Tài liệu Tối ưu sản lượng lipase pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận plackett burman và rsm ccd, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được

Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ----------------------------- BÙI HỒNG QUÂN Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60. 42. 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2008 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Đức Lượng ----------------------------------Cán bộ chấm nhận xét 1: ....................................................... ----------------------------------Cán bộ chấm nhận xét 2: ....................................................... ----------------------------------Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày . . . . . tháng. . . …năm. . . . . . TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp. Hồ Chí Minh, ngày………tháng…….năm……… NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Bùi Hồng Quân Ngày, tháng, năm sinh: 14/09/1980 Phái: Nam Nơi sinh: Nam Định Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106680 I- TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu được. II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và RSM-CCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt. Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala. 2. Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc các yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase. 3. Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm và phương pháp bề mặt đáp ứng để xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại. 4. Thu nhận sinh khối nấm men. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh. 5. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala. 6. Bổ sung lipase thu được vào một số bột giặt trên thị trường III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 01/2008 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11/2008 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH Nội dung và đề cương luận văn thạc sỹ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua. Tháng 01 năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ĐT-SĐH TRƯỞNG KHOA QL CHUYÊN NGÀNH Xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng người đã đưa ra phương hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Xin gửi lời tri ân đối với Cha mẹ và gia đình đã nuôi dưỡng con và là chỗ dựa cho con trong suốt cuộc đời này. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS. Nguyễn Tiến Thắng, Cô TS. Nguyễn Thúy Hương và các thầy cô khác đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý báu trong quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn Công nghệ sinh học. Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Quyền Đình Thi, TS. Ching Tsing Hou đã có những trao đổi, góp ý quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Xin chân thành cảm ơn các Cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Ông Nguyễn Văn Thái, giám đốc Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương II cùng các bạn đồng nghiệp của trung tâm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện một số thí nghiệm tại trung tâm. Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tôi học tập, trao đổi, động viên và có những trợ giúp cần thiết, đúng lúc cho tôi. Bùi Hồng Quân Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và RSM-CCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt. Thực hiện các phương pháp kiểm tra theo Kurtzman và Fell (1999); Dũng và Lương (2006), chúng tôi đã xác định được đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala. Chủng nấm men có khả năng lên men đường sucrose, glucose, không có khả năng lên men lactose, đồng hoá nhiều nguồn cacbon (sucrose, maltose, tinh bột, glycerol, D-manitol, citrate, lipid) và đồng hoá nitrate. Nấm men phát triển tối ưu ở pH 9,0; nhiệt độ 25oC; giai đoạn phát triển cần nhu cầu ôxy cao. Nấm men Pichia anomala đã được tối ưu hoá quá trình nuôi cấy nhằm thu được sản lượng lipase cực đại. P.anomala có khả năng sinh tổng hợp lipase ở pH tối ưu 9,0. Chúng tôi đã sử dụng thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman để kiểm tra mức độ ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá khác nhau lên sản lượng lipase. Trong đó, chiết nấm men, tỷ lệ giống và dầu ăn là ba yếu tố có tác động mạnh nhất. Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)- phương án cấu trúc có tâm (CCD) đã được thực hiện và tìm ra giá trị tối ưu của ba yếu tố chiết nấm men (3,0%), tỷ lệ giống (2,37%; 108 tế bào/mL) và dầu ăn (4,19%) cho sản lượng lipase cực đại theo mô hình 18,8078 (U/mL). Mô hình đã được áp dụng vào thực tế với kết quả 100mL nuôi cấy lắc là 18,95 (U/mL) và 3,0L trong fermentor tự động là 22,52(U/mL). Đã thu nhận được 9,5g sinh khối nấm men ướt /100mL dịch nuôi cấy. Sau khi lên men fermentor, chúng tôi đã thu nhận 4,32g tủa protein thô (chứa enzym) từ 2L dịch nuôi cấy khi kết tủa bằng cồn lạnh. Đồng thời, chúng tôi cũng đã nghiên cứu một vài đặc điểm lipase P.anomala: pH hoạt động thích hợp 9,0; nhiệt độ hoạt động thích hợ 25oC, các ion kim loại không gia tăng hoạt tính mà làm giảm hoạt tính của lipase (Li+ K+ Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+ Al3+ Fe3+); EDTA và muối mật cũng làm giảm hoạt tính của lipase này. Với lipase thô thu được, chúng tôi đã bổ sung vào bột giặt Omo, Surf (Sản