Tài liệu Tổng hợp một số dẫn chất n hydroxybenzamid mang khung 2 oxoindolin hướng kháng tế bào ung thư

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 3 1.1. ACID HYDROXAMIC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CÁC DẪN CHẤT ...................................................................... 3 1.1.1. Histon deacetylase (HDAC)................................................................ 3 1.1.2. Một số đích tác dụng khác của acid hydroxamic ................................ 6 1.2. CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC .................................. 11 1.2.1. Cơ chế tác dụng ................................................................................. 11 1.2.2. Liên quan cấu trúc – tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC.......................................................................................................... 12 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC ACID HYDROXAMIC .............. 15 1.3.1. Tình hình nghiên cứu các acid hydroxamic trên thế giới ................. 16 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc về các acid hydroxamic .............. 18 PHẦN 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21 2.1. HÓA CHẤT, NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................... 21 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................ 22 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 22 2.3.1. Nghiên cứu docking .......................................................................... 22 2.3.2. Tổng hợp các dẫn chất: ..................................................................... 22 2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết các chất tổng hợp đƣợc ................................. 22 2.3.4. Xác định cấu trúc: ............................................................................. 23 2.3.5. Thử hoạt tính sinh học ...................................................................... 23 2.3.6. Đánh giá mối liên quan cấu trúc hóa học, chỉ số lý hóa với hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp đƣợc. ......................................................... 25 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 26 3.1. NGHIÊN CỨU DOCKING ................................................................. 26 3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC ...................................................................... 27 3.2.1. Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)benzamid (IIIa) .......................................................................... 27 3.2.2. Tổng hợp dẫn chất 4-((5-flouro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIIb) ....................................................... 30 3.2.3. Tổng hợp dẫn chất 4-((5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIIc) ....................................................... 31 3.2.4. Tổng hợp dẫn chất 4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIId) ....................................................... 32 3.2.5. Tổng hợp dẫn chất 4-((5-nitro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIIe) ....................................................... 33 3.2.6. Tổng hợp dẫn chất 4-((5-methyl-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIIf) ........................................................ 34 3.2.7. Tổng hợp dẫn chất 4-((5-methoxy-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIIg) ....................................................... 35 3.2.8. Tổng hợp dẫn chất 4-((7-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IIIh) ....................................................... 36 3.3. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT ............................................................ 37 3.4. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ............................................................... 38 3.4.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR ............................................... 38 3.4.2. Kết quả phân tích phổ khối lƣợng MS .............................................. 40 3.4.3. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR ................ 40 3.4.4. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR ............... 42 3.5. HOẠT TÍNH SINH HỌC .................................................................... 44 3.6. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUÔC ............................... 