). ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng lại gây dung giải mạnh các tế bào khác. ApxIII giống 50% với ApxI và HlyI của vi khuẩn E. coli (Jansen và cs 1993) [47]. Vùng gen điều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen điều hòa (operon) cho apxI (Chang và cs, 1993) [24]. Protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A. pleuropneumoniae (Rayamajhi và cs, 2005) [65]. + ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A. pleuropneumoniae đã được phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA. Gen ApxIVA được phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều đó chứng tỏ nó có tính chất 6 đặc trưng cho loài. Vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ như thế nào trong quá trình gây bệnh hiện chưa được nghiên cứu kỹ, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (Liu và cs, 2009) 53. Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả ba loại độc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII. Một số lượng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một độc tố Apx như serotype 10 sản sinh ApxI, serotype 7 và serotype 12 sản sinh ApxII (Frey và Nicolet, 1990 [35]; Frey và cs, 1993 [36], 1994 [37]). Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi từ mức độ mạnh đến yếu. Sự thay đổi này tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố (Frey và Nicolet, 1990) [35]. A. pleuropneumoniae serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5. Đồng thời tác giả đã làm thí nghiệm gây đột biến các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5 để không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII và sau đó dùng các chủng đã đột biến làm giống gốc sản xuất vaccine cũng cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên. Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5. Thành phần heptose và glucose trong LPS của A. pleuropneumoniae cao hơn so với ở một vài loài vi khuẩn Gram âm khác như E. coli. Jensen và Bertram (1986) [46] đã tìm thấy LPS từ vi khuẩn A. pleuropneumoniae có độc lực cao thuộc serotype 5 có nhiều galactose hơn thể phân lập không độc cùng serotype 5. LPS thành tế bào có ý nghĩa quan trọng trong việc gây ra đáp ứng miễn dịch của vật chủ sau khi A. pleuropneumoniae xâm nhiễm. - Polysaccharide vỏ vi khuẩn (Capsule polysaccharide - CPS): Vi khuẩn A. pleuropneumoniae được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các polysaccharide. Lớp vỏ polysaccharide này tích điện âm và được cấu tạo bởi các đơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các 7 cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer Oligosaccharide gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là một trong những thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân tố quyết định tính đặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward và Inzawa, 1997) [70]. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy. Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có độ dầy từ 80 230 nm tùy thuộc vào các serotype khác nhau. Đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về độ dầy lớp vỏ dẫn đến sự khác nhau về độc lực. Các chủng A. pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng có độc lực có kích thước lớn hơn và có lớp vỏ bám dính dầy hơn so với những chủng ít độc; lớp vỏ của vi khuẩn A. pleuropneumoniae không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và dịch tễ. Các serotype có lớp vỏ dầy có độc lực mạnh hơn so với các serotype có lớp vỏ mỏng (Jensen và Bertram, 1986 [46]; Jacobsen và cs, 1996 44). Điều này cho thấy lớp vỏ vi khuẩn có thể là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến độc lực của các serotype khác nhau. Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có đặc tính chống lại thực bào và được coi là lá chắn chủ yếu của vi khuẩn chống lại hệ thống bảo vệ của vật chủ. Những chủng A. pleuropneumoniae có vỏ bình thường có khả năng kháng lại với hiện tượng tiêu diệt vi khuẩn qua trung gian bổ thể của huyết thanh lợn khi có kháng thể đặc hiệu. Ngược lại, với các chủng A. pleuropneumoniae đột biến thiếu hụt vỏ thì bị tiêu diệt bởi huyết thanh bình thường. Cơ chế mà lớp vỏ vi khuẩn tạo nên sự kháng lại các hoạt tính diệt khuẩn đã được phát hiện, cho thấy thành phần cấu thành lớp vỏ vi khuẩn không ngăn cản hoạt hóa bổ thể hay sự kết dính của C3 (một thành phần của bổ thể) lên vi khuẩn nhưng lại hạn chế lượng kháng thể và sự lắng đọng bổ thể C9 lên bề mặt vi khuẩn trong huyết thanh bình thường. - Các protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OMPs): Protein màng ngoài của A. pleuropneumoniae có trọng lượng phân tử 43 kDa và có thể thay đổi tùy theo hàm lượng NAD cung cấp trong môi trường nuôi cấy. Các protein mang sắt nằm trên màng ngoài, sau đó các đặc tính cùng chuỗi gen của chúng cũng được Gonzalez và cs (1995) [39]; Chung và cs (2007) 27 nghiên 8 cứu xác định. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae sản sinh một vài loại protein màng ngoài (OMPs) và các protein này được cho là có vai trò trong đáp ứng miễn dịch. Hơn nữa, các kháng thể kháng OMPs của A. pleuropneumoniae được chứng minh tác động như một chất opsonin quan trọng chống đại thực bào và bạch cầu đơn nhân. A. pleuropneumoniae có khả năng tổng hợp hai protein mới khi được nuôi trong môi trường thiếu sắt và có các kháng thể chống lại chúng. Hiện tượng xuất hiện các polypeptid này chỉ có được ở trong cơ thể sống. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy có một số receptor transferrin đặc hiệu ở lợn và khả năng phát triển của A. pleuropneumoniae với transferrin vận chuyển sắt. Các phân tích về mặt di truyền các yếu tố mã hóa cho receptor các protein transferrin được nhận dạng bởi hai gen nằm trên một operon. Theo quy định gen tbpB (mã hóa cho protein Tbp2 có khối lượng phân tử dao động từ 59,8 đến 65,5 kDa) và gen tbpA (mã hóa cho protein Tbp1 với trọng lượng chính xác 102,2 kDa). Theo các chứng minh ngược dòng trên operon tbp gợi ý rằng các ion sắt ở môi trường điều khiển gen tbp qua protein Fur (Gerlach và cs, 1992) [38]. - Các protein thu nhận sắt: Khả năng cạnh tranh và hấp thụ sắt được xem là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của A. pleuropneumoniae giúp vi khuẩn tồn tại trong cơ thể vật chủ. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae có thể sử dụng transferrin của vật chủ (Gerlach và cs, 1992) [38] và hemoglobin (Archambault và cs 1999) [19], cũng như sử dụng các loại siderophore khác nhau của nhiều vi sinh vật khác (Diarra và cs, 1996) [30] làm nguồn cung cấp sắt cho sinh trưởng. Các nghiên cứu cũng đã xác định chắc chắn có sự tồn tại của các thụ thể trên bề mặt màng tế bào A. pleuropneumoniae đặc hiệu cho các nguồn thu nhận sắt. Nghiên cứu của Jacques (2004) [45] cho biết vi khuẩn A. pleuropneumoniae có protein gắn kết hemoglobin và các receptor ferric hydroxamate. Chính protein gắn transferrin đã giúp cho A. pleuropneumoniae được cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây nhiễm trùng. - Các yếu tố độc lực khác: Ngoài các yếu tố độc lực chính như trên vi khuẩn A. pleuropneumoniae còn có một số thành phần khác cũng có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học, bao gồm: + Fimbriae là yếu tố bám dính chính lên tế bào niêm mạc đường hô hấp của vật chủ của A. pleuropneumoniae trong quá trình xâm. Dưới kính hiển vi điện tử, fimbriae có đường kính từ 0,5 - 2 nm, dài từ 60 - 450nm. 9 + Ngưng kết tố: Hiện tượng ngưng kết hồng cầu đã được xác định ở một số chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được, tuy nhiên cũng có một số chủng A. pleuropneumoniae không có đặc tính ngưng kết cũng đã được xác định. + HlyX protein: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có chứa gen hlyX (cfp) quy định khả năng dung giải hồng cầu, biểu hiện phản ứng CAMP có mặt ở hầu hết các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được (Macdonald và Rycroft, 1993) [55]. + Protease: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae tiết ra protease có khả năng phân giải gelatin, IgA, IgG và hemoglobin. + Enzym superoxide dismutase (SOD) là một trong những yếu tố độc lực vì nó giúp cho vi khuẩn tồn tại trong suốt quá trình gây nhiễm. Trình tự cấu trúc của enzym này đã được xác định bởi Langford và cs (1996) [51]. + Urease: Hoạt động của urease góp phần vào khả năng gây nhiễm trùng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae trên đường hô hấp của lợn và sau đó làm phát sinh bệnh. Hoạt động urease cũng góp phần gây bệnh do quá trình này cung cấp cho vi khuẩn nguồn nitrogen, từ đó trực tiếp hoặc gián tiếp gây tổn thương tế bào thực bào và tế bào nội mạc của vật chủ. 1.1.1.5. Khả năng đề kháng với kháng sinh Việc sử dụng kháng sinh không cần thiết làm cho A. pleuropneumoniae kháng lại nhiều loại kháng sinh. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae được quyết định bởi thành phần plasmid có trong tế bào vi khuẩn và plasmid này có trọng lượng phân tử thấp (2,3-3,6) x106 dalton. Cơ sở của hiện tượng kháng này với Ampicillin là do vi khuẩn tiết ra men β-lactamase. Những plasmid này không có vật liệu gen để thúc đẩy sự dẫn truyền tới vi khuẩn khác và sự xuất hiện của plasmid này gợi ý về kết quả của một quá trình chọn lọc của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Đặc tính kháng kháng sinh có khả năng truyền bằng plasmid. Ở Việt Nam, Trịnh Quang Hiệp và cs (2004) [6] kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của 29 chủng Actinobacillus phân lập từ trại chăn nuôi lợn tập trung thuộc công ty giống Thái Bình và Hải Phòng đã xác định các loại kháng sinh tác dụng tốt là amikacin (94,95%), amoxicilin (88,89%), rifampicin (83,33%); rồi đến oxacillin và ceftazidine cùng là 77,78%. Sự mẫn cảm với kháng sinh của A. pleuropneumoniae cũng được Cù Hữu Phú và cs (2005) [11] cho biết ít mẫn cảm nhất là kanamycin (45,45%), neomycin (50%), lincomycin (63,64%). Nguyễn Thị