phẩm của Unilever Việt Nam), Only (Công ty CP Bột giặt Lix). Kết quả hoạt tính lipase giảm mạnh ngay sau khi trộn Omo (35%), Surf (41%), Only (62%). Sau 24 giờ hoạt tính bị mất hoàn toàn. Từ khoá: Pichia anomala, Lipase, Plackett –Burman, RSM-CCD, fermentor The design experiments follow Plackett – Burman matrix and Central Composite Designs - Response surface methodology to optimal lipase yield by Pichia anomala and research properties of lipase Summary The aim of the present research is design experiments following PlackettBurman matrix and RSM-CCD to highest level lipase yield and apply to detergent power. We tested yeast following Kurtzman and Fell (1999); Dung and Luong (2006) to determined property phisical and biochemical of the strain. The strain could fermentation sucrose, glucose; couldn’t fermentation lactose; could assimilate many carbon sources (sucrose, maltose, starch soluble, glycerol, Dmanitol, citrate, lipid) and N source nitrate. The yeast strain could growth at optimum pH pH 9.0; at 25oC. The growth stage needed oxygen at high level. Yeast Pichia anomala was optimized culture process for maximum lipase production. The pH optimum for this secretion is 9.0; this lipase of great promise can act very well at alkaline pH (pH>9) and be applied in detergent industry. We use the design of optimum multifactorial experiments Plackett – Burman to estimate level effect of physical and chemical factors on lipase yield. As the result, Yeast (%), inoculum’s size (%) and vegetable oil (%) were identified as significant factors. After screening, these factors were subsequently optimized using the response surface methodology (RSM) - Central Composite Designs (CCD). These optimal levels were found out yeast extract (3.0%), inoculum’s size (2.37%; 108 cells mL-1) and vegetable oil (4.19%) in which the lipase yield is highest. The regression equations (model) obtained and predicted maximum lipase yield 18.8078 (U/mL). We also verify model in shake- flasks (100mL) as well as automatic fermentor (3.0L). Lipase production yields were recorded from supernatant is 18.95 (U/mL) and 22.52 (U/mL), respectively. We also take in 9.5g yeast biomass from 100mL supernatant culture. Two liter supernatant culture after fermentation was precipitated by cool ethanol and result 4.32g crude protein. Simultaneous, we studied some properties of lipase P.anomala: optimum acitive pH 9.0; optimum active temperature 25oC, metals ionic not enhance activity that decrease activity of lipase (Li+ K+ Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+ Al3+ Fe3+); EDTA and bile salt also decrease lipase activity. Crude lipase was mix with soap powder as Omo, Surf (Products of Unilever Viet Nam), Only (Lix Joint stock Company). Result as lipase activity strongly drop as soon as mixture Omo (35%), Surf (41%), Only (62%). After 24h, activity lost all. Key words: Pichia anomala, lipase, Plackett – Burman, Response surface methodology (RSM)- Central composite designs (CCD), fermentor Trang 1 Mục lục Mục lục.............................................................................................................1 Danh mục các hình..........................................................................................4 Danh mục các đồ thị .......................................................................................4 Danh mục các bảng .........................................................................................4 Chương 1..........................................................................................................4 1. Đặt vấn đề.................................................................................................6 Chương 2..........................................................................................................8 2. Tổng quan các nghiên cứu liên quan .....................................................8 2.1. Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala .............................................8 2.2. Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men ...................................................12 2.2.1. Nguồn gốc và ứng dụng lipase nấm men.............................................12 2.2.2. Tinh sạch protein và các thuộc tính hoá sinh.......................................16 2.2.2.1. Lipase từ nấm men Pichia .................................................................16 2.2.2.2. Lipase từ các nấm men khác..............................................................17 2.2.3. Tạo dòng gen .......................................................................................24 2.2.3.1. Nấm men Pichia.................................................................................24 2.2.3.2. Các nấm men khác.............................................................................24 2.3. Nghiên cứu lipase các vi sinh vật khác....................................................29 2.4. Ứng dụng của lipase vi sinh vật...............................................................33 2.4.1. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thực phẩm.................................34 2.4.2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa.......................................35 2.4.3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy ....................35 2.4.4. Ứng dụng lipase trong quản lý môi trường........................................36 2.4.5. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất ....................................36 2.4.6. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế ....................................37 2.4.7. Ứng dụng lipase trong nông dược .....................................................38 2.4.8. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa ..............39 2.4.9. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel .........................................39 Chương 3........................................................................................................42 3. Vật liệu và phương pháp.......................................................................42 3.1. Chủng vi sinh vật ....................................................................................42 Trang 2 3.2. Thiết bị - Hoá chất môi trường................................................................42 3.3. Phương pháp xác định lipase...................................................................42 3.3.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................42 3.3.2. Định tính lipase P.anomala bằng phương pháp đục lỗ........................45 3.3.3. Định lượng hoạt tính lipase bằng phương pháp chuẩn độ liên tục ......46 3.4. Xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của chủng nấm men P.anomala ....47 3.4.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................47 3.4.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................48 3.5. Sàng lọc các yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman...............51 3.5.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................51 3.5.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................55 3.6. Tối ưu giá trị của ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương pháp bề mặt đáp ứng................................................................................57 3.6.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................57 3.6.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................59 3.7. Thử nghiệm mô hình tối ưu ở điều kiện nuôi cấy lắc 100mL và fermentor 3,0L .........................................................................................61 3.8. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh. ..................61 3.9. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala. ............................61 3.9.1. pH hoạt động tối ưu ...........................................................................61 3.9.2. Nhiệt độ hoạt động tối ưu ..................................................................62 3.9.3. Khả năng bền với nhiệt của enzym ...................................................63 3.9.4. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất kìm hãm ............................63 3.10. Bổ sung lipase vào bột giặt..................................................................64 3.10.1. Cơ sở lý thuyết ....................................................................................64 3.10.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................67 Chương 4........................................................................................................70 4. Kết quả và bàn luận ..............................................................................70 4.1. Kết quả xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của chúng nấm men P.anomala và một số yếu tố ảnh hưởng ..................................................70 4.1.1. Kết quả đặc điểm sinh lý, sinh hoá của P.anomala .............................70 Trang 3 4.1.2. Kết quả ảnh hưởng giá trị pH khác nhau lên khả năng phát triển của P.anomala ..........................................................................................73 4.1.3. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên khảnăng phát triển của P.anomala................................................................................................74 4.2. Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman...76 4.3. Kết quả tối ưu giá trị của ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương pháp bề mặt đáp ứng ..................................................................78 4.4. Thử nghiệm mô hình tối ưu ở điều kiện nuôi cấy lắc 100mL và fermentor 3,0L..........................................................................................................80 4.5. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh....................82 4.6. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala...............................83 4.6.1. Kết quả xác định giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzym .......83 4.6.2. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym................84 4.6.3. Kết quả xác định độ bền của enzym với nhiệt độ................................86 4.6.4. Kết quả xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại, EDTA, muối mật lên hoạt tính của enzym ...............................................................87 4.7. Kết quả bổ sung lipase vào bột giặt .........................................................88 Chương 5........................................................................................................90 5. Kết luận và kiến nghị ............................................................................90 5.1. Kết luận ...................................................................................................90 5.2. Kiến nghị .................................................................................................90 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................91 PHỤ LỤC 1 ................................................................................................pL 1 PHỤ LỤC 2 ................................................................................................pL 4 PHỤ LỤC 3 ................................................................................................pL 5 PHỤ LỤC 4 ................................................................................................pL 6 PHỤ LỤC 5 ................................................................................................pL 7 Trang 4 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Mô hình hoá thiết kế có tâm tổng quát cho hai yếu tố và ba dạng CCD.......................................................................................... 58 Hình 4.1. Hình dạng tế bào, cách thức nảy chồi của P.anomala.......................... 70 Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc P.anomala trên môi trường Sabouraund 2% glucose sau 48 giờ nuôi cấy .................................... 71 Hình 4.3. Khả năng phân giải lipid trên môi trường chiết nấm men – nhũ tương dầu ăn............................................................................... 72 Hình 4.4. Khả năng phát triển của P.anomala trên Sabouraund 2% glucose ở pH 8,9,10................................................................................................. 74 Hình 4.5. Kết quả nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzym trên thạch đĩa................ 85 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Đường cong tăng trưởng của P.anomala trên Sabouraund 2% glucose .................................................................................... 73 Đồ thị 4.2. Kết ảnh hưởng giá trị pH khác nhau lên khả năng phát triển của P.anomala .................................................................................... 73 Đồ thị 4.3. Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và dầu ăn .................. 80 Đồ thị 4.4. Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và chiết nấm men ..... 80 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase .................................................. 13 Bảng 2.2. Tính đặc hiệu cơ chất của lipase một số dòng Pichia .......................... 16 Bảng 2.3. Lipase tự do và lipase cố định dùng trong sản xuất biodiesel .............. 41 Bảng 3.1. Tóm tắt một số phương pháp xác định hoạt tính lipase........................ 43 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tween kết hợp với chất nhiễm sắc và các hệ thống cơ chất khác trong xác định hoạt tính lipase .......................................... 46 Bảng 3.3. Các chỉ tiêu kiểm tra sinh hoá P.anomala............................................ 49 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp ................... 50 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm xác định giá trị nhiệt độ phát triển thích hợp ........... 50 Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp ................... 51 Bảng 3.7. Các mức của 11 yếu tố trong thiết kế Plackett-Burman....................... 55 Bảng 3.8. Mã hoá thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman.................. 57 Bảng 3.9. Giá trị Các điểm sao α trong thiết kế CCD .......................................... 59 Trang 5 Bảng 3.10. Nồng độ ba yếu tố dùng trong RSM –CCD ....................................... 60 Bảng 3.11. Mã hoá thiết kế thí nghiệm theo CCD................................................ 60 Bảng 3.12. Thành phần của chất tẩy có enzym .................................................... 65 Bảng 3.13. Thành phần chất tẩy có chứa enzym lipase và protease công thức 1........................................................................................ 66 Bảng 3.13. Thành phần chất tẩy có chứa enzym lipase và protease công thức 2........................................................................................ 67 Bảng 3.14. Thành phần bột giặt Surf (một sản phẩm của Unilever Việt nam)..... 67 Bảng 3.15. Thành phần bột giặt Only (Công ty CP Bột giặt Lix) ........................ 68 Bảng 3.16. Thành phần bột giặt Omo (một sản phẩm của Unilever Việt nam).... 69 Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra hình thái và sinh sản của P.anomala ........................ 70 Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của nấm men P.anomala .............. 71 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng phát triển của P.anomala......... 74 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của độ thông khí lên khả năng phát triển của P.anomala................................................................................... 75 Bảng 4.5. Kết quả thực nghiệm và suy đoán ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ............................................................ 76 Bảng 4.6. Mức độ ảnh hưởng của cá yếu tố lên sản lượng lipase......................... 