45 PHẦN 4. BÀN LUẬN .................................................................................... 47 4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC ...................................................................... 47 4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ............................................................... 48 4.2.1. Phổ hồng ngoại.................................................................................. 48 4.2.2. Phổ khối lƣợng MS ........................................................................... 49 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ............................................................. 50 4.3. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ........................................................... 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 59 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 65 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) 13 C-NMR : Cộng hƣởng từ hạt nhân 13C (Carbon Nuclear Magnetic Resonance) A431 : Tế bào ung thƣ biểu mô A549 : Tế bào ung thƣ phổi ngƣời CTCL : U tế bào lympho T ở da(Cutaneous T cell lymphoma) DCM : Dicloromethan DMF : Dimethyl formamid EGFR : Thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor) FDA : Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase HepG2 : Tế bào ung thƣ gan HL-60 : Tế bào ung thƣ bạch cầu IC50 : Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MCF-7 : Tế bào ung thƣ vú MeOH : Methanol MMP : Protein chứa kim loại (Metalloproteinase) MS : Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry) SRG : Nhóm nhận diện bề mặt ( Surface RecognitionGroup) T0nc : Nhiệt độ nóng chảy TACE : Enzym chuyển của yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme) TCA : Acid tricloroacetic TCL : Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TNF-α : Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor alpha) TSA : Trichostatin A ZBG : Nhóm kết thúc gắn với Zn2+ (Zinger binding group) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. CTCT chung của các acid hydroxamic. ........................................... 3 Hình 1.2.Mô hình cấu trúc và hoạt động của thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu bì ................................................................................................................ 7 Hình 1.3. Các dẫn chất acid hydroxamic mang khung quinazolin................... 8 Hình 1.4. Các dẫn chất acid hydroxamic khung N-aryl salicylamid................ 8 Hình 1.5. Một số acid hydroxamic ức chế MMP. ............................................ 9 Hình 1.6. Các dẫn chất α,β-cyclic- β-benzamido hydroxamic. ...................... 10 Hình 1.7. Dẫn chất β,β-cyclic-β-benzamido hydroxamic. ............................. 11 Hình 1.8. Vai trò điều khiển chu trình tế bào của các chất ức chế HDAC. ... 12 Hình 1.9. Cấu trúc của các acid hydroxamic ức chế HDAC .......................... 13 Hình 1.10. Mô hình ZBG theo nghiên cứu của Vanommeslaeghe K. ........... 15 Hình 1.11. Các dẫn chất N-hydroxyfurylacrylamid ....................................... 16 Hình 1.12. Dẫn chất N1-((5-bromo-2-thiopheneyl)methyl)-N7-hydroxy-N1-(4methoxyphenyl) heptanediamid ...................................................................... 16 Hình 1.13. Cấu trúc của các chất tƣơng tự SAHA có nhóm thế tại C7. ......... 17 Hình 1.14. Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H. và cộng sự ......... 17 Hình 1.15. Các dẫn chất acid hydroxamic mang khung isatin-3-oxim. ......... 18 Hình 1.16. Cấu trúc của một số dẫn chất hydroxamic với cầu nối propenamid19 Hình 4.1. Phổ khối lƣợng của chất IIIc.......................................................... 49 Hình 4.2. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của dãy chất IIIa-h với SAHA trên dòng tế bào SW620 và PC-3 ........................................................................... 52 Hình 4.3 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của dãy chất với SAHA trên dòng tế bào AsPc-1 và NCI-H23……………………………………………………52 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Tổng hợp một số amid ngƣợc của SAHA. .................................... 19 Sơ đồ 1.2. Tổng hợp acid biaryl hydroxamic. ................................................ 20 Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chung............................................................. 