77 Bảng 4.7. Kết quả thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hoá sản lượng lipase..... ........................................................................................................... 78 Bảng 4.8. Sản lượng lipase, sinh khối P.anomala ghi nhận được từ 100mL, 3,0L môi trường tối ưu .............................................................................. 81 Bảng 4.9. Kết quả thu nhận enzym thô................................................................. 82 Bảng 4.10. Hoạt tính lipase ở các giá trị pH khác nhau........................................ 84 Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra độ bền của enzym ở các nhiệt độ khác nhau........... 86 Bảng 4.12. Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế lên hoạt tính lipase P.anomala ......................................................................................... 87 Bảng 4.13. Kết quả bổ sung lipase thô vào bột giặt.............................................. 88 Trang 6 1. Đặt vấn đề Mối quan tâm cũng như việc sử dụng enzym lipase trong các ngành công nghiệp đã gia tăng trong những năm gần đây. Việc ứng dụng lipase gia tăng đồng thời với những phát hiện ứng dụng lipase trong các lĩnh vực mới làm gia tăng nhu cầu lipase. Thị phần enzym lipase trên thị trường thế giới ngày càng gia tăng. Trong đó, lipase từ các vi sinh vật có một ý nghĩa vô cùng quan trọng trong các ngành công nghiệp công nghệ sinh học hiện nay. Lipase vi sinh vật đang được ứng dụng trong các lĩnh vực như: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da, công nghiệp tẩy rửa, sản xuất biodiesel, sản xuất các polymer phân huỷ sinh học, y học ứng dụng, công nghiệp giấy và chế tạo các biosensor. Trên thế giới, nghiên cứu về enzym lipase vi sinh vật đã đạt được những thành tựu đáng kể. Nghiên cứu lipase vi sinh vật tập trung vào vi khuẩn (Pseudomonas spp., Bacillus spp....); nấm mốc (Aspergillus spp., Rhizopus spp.,...); nấm men (Candida spp., Geochitrum spp., Yarrowia spp.,…). Ở Việt Nam, sản xuất enzym ở quy mô công nghiệp còn hạn chế. Đã có nghiên cứu enzym lipase nhưng còn hạn chế, cho đến tháng 11/2008 chỉ dưới 20 công bố chủ yếu của nhóm tác giả Q.Đ. Thi và cs., việc tìm kiếm nguồn lipase mới có khả năng chịu kiềm, chịu acid, chịu nhiệt vẫn là một chủ đề thu hút sự chú ý của các nhà khoa học. Pichia anomala có thể phát triển dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH thấp và pH cao, môi trường có hoạt tính nước thấp, điều kiện áp suất thẩm thấu cao và điều kiện yếm khí. Nấm men P.anomala đã được nghiên cứu sâu về sinh tổng hợp ethyl acetate, độc tố giết, hệ enzym (phytase, amylase, invertase,...), khả năng kháng nấm và điều khiển sinh học trong quá trình bảo quản ngũ cốc. Lipase P.anomala chưa được nghiên cứu nhiều như các lipase từ nấm men khác như Candida rugosa. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu phân lập P.anomala từ bánh men rượu đăng trên các tạp chí quốc tế (Thanh và cs., 2008; Dung và cs., 2007). Tối ưu hoá quá trình lên men để xây dựng mô hình nhằm thu được sản lượng lớn và gia tăng quy mô sản xuất có một ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng những nghiên cứu cơ bản vào trong công nghiệp. Bất cứ một quá trình lên men nào cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý cũng như sinh hoá học khác nhau. Bước đầu tiên để tối ưu hoá là sàng lọc các yếu tố quan trọng sau. Một cách đơn giản và thuận tiện là tối ưu từng yếu tố trong khi giữ nguyên các yếu tố khác. Cách thực hiện này tốn Trang 7 thời gian và không xác định được sự tác động qua lại của các yếu tố. Thiết kế thí nghiệm tối ưu đa yếu tố theo Plackett – Burman đã được áp dụng hiệu quả, chi phí thấp, cho phép nghiên cứu sự tương tác và đồng thời tiên đoán được phạm vi của các yếu tố. Sau đó, thí nghiệm tối ưu theo phương pháp RSM–CCD1 được dùng để xác định giá trị tối ưu các yếu tố đang được nghiên cứu. Từ chủng P.anomala mua từ Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam IMBT – VNU có hoạt tính lipase, chúng tôi đã dùng chủng nấm men này để thực hiện đề tài: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu được. Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và RSMCCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt. Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala. 2. Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc các yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase. 3. Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm và phương pháp bề mặt đáp ứng để xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại. 4. Thu nhận sinh khối nấm men. 5. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh. 6. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala. 7. Bổ sung lipase thu được vào một số bột giặt trên thị trường 1 RSM-CCD: Response surface methodology- Central composite designs: phương pháp bề mặt đáp ứng – các thiết kế cấu trúc có tâm Trang 8 2. Tổng quan các nghiên cứu liên quan 2.1. Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala Nấm men P.anomala (E.C. Hansen) Kurtzman đã được phân lập ở ổ khu trú tự nhiên và nhân tạo (Kurtzman, 1999). Nó thường được tìm thấy trong nước uống và thực phẩm lên men tự nhiên (Masoud và cs., 2004; Sujaya và cs., 2004) và thuộc về nhóm non-Saccharomyces trong rượu vang (Rojas và cs., 2003). P.anomala có thể phát triển dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH thấp và pH cao, hoạt tính nước thấp, điều kiện áp suất thẩm thấu cao và điều kiện yếm khí (Fredlund và cs., 2002). Nhờ vào các đặc tính này, nấm men này có thể gây hư hỏng những thực phẩm có độ đường cao (Tokuoka và cs., 1985; Lanciotti và cs., 1998). P.anomala cũng được tìm thấy trong lâm sàng và được coi như vi sinh vật nhiễm trùng cơ hội (Hazen, 1995). Mặc dù có thể phát triển trong khoảng pH rộng và áp suất thẩm thấu cao, nhưng P.anomala lại không có khả năng kháng ethanol và acetate (Kalathenos và cs., 1995; Fredlund và cs., 2002). P.anomala có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm mốc khác nhau và đem lại khả năng điều khiển sinh học nấm mốc trên cây nho và quá trình bảo quản sau thu hoạch của táo và ngũ cốc (Jijakli và Lepoivre, 1998; Petersson và Schnurer, 1998; Masih và cs., 2000; Druvefors và cs., 2002). Sinh lý học và di truyền của P.anomala còn ít được nghiên cứu. Báo cáo đầu tiên về các đặc điểm sinh lý, di truyền, thao tác di truyền của P.anomala, đã được công bố (Grevesse và cs., 2003; Naumov và cs., 2001; Fredlund và cs., 2004). P.anomala (tên cũ Hansenula anomala; đồng hình dạng với Candida pelliculosa Redaelli, một số tên đồng nghĩa và các đặc điểm khác [phụ lục 1]) thuộc nhóm nấm men bào tử túi, hình thành từ 1 đến 4 bào tử có dạng mũ (Wickerham và Burton, 1954; Dũng và cs., 2006). Nó được phân lập và miêu tả lần đầu tiên bởi Hansen vào năm 1894; Hansen đặt tên là Saccharomyces anomalusi Hansen. Sau đó, Hansen phân loại lại và chuyển S.anomalus Hansen cùng với S.saturnus Klocker thành một giống nấm men Willia mới. Tuy nhiên, năm 1919, Sydow đã xếp toàn bộ các loài trong giống Willia thành một giống Hansenula mới. Giống Hansenula và Pichia lúc đầu được chia theo khả năng đồng hóa nitrate như là nguồn nitơ duy nhất. Tuy nhiên, sự khác nhau về khả năng đồng hoá nitrate không đủ để sắp xếp vào hai giống. Các loài của giống Hansenula tạo bào tử hình mũ được phân loại lại thành giống Pichia (Kurtzman, 1984). Sự phân loại lại hiện nay đã được chấp nhận rộng Trang 9 rãi, tuy nhiên, nhiều báo cáo vẫn đề nghị dùng H. anomala và đề nghị phục hồi lại tên Hansenula (Yamada và cs., 1994; Naumov và cs., 2001). Sự đề nghị này dựa trên sự nghiên cứu phát sinh loài của 500 nấm men bào tử túi, trong đó hầu hết các nấm men trong giống Hansenula (bao gồm cả P.anomala) hình thành một nhánh phát sinh (Kurtzman và Robnett, 1998). Hiện nay, trên thế giới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu về di truyền của P.anomala. P.anomala phân lập từ tự nhiên thường ở dạng nhị bội (Naumov và cs., 2001). Naumov và cs. (2001) chỉ ra khả năng hình thành giới tính và bào tử hoá giữa các dòng P.anomala khác nhau. Akira (1970) cho rằng số lượng nhiễm sắc thể (NST) của H.anomala là 2n=4. Tuy nhiên, Naumov và cs. (2001) đã xác định rằng số lượng NST của P.anomala khoảng 9–12 NST với kích thước từ 850 đến 3500kb. Tương tự như các loài khác (Scherer và Magee, 1990; Passoth và cs., 1992; Bai và cs., 2000), nhiễm sắc thể của các dòng P.anomala thể hiện tính đồng hình cao (Aragao và cs., 2001; Naumov và cs., 2001; Zagorc và cs., 2001; Recek và cs., 2002). Nhiều gen của P.anomala đã được tạo dòng và được phân tích. Ogata và cs. (1995) lần đầu tiên mô tả hệ thống biến nạp trên cơ sở của dòng đơn bội ura3 phân lập từ quá trình xử lý nước thải. Hệ thống biến nạp khác được phát triển bởi Grevesse và cs. (2003) cũng dựa trên cơ sở tính tương đồng của đột biến ura3. Hoạt tính của độc tố giết được thể hiện trong nhiều dòng P.anomala (Fredlund và cs., 2002). Các độc tố khác nhau sẽ khác nhau đáng kể về hoạt tính, đặc tính phân tử, trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, pH và nhiệt độ tối ưu, mức độ glycosyl hóa và điểm đẳng điện. Độc tố chịu nhiệt duy trì hoạt tính sau 5 giờ ủ ở 60oC và chỉ mất hoạt tính ở 100oC/25 phút. P.anomala sản xuất ethanol trong môi trường hạn chế nguồn ôxy, trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí hoàn toàn chỉ một ít ethanol được tạo thành. Acetate đuợc sản xuất trong quá trình hô hấp nhưng không sản xuất dưới điều kiện thiếu ôxy (Fredlund và cs., 2004). P.anomala sản xuất một lượng nhỏ các hợp chất bay hơi, trong đó phần lớn là ethyl acetate và các hợp chất khác như: ethyl propanoate, phenyl ethanol và 2-phenylethyl acetate (Westall, 1999). Các con đường chuyển hóa này chịu tránh nhiệm tổng hợp các ester ở P.anomala có sự khác biệt so với ở Saccharomyces cerevisiae. Ở S.cerevisiae, ethyl acetate được tạo ra từ acetyl- Trang 10 coenzyme A và ethanol bằng phản ứng của enzym alcohol acetyl transferase (Yoshioka và Hashimoto, 1981). Ngược lại, P.anomala thường tổng hợp ester từ acetate và ethanol theo phản ứng esterase ngược (Yoshioka và Hashimoto, 1981; Rojas và cs., 2002). Ethyl acetate được sản xuất bởi P.anomala khi có mặt glucose và có độ thoáng khí khác nhau. Sự gia tăng ôxy làm giảm ethyl acetate tạo thành (Gray, 1949; Tabachnick và Joslyn, 1953; Fredlund và cs., 2004). Khi thay đổi từ điều kiện hiếu khí đến giảm nguồn ôxy, tỷ lệ các sản phẩm đặc biệt được gia tăng hơn 10 lần (Fredlund và cs., 2004). Ngược lại, Rojas và cs. (2001) nhận thấy có sự giảm ethyl acetate trong điều kiện thiếu ôxy khi so sánh với điều kiện hiếu khí. Ethyl acetate cũng có hiệu quả kháng nấm và có thể góp phần vào hoạt động điều khiển sinh học của P.anomala trong quá trình bảo quản ngũ cốc (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005). Khi P.anomala