27 Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất IIa........................................................... 27 Sơ đồ 5.3. Quy trình tổng hợp chất IIIa. ........................................................ 28 Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp chất IIIb ......................................................... 30 Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp chất IIIc ......................................................... 31 Sơ đồ 3.8. Quy trình tổng hợp chất IIId ......................................................... 32 Sơ đồ 3.9. Quy tình tổng hợp chất IIIe........................................................... 33 Sơ đồ 3.10. Quy trình tổng hợp chất IIIf........................................................ 34 Sơ đồ 3.11. Quy trình tổng hợp chất IIIg. ...................................................... 35 Sơ đồ 3.12. Quy trình tổng hợp chất IIIh. ...................................................... 36 Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng tổng hợp các dẫn chất IIa-h .............................. 47 Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic................................. 47 Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng tạooxim.............................................................. 48 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả docking của các dẫn chất với HDAC2 ............................. 26 Bảng 3.2. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic ............. 37 Bảng 3.3. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các chất IIIa-h ............ 38 Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IIIa-h ......................... 39 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phố MS của các dẫn chất IIIa-h ....................... 40 Bảng 3.6.Kết quả phổ 1H-NMR của các dẫn chất IIIa-h. .............................. 41 Bảng 3.7.Kết quả phổ 13C-NMR của các dẫn chất IIIa-h. ............................. 43 Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ................................... 45 Bảng 3.9.Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất IIIa-h .................. 46 Bảng 4.1. Kết quả thử tác dụng sinh học của các acid hydroxamic mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin………………………………………. 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ là một căn bệnh ác tính do sự tăng sinh bất thƣờng, vô hạn định, không tuân theo cơ chế kiểm soát của các tế bào và mô trong cơ thể. Tỷ lệ tử vong do ung thƣ chiếm khoảng 15% trong các nguyên nhân gây tử vong ở ngƣời, và tỷ lệ này đang gia tăng trong hầu hết các nƣớc, đặc biệt ở các nƣớc đang phát triển [4]. Trong quá trình tìm kiếm các thuốc chống ung thƣ mới, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc thiết kế các dẫn chất mới với mục tiêu phân tử cụ thể. Một trong những hợp chất nhƣ vậy, thu hút đƣợc nhiều sự chú ý của các nhà khoa học hiện nay là các acid hydroxamic.Năm 2006, dẫn chất acid hydroxamic đầu tiên đƣợc FDA phê duyệt trong điều trị u tế bào lympho T ở da là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®).Tiếp tục thành công này, một số acid hydroxamic ức chế enzym histon deacetylase(HDAC) lần lƣợt đƣợc FDA phê duyệt gồm belinostat (Beleodaq® 2014) điều trị u tế bào lympho T ngoại vi vàpanobinostat (Farydak® 2015) điều trị đa u tủy [8, 30]. Dựa trên các chất dẫn đƣờng này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa dƣợc – Đại học Dƣợc Hà Nội đã thiết kế, tổng hợp, thử tác dụng sinh học của các acid hydroxamic mới với sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt và cầu nối cho tác dụng ức chế HDAC và kháng tế bào u thƣ rất khả quan [17, 34, 35, 36, 37, 38]. Trong đó, sử dụng dị vòng isatin-3-oxim với cầu nối heptamid (thay thế cầu nối octandiamid trong SAHA) thu đƣợc kết quả rất đáng lƣu ý [37]. Mặt khác, một số nghiên cứu cho thấy việc thay đổi cầu nối mạch thẳng của SAHA bằng cầu nối có chứa nhân thơm mang lại hoạt tính kháng ung thƣ cao đồng thời tác dụng ức chế chọn lọc hơn trên HDAC [1, 12, 17, 41, 42]. Trên cơ sở của những nghiên cứu trên, chúng tôi đã thiết kế các dẫn chất acid hydroxamic mang khung isatin-3-oxim với cầunốiphenylvà tiến hành đề tài: "Tổng hợp một số dẫn chất N-hydroxybenzamid mang khung 21 oxoindolin hƣớng kháng tế bào ung thƣ"với mục tiêu: 1. Tổng hợp đƣợc N-hydroxy-4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1yl)methyl)benzamid và một số dẫn chất. 2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các dẫn chất tổng hợp đƣợc. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ACID HYDROXAMIC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CÁC DẪN CHẤT Acid hydroxamic đã đƣợc biết đến từ năm 1869 qua việc phát hiện acid oxalohydroxamic bởi Lossen [15, 20].Tuy nhiên, các nghiên cứu thực sự về cấu trúc và tổng hợp các acid hydroxamic cũng nhƣ hoạt tính sinh học của chúng chỉ đƣợc biết đến từ sau năm 1980.Acid hydroxamic là acid yếu, có khả năng tạo phức với các ion kim loại nặng (Zn2+, Mg2+, Fe3+…) do đó nó đƣợc sử dụng nhƣ nhóm khóa ion kim loại.Từ đó mở ra hƣớng phát triển mới cho các thuốc ức chế các enzym và protein khác nhau chứa kim loại nhƣ histon deacetylase (HDAC), metalloproteinase (MMP), enzym chuyển của yếu tố hoại tử khối u (TCEA)… [41]. Đây đều là những emzym có mối quan hệ mật thiết với các loại ung thƣ khác nhau. Vì vậy, việc thiết kế, tổng hợp các acid hydroxamic đã dƣợc các nhà khoa học rất quan tâm để tìm ra các thuốc mới điều trị ung thƣ. Hình 1.1.CTCT chung của các acid hydroxamic. Dƣới đây là một số mục tiêu phân tử của acid hydroxamic có liên quan mật thiết đến cơ chế bệnh sinh của ung thƣ: 1.1.1. Histon deacetylase (HDAC) Histon deacetylase (HDAC) là enzym rất quan trọng tham gia vào quá trình acetyl hóa (quá trình tháo xoắn nhiễm sắc thể). Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dƣơng lớn, tƣơng tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn 3 nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế sự biểu hiện gen. Ngƣợc lại, khi bị acetyl hóa, điện tích dƣơng bị trung hòa, nhiễm sắc thể đƣợc tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra và đặc tính của gen đƣợc biểu hiện [9, 11, 23].  Phân loại HDAC 1 ở ngƣời là enzym đầu tiên đƣợc xác định bằng cách sử dụng chất ức chế HDAC trapoxin vào năm 1996 [19, 33, 43]. Cho đến nay đã tìm đƣợc 18 loại HDAC khác nhau, đƣợc chia thành 4 nhóm dựa vào tính tƣơng đồng chuỗi, cơ chất đặc hiệu và yếu tố phụ thuộc [33, 43]:  Nhóm I: gồm HDAC 1, 2, 3 và 8; cấu trúc tƣơng đồng với Rpd3 trong nấm men và nằm trong nhân.  Nhóm II: gồm HDAC 4, 5, 6, 7, 9 và 10; cấu trúc tƣơng đồng với Hda1 của nấm men, chia thành 2 phân nhóm: phân nhóm IIa gồm HDAC 4, 5, 7, 9 và phân nhóm IIb gồm HDAC 6 và 10.  Nhóm III: gồm các protein điều hòa chuỗi truyền thông tin: Chất đồng đẳng của Sir2 trong nấm men Saccharomyces cerevisiae.  Sirtuin trong động vật có vú (SIRT 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7). Nhóm IV: HDAC 11, cấu trúc tƣơng đồng với cả nhóm I và II. Nhóm I, II, IV là các HDAC phụ thuộc Zn2+ và còn đƣợc gọi là nhóm các HDAC “kinh điển”. Nhóm III là các HDAC phụ thuộc NAD+ (Nicotinamid Adenin Dinucleotid) và đƣợc gọi là các sirtuin. Các HDAC “kinh điển” bị ức chế bởi các hợp chất có khả năng tạo phức chelat với Zn2+ nhƣ acid hydroxamic, thiol...Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thƣờng sử dụng cho những chất nhằm mục tiêu vào các HDAC kinh điển. Vì vậy các acid hydroxamic có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II, IV. 4  Cấu trúc của HDAC Bằng phƣơng pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của chúng. Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau: + Ion Zn2+: là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng. Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí.Thông thƣờng các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [13, 48]. + Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất. Kênh này có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, đƣợc cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm nhƣ: Phe, Tyr, Pro, His. Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thƣớc để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl. Trên miệng túi có một vành nhỏ đƣợc tạo nên từ một vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC).Đối với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài kênh này là tối ƣu với khoảng 5-6 liên kết carbon [13, 48].  Mối liên quan giữa ung thư và sự hoạt động bất thường của HDAC Hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên mã.Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sự hình thành khối u [2]. Sự thay đổi đuôi N tận của protein histon đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định mức độ xoắn của gen và quá trình biểu hiện gen. Trong số các thay đổi đó, sự acetyl có hồi phục ở gốc lysin đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. HAT acetyl hóa histon làm trung hòa cực dƣơng trên lysin và giúp tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, do đó giúp cho các nhân tố sao mã dễ dàng tiếp cận ADN. Ngƣợc lại, các HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và 5 protein không phải histon, làm tăng sự tích điện dƣơng trên đầu N của histon và đóng xoắn nhiễm sắc thể, kết quả là ức chế quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên ADN. Nhƣ vậy, sự acetyl hóa và deacetyl hóa nhiễm sắc thể đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen. Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thƣờng biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thƣ [3, 25, 48]. HDAC đã đƣợc xác định là rối loạn điều hòa trong ung thƣ. Qua những nghiên cứu về vai trò của HDAC trong ung thƣ, nhiều cơ chế về hoạt động của HDAC đã đƣợc tìm ra. Tuy nhiên phần lớn nghiên cứu tập trung vào sự huy động bất thƣờng của HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích thông qua sự tƣơng tác với protein gắn kết, dẫn tới sự chuyển vị nhiễm sắc thể và tạo ra những khối u ác tính. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã tìm ra đƣợc sự thay đổi của các HDAC nhất định trong một số khối u. Ví dụ, trong carcinom dạ dày, tuyến tiền liệt, đại tràng và vú có sự gia tăng biểu hiện của HDAC1 [25, 33]. Sự gia tăng quá mức HDAC2 cũng đƣợc tìm thấy trong ung thƣ carcinom ở dạ dày, cổ tử cung và đại trực tràng [21, 33]. Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình, kể cả sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch [6, 21]. Nhƣ vậy, ức chế phiên mã đƣợc điều hòa bởi sự gia tăng HDAC và có thể kiểm soát ung thƣ bằng cách ức chế hoạt động của HDAC. Đây chính là một trong những mục tiêu phân tử hấp dẫn cho chiến lƣợc điều trị ung thƣ. Các acid hydroxamic ức chế HDAC đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thƣ. 1.1.2. Một số đích tác dụng khác của acid hydroxamic 6 1.1.2.1. Ức chế thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR/HER2) Thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) là thụ thể trên bề mặt tế bào tiếp nhận tín hiệu từ các yếu tố tăng trƣởng để kích thích tế bào sinh trƣởng, phân chia, biệt hóa… EGFR là thành viên của họ thụ thể ErbB (Erythroblastic B), bao gồm 4 thành viên: EGFR (ErbB-1), HER2/neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) và HER4 (ErbB-4). Protein EGFR gồm 1210 axit amin, có cấu trúc gồm 3 vùng: vùng ngoại bào chứa miền tƣơng tác với yếu tố tăng trƣởng, vùng xuyên màng và vùng nội bào chứa miền kinase có thể phosphoryl hóa tyrosin của protein (nên đƣợc gọi là thụ thể tyrosin kinase). Khi yếu tố tăng trƣởng biểu mô liên kết vào thụ thể, hai phân tử EGFR kết hợp với nhau (dimer hóa), từ đó tự phosphoryl hóa vùng tyrosin kinase, giúp EGFR kết hợp đƣợc với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đƣờng tín hiệu (hình 1.2). Tín hiệu từ EGFR có thể đƣợc truyền qua con đƣờng khác nhau vào nhân để điều khiển tế bào tăng trƣởng, biệt hóa, phân chia, tăng sinh mạch máu, tránh sự tự chết theo chƣơng trình (apoptosis)…[31]. Hình 1.2. Mô hình cấu trúc và hoạt động của thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu bì Ghi chú: (A) Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR). (B) Hoạt động của EGFR. 7 HER2 đƣợc tìm thấy năm 1985 và nhanh chóng trở thành một mục tiếu phân tử hấp dẫn trong nghiên cứu thuốc điều trị ung thƣ. Trong hầu hết các khối u ác tính bao gồm ung thƣ biểu mô vú, buồng trứng, dạ dày, ruột kết và ung thƣ phổi không tế bào nhỏ, HER2 đƣợc biểu hiện quá mức, phổ biến nhất là sự khuyếch đại gen trong các khối u này [3,41]. Năm 2010, Cai và cộng sự [10] đã tiến hành tổng hợp rất nhiều dẫn chất acid hydroxamic mang khung quinazolinức chế cả EGFR/HER2/HDAC (hình 1.3). Trong đó, dẫn chất 2 có tác dụng in vitro đáng chú ý nhất trên cả 3 đích phân tử và tác dụng mạnh hơn trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm nhƣ MCF-7, HCC872, H358, HepG2…so với vorinostat, erlotinib, lapatinib. Hiện nay dẫn chất này đang đƣợc tiến hành thử nghiệm lâm sàng. Hình 1.3. Các dẫn chất acid hydroxamic mang khung quinazolin. Năm 2012, Zuo và cộng sự [49]đã nghiên cứu tác dụng ức chế đồng thời HDAC/EGFR của các dẫn chất acid hydroxamic mang khung N-aryl salicylamid. Kết quả cho thấy chất 3, 4 ức chế rất tốt sự tăng sinh của các tế bào ung thƣA431, A549 và HL-60(hình 1.4). Hình 1.4. Các dẫn chất acid hydroxamic khung N-aryl salicylamid. 