phát triển trên hạt lượng ester đáng kể đã được tạo thành (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005). Do đặc điểm sinh lý của P.anomala mà chúng có thể phát triển trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao và khoảng pH rộng (Kagiyama và cs., 1988; Fredlund và cs., 2002), nó là sinh vật thông thường trong sữa và các sản phẩm nướng, bia, môi trường có nồng độ muối cao và thức ăn gia súc (Kagiyama và cs., 1988; Kitamoto và cs., 1999; Frohlich-Wyder, 2003). Mặt khác, nấm men này cũng ứng dụng trong thực phẩm; tạo hương cho thực phẩm và sản phẩm nhũ hóa sinh học (Shepherd và cs., 1995; Chen và cs., 1998a). P.anomala thường có mặt trong đồ uống, rượu vang (Mora và Mulet, 1991; Regueiro và cs., 1993; Manzanares và cs., 1999; Zagorc và cs., 2001). P.anomala thường làm gia tăng hương vị rượu vang bằng cách tạo ra các hợp chất bay hơi, chủ yếu là ethyl acetate, nhưng cũng có thể sản xuất ra glycosidase và xylosidase (Manzanares và cs., 1999, 2000; Rojas và cs., 2001). Tuy nhiên, nồng độ ethyl acetate quá cao (200mg/L) làm rượu vang có vị khó chịu. P.anomala có trên trái cây, nước ép trái cây (Deak và Beuchat, 1993; Oyewole, 2001; Las Heras-Vazquez và cs., 2003) và các loại nước từ nho, cam (MingoranceCazorla và cs., 2003). P.anomala thể hiện vai trò quan trọng trong nhiều loại thực phẩm lên men truyền thống như lên men “brem” (rượu gạo của người Balinese), cà phê, cacao (Sujaya và cs., 2004), “Hamei” (men sản xuất rượu gạo ở Manipur, Ấn độ) (Jeyaram và cs., 2008). P.anomala cũng được dùng để sản xuất ribonucleotide và nucleoside dùng để điều vi trong thực phẩm (Kim và cs., 2002; Lee và cs., 2004). Trang 11 P.anomala có thể ức chế những vi sinh vật có hại ở những môi trường khác nhau như một tác nhân điều khiển sinh học (Bjornberg và Schnurer, 1993; Petersson và Schnurer, 1995, 1998; Petersson và cs., 1998, 1999; Boysen và cs., 2000; Druvefors và cs., 2002; Druvefors và Schnurer, 2005). P.anomala ức chế Botrytis cinerea trên táo và trên nho do tiết enzym ly giải vách tế bào (Jijakli và Lepoivre, 1998; Masih và cs., 2000; Santos và cs., 2004). Hoạt tính kháng nấm của P.anomala do nhiều yếu tố, sự đứt gãy gen PaEXG2 mã hóa một enzym exoglucanse ngoại bào không làm giảm hoạt tính kháng nấm của dòng P.anomala tái tổ hợp (Jijakli và Lepoivre, 1998). Druvefors và Schnurer (2005) đã xác định P.anomala là một trong số 60 loài khác nhau có khả năng ức chế Penicillium roqueforti. Nhiều nấm men phát triển ở mức tương tự P.anomala mà không có khả năng ức chế nấm mốc. Cơ chế kháng nấm chính của P.anomala không phải do cạnh tranh về không gian và dinh dưỡng. Tăng dinh dưỡng trong điều kiện thí nghiệm điều khiển sinh học không làm suy giảm hoạt tính kháng nấm của P.anomala. Tăng lượng glucose làm gia tăng hoạt tính kháng nấm của P.anomala J121 mà không thay đổi sinh khối nấm men. Glucose khi thêm vào môi trường nuôi cấy không ức chế nấm mốc kiểm chứng (P.roqueforti). Sản phẩm từ chuyển hóa glucose có hoạt tính kháng nấm (Druvefors và cs., 2005). Nấm bị ức chế do sự gia tăng nồng độ và hoạt tính kháng nấm của ethyl acetate (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005). Dòng đơn bội P.anomala CBS 1984 nuôi cấy ở độ hoạt động của nước aw0,95 sản xuất ít ethyl acetate hơn aw0,98 và giảm khả năng kháng nấm P.roqueforti (Fredlund và cs., 2004). Một cơ chế kháng nấm khác trên ngũ cốc có thể do hình thành ethanol, tiêu thụ ôxy và sản xuất CO2 (Druvefors, 2004; Druvefors và cs., 2002, 2005). Độc tố giết của P.anomala cũng có một khả năng chống lại các nấm mốc và nấm men không mong muốn (Walker và cs., 1995). Độc tố giết của P.anomala chống lại các nấm men gây hư hỏng rượu vang (Comitini và cs., 2004). Khi phát triển trên hạt ngũ cốc, nó có thể tăng một phần giá trị của hạt do nó là nguồn pprotein và vitamin (Litchfield, 1983). Với khả năng đồng hóa nhiều loại hợp chất nitơ, nó có thể chuyển hợp chất nitrate và ammonium thành protein để dùng trong chăn nuôi (Mo và cs., 2004). P.anomala sinh tổng hợp lượng lớn phytase (myoinositol hexaphosphate phosphohydrolase, E.C. 3.1.3.8. và 3.1.3.26 phân cắt phytate, hợp chất phosphate dự trữ trong thực vật, tạo nên giá trị dinh Trang 12 dưỡng cho động vật. Vì vậy, P.anomala có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm gánh nặng cho môi trường bằng cách giảm lượng phospho chứa trong phân bón (Vohra và Satyanarayana, 2004). P.anomala là vi sinh vật nhiễm trong nhiều loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau. Tuy nhiên, nó không gây hại đến sức khỏe con người, nấm men này không sản xuất ra mycotoxin (Fleet, 1992). P.anomala được xác định như là tác nhân không gây bệnh (vi sinh vật an toàn sinh học cấp 1 – ATCC [phụ lục 2]), không có bất cứ sự giới hạn nào trong sản phẩm và không có bất cứ mối nguy nào cho sức khỏe con người (DeHoog, 1996). Kết quả nghiên cứu lipase sinh tổng hợp bởi P.anomala đã được báo cáo (Hou, 1994; González và cs., 2004) nhưng chưa nhiều. P.anomala cũng có vai trò quan trọng trong lên men dầu ô liu (López và cs., 2008) Tại việt nam, đã có nghiên cứu phân lập P.anomala từ bánh men rượu (Dung và cs., 2007; Thanh và cs., 2008). 2.2. Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men Lipase (EC 3.1.1.3) [phụ lục 5] được tổng hợp bởi: vi khuẩn, nấm mốc và các loại tế bào thực vật và động vật (Sztajer và cs., 1988; Rapp và Backhaus, 1992; Olson và cs., 1994; Ohnish và cs., 1994). Lipase thực hiện phản ứng thuỷ phân các liên kết ester giữa glycerol và acid béo. Lipase tác động lên nhiều cơ chất khác nhau: dầu tự nhiên, các triglyceride và các liên kết ester của acid béo. Lipase tác động đến nhiều vị trí khác nhau trên các cơ chất, do đó, nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da và công nghiệp tẩy rửa (Starace, 1983; Tatara và cs., 1985; Reetz và Jäeger, 1998; Yoshikiko Yasohara và cs., 2001). 2.2.1. Nguồn gốc và ứng dụng lipase nấm men Các lipase được sản xuất bởi nhiều nấm men khác nhau. Hou (1994) đã nghiên cứu 143 loài nấm men có khả năng sinh enzym lipase (trong tổng số 479 nấm men được kiểm tra) về mức độ chịu pH và mức độ chịu nhiệt. Trong nghiên cứu này, Hou đã xác định. Bốn chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở pH 7,5 mà không hoạt động ở pH 5,5. Hai mươi ba (23) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở pH 5,5 mà không hoạt động ở pH 7,5. Chín mươi (90) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở cả pH 5,5 và 7,5. Hai mươi sáu (26) chủng nấm men sản sinh Trang 13 lipase hoạt động ở pH 9,0 ở 60oC [phụ lục 3]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của mình, Hou chỉ khẳng định các chủng nấm men không sinh tổng hợp ở pH 9,0 và tại 60oC; ở nhiệt độ khác không có kết luận gì. Năm 1997, Hou đã xác định một số đặc điểm của một số nấm men này. Lipase C.rugosa nhanh chóng trở thành một trong những enzym được dùng nhiều nhất trong công nghiệp. Đó là bởi vì sự hoạt động linh hoạt của nó trong cả thủy phân và sinh tổng hợp (Redondo và cs., 1995). Một công ty Nhật Bản đã dùng lipase C.rugosa để sản xuất acid béo cuối năm 1985 (Macrae và Hammond, 1985). Pandey và cs. (1999) đã thử nghiệm sản xuất chất mùi trong sữa đặc và kem bằng cách dùng lipase vi sinh vật. Lipse cố định Candida antarctica AY30 được dùng để ester hoá các phenol chức năng để tổng hợp chất chống ôxy hoá lipophillic dùng cho dầu hướng dương (Pandey và cs., 1999). Bảng 2.1. Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase Tên nấm men Arxula adeninivorans Candida albicans Candida antarctica Candida curvata Candida cylindracea Candida deformans CBS 2071 Candida ernobii Candida entomophila Candida lipolytica Candida parapsilosis CBS 604 Candida paralipolytica C.rugosa/C.cylindracea ATCC 14380 DMS 2031 L 1754 Candida rugosa Candida utilis Tác giả và năm công bố Boer và cs., 2005 Hube và cs., 2000; Stehr và cs., 2004; David A. Schofield và cs., 2005; Attila Gacser và cs., 2007 Svendsen và cs., 1994; Høegh và cs., 1995; Patkar và cs., 1998; Rotticci và cs., 2001; Jan Pfeffer và cs., 2006; Larsen và cs., 2008; Suhyun Jung & Seongsoon Park 2008 Montet và cs., 1985 Lee và Choo 1989; Hirofumi Nakano và cs., 1991 Muderhwa và cs., 1985 Bigey và cs., 2003 Pignede và cs., 2000a; Pignede và cs., 2000b Fujimoto và cs., 1996 Padmini và cs., 1990 Bri và và cs., 1995 Neugnot và cs., 2002 Vecozola và Bekers 1978 Valero và cs., 1988, Brocca và cs., 1995 Benjamin và Pandey, 2001 Veeraragavan và Gibbs, 1989 Fadiloglu và Erkmen 2002; Shaw và cs., 2006; GuanChiun Lee và cs., 1999; Fusetti và cs., 1996; Zhao và cs., 2008 Fujino và cs 2006 Trang 14 Bảng 2.1. (tiếp theo) Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase Tên nấm men Geotrichum sp. FO401B Geotrichum asteroids FKMF 144 Geochitrum candidum ATCC 34614 CMICC 335426 NRCC205002; NRRL Y-552; NRRL Y-533 ATCC 66592 Geochitrum candidum Kurtzmanomyces sp. I-11 Kluyveromyces lactis Pichia burtonii Pichia anomala Rhodotorula rubra Rhodotorula glutinis Saccharomyces cerevisiae Saccharomycopsis fibuligera Saccharomycopsis lipolytica Schizosaccharomyces pombe Trichosporon asteroids Trichosporon cutaneum Trichosporon fermentans WUC12 Tác giả và năm công bố Ota và cs., 2000 Kazanina và cs., 1981; Selezneva và Kazanina 1986 Tahoun và cs., 1982 Shimada và cs., 1990 Charton và cs.,1992 Bertolini và cs., 1994 Jacobsen và Poulsen 1992 E. Vandamme và cs., 1987 Kakugawa và cs., 2002 Oishi và cs.,1999 Sugihara và cs., 1995 Hou 1994 Rapp và Backhaus 1992 Papaparaskevas và cs., 1992 Oishi và cs.,1999 Pandey và cs.,1999 Ruschen và Winkler 1982 Smerdon và cs., 1998 Dharmsthiti và Ammaranond 1997 Chen và cs.,1993 Chen và cs., 1992; Chen và cs., 1993; Chen và cs., 1994; Arai và cs., 1997 Hadeball và cs., 1991; Ota và cs., 1982; Destain và cs., Yarrowia lipolytica 1997; Pignede và cs., 2000a; Pignede và cs., 2000b Một số nấm men khác xin xem thêm phụ lục 3 Uppenberg và cs. (1994) đã dùng lipase tái tổ hợp của C.antarctica trong chất tẩy rửa. Lipase ngoại bào của C.cylindracea ATCC 14830 (CCL/CRL) thuỷ phân các triglyceride không đặc hiệu, tác động cả vào vị trí của phân tử glycerol và cả trong acid béo tự nhiên được giải phóng. Sự đặc trưng linh động này có quan hệ với các lipase khác tạo tính hữu dụng đặc biệt của CCL/CRL ứng dụng trong công nghiệp (Lotti và cs., 1993). Trong công nghiệp tẩy rửa, lipase C.cylindracea và C.lypolytica (hiện nay gọi là Y.lipolytica) được dùng để phân cắt vết lipid (Pierce và cs., 1990; Batenburg và cs., 1991). Polyglycerol và các ester của carbohydrate và acid béo sản xuất bằng xúc tác lipase được dùng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa và nhũ hóa trong các thực phẩm khác nhau (thực phẩm ít béo, kem, mayonaise). Gần đây, Unichem International đã bắt đầu sản xuất isopropyl myristate, isopropyl palmitate và 2-