8 1.1.2.2. Ức chế các metalloproteinase (MMP) Metalloproteinase (MMP) có thể coi là nhóm lâu đời của protease khi đƣợc tìm thấy vào những năm 1950 trong vi khuẩn, nấm và các tổ chức cao hơn. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, các MMP có liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của khối u, sự tạo mạch và di căn [14]. MMP có cấu trúc và sự liên kết chuỗi khác biệt nhau khá nhiều nhƣng chúng có một điểm chung duy nhất là đều có chứa kẽm ở trung tâm hoạt động.Trong một số trƣờng hợp, kẽm có thể bị thay thế bởi một kim loại khác nhƣ niken hay coban nhƣng vẫn không giảm tác dụng xúc tác. Qua hình thái tinh thể của thermolysin (một loại MMP) của vi khuẩn đã cho thấy rằng ion kẽm gắn kết với một phân tử cystein hoặc acid glutamic và ba phân tử histidin là cần thiết cho hoạt động xúc tác.Do khả năng tạo phức ƣu tiên hơn với ion kẽm nên acid hydroxamic đã đƣợc thiết kế nhiều trong quá trình tìm kiếm các chất ức chế MMP nhƣ marimastat, batimastat, prinomastat. Cả ba chất này đều đã đƣợc tiến hành thử nghiệm lâm sàng pha II, III nhƣng đều bị hủy hoặc do sinh khả dụng quá thấp hoặc độc tính trên bệnh nhân quá nhiều [14, 41]. Hình 1.5. Một số acid hydroxamic ức chế MMP. Becker và cộng sự (2005) [7]đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế MMP của các dẫn chất piperidin sulfon hydroxamat. Kết quả thu đƣợc khá khả quan, trong đó dẫn chất 8 có tác dụng ức chế MMP2, MMP9, MMP13 ở nồng 9 độ nM và tác dụng rất tốt trên các khối u ghép ở chuột. 1.1.2.3. Ức chế enzym chuyển của yếu tố hoại tử khối u (TACE) Yếu tố hoại tử khối-α (TNF-α) là một cytokin hoạt hóa tế bào nội mô mạch máu rất mạnh và tăng tính thấm thành mạch. Hiệu ứng này làm tăng các IgG, bổ thể và tế bào đi vào tổ chức gây viêm cục bộ. Họ TNF-α đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong phản ứng viêm và chết tế bào theo lập trình (apotosis). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trong các tế bào ung thƣ có một lƣợng lớn các TNF-α, lên quan chặt chẽ đến sự phát triển của khối u và cơ chế bệnh sinh của nó [24]. TNF-α đƣợc sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào, sau đó đi vào máu rồi đến các mô và cơ quan khác, TNF-α còn đƣợc tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên (NK), tế bào u hắc tố và một vài dòng tế bào ung thƣ. Tuy nhiên, TNF-α chỉ hoạt động đƣợc khi có enzym chuyển TACE từ dạng pro-TNF-α thành dạng hoạt động TNF-α. TACE là một protein chứa kim loại, có mối quan hệ mật thiết với MMP. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các chất ức chế TACE rất có tiềm năng để phát triển thành thuốc điều trị ung thƣ [16, 24, 39]. Năm 2008, Ott và cộng sự [39] đã công bố trên tạp chí Bioorganic Medicine Chemistry Letter hoạt tính ức chế TACE của các dẫn chất α,βcyclic- β-benzamido hydroxamic, cho thấy kết quả rất tốt. Trong đó, dẫn chất 9a, 9bcó IC50<1nM. Cũng trong năm này, Ott cũng đã tổng hợp các dẫn chất oxaspiro[4,4]nonan b-benzamido hydroxamic 10a, 10bcó tác dụng ức chế TACE khá mạnh (hình 1.6). Hình 1.6. Các dẫn chấtα,β-cyclic- β-benzamido hydroxamic. 10 Năm 2008, Duan và cộng sự [16] đã tiến hành tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế TACE trên 26 dẫn chất β,β-cyclic-β-benzamido hydroxamic. Kết quả cho thấy chất 11 có tác dụng ức chế TACE mạnh với IC50 = 0,15 nM và sinh khả dụng đƣờng uống in vitrocũng rất khả quan (hình 1.7). Hình 1.7. Dẫn chất β,β-cyclic-β-benzamido hydroxamic. 1.2.CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC Có nhiều nhóm chất ức chế HDAC nhƣng các acid hydroxamic đƣợc nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng nhiều hơn cả do công thức đơn giản, khả năng ức chế mạnh và chọn lọc các HDAC. 1.2.1.Cơ chế tác dụng Nhƣ các nhóm chất ức chế HDAC khác, các acid hydroxamic tác động lên tế bào ung thƣ theo ba cơ chế chủ yếu [22]: - Các chất ức chế HDAC gián tiếp gây ra sự chết tế bào theo chƣơng trình (apotosis): Các chất ức chế HDAC tác động lên những tế bào bình thƣờng và tế bào ung thƣ với cùng mức độ gây ra G2 checkpoint (vị trí mà tại đó chu trình tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tục). Những tế bào bình thƣờng trải qua G2 checkpoint và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thƣ tái tạo ADN tạo thành dạng4nADN và chuyển sang giai đoạn gây chết tế bào theo chƣơng trình. - Sự biệt hóa gây ra bởi các chất ức chế HDAC: Các chất ức chế HDAC tác động lên các tế bào ung thƣ gây ra sự ngừng tế bào ở pha G1, kết quả là 11