Tài liệu Tối ƣu điều kiện nuôi cấy một số dõng vi khuẩn kỳ khí trên cơ chất vỏ trấu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY MỘT SỐ DÕNG VI KHUẨN KỲ KHÍ TRÊN CƠ CHẤT VỎ TRẤU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Th.S VÕ VĂN SONG TOÀN Văn Hữu Lộc Th.S DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG MSSV: 1065586 LỚP: DA0666T1 Cần Thơ, Tháng 11/2010 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Th.S Võ Văn Song Toàn Văn Hữu Lộc CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Th.S Dương Thị Hương Giang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gửi lời cảm tạ và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ths. Võ Văn Song Toàn, Ths. Dương Thị Hương Giang, Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ, đã tận tình hướng dẫn, khích lệ và tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Các thầy cô giảng dạy các môn hóa vô cơ, hóa hữu cơ, vật lý, vi sinh cơ bản, sinh hóa,… đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích, giúp tôi có thề hoàn thành tốt luận văn. Thầy Lê Thanh Hùng, cán bộ phòng Hóa sinh thực phẩm đã hỗ trợ tôi tận tình trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Dung, cán bộ phòng enzyme, anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Huỳnh Xuân Phong, anh Bùi Duy Nhân cán bộ phòng thực phẩm Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ, đã truyền đạt các kĩ thuật sinh hóa, hổ trợ tôi các trang thiết bị phòng thí nghiệm, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn. Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2010 Văn Hữu Lộc Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Trong số 12 dòng vi khuẩn kỵ khí đã phân lập từ đề tài trước, đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu một số dòng vi khuấn kỵ khí trên cơ chất vỏ trấu” nhằm chọn ra 1-2 dòng có khả năng sinh enzyme cao nhằm góp phần vào xử lý rác thải nông nghiệp đặc biệt là trấu, giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường. Trong đó, dòng 84 (có nguồn gốc từ trong đất) là dòng có hoạt tính cellulase mạnh nhất. Sau 96 giờ ủ thì vi khuẩn đạt mật số cao nhất (35.11 x107 CFU/ml). Qua định danh bằng máy Biolog cho kết quả dòng 84 là Acinetobacter. Vi khuẩn tạo vòng tròn thủy phân trên môi trường thạch có đường kính lớn nhất (15mm) khi được ủ ở 30 0C, pH 7. Đề tài cũng tìm ra được nồng độ chất cảm ứng lactose tối ưu là 1% (w/v) làm tăng vòng tròn thủy phân rỏ rệch. Trong điều kiện tối ưu pH 7, nhiệt độ 30 0C, với nồng độ lactose 1%, hàm lượng enzyme, hoạt tính CMCase,và Avicelase đều tăng dần và cao nhất vào ngày thứ 5 với các giá trị lần lượt là 0.19 mg, 0.197 U/ml, 0.181 U/ml. hiệu suất thủy phân đo được sau 8 ngày ủ ở điều kiện tối ưu là 5,46%. Từ khóa: Trấu, vi khuẩn phân hủy cellulose, vi khuẩn kỵ khí, hoạt tính cellulase, lactose, chất cảm ứng. Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT .................................................................................................................. LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................................ TÓM LƢỢC ............................................................................................................................. i MỤC LỤC ................................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................................... viiI DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................. ix CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. x CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ..................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...........................................................................2 2.1. Tổng quan về trấu và cellulose ..................................................................................... 2 2.1.1. Trấu ........................................................................................................................... 2 2.1.2. Cellulose ................................................................................................................... 3 2.2. Sơ lƣợc về cellulase ....................................................................................................... 3 2.2.1. Phân loại ................................................................................................................... 3 2.2.2. Cơ chế tác động của cellulase lên cellulose.............................................................. 4 2.3. Vi sinh vật phân hủy cellulose ..................................................................................... 4 2.4. Lƣợc khảo một số phƣơng pháp vi sinh ..................................................................... 5 2.4.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí .................................................................... 5 2.4.2. Phương pháp pha loãng vi sinh vật........................................................................... 5 2.4.3. Phương pháp đếm mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống......................... 6 2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn ........................................................................ 6 2.4.5. Phương pháp đo đường kính thủy phân .................................................................... 6 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 2.4.6. Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn ......................................................................... 7 2.4.6.1. Kỹ thuật hộp ria ................................................................................................. 7 2.4.6.2. Kỹ thuật hộp trải ................................................................................................ 7 2.4.6.3. Kỹ thuật hộp đổ ................................................................................................. 7 2.5. Lƣợc khảo một số phƣơng pháp sinh hoá ................................................................... 8 2.5.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein – phương pháp Bradford ....................... 8 2.5.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử và hoạt tính enzyme- phương pháp Nelson - Somogyi ............................................................................................................... 8 2.5.3. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose ............................................................. 8 2.5.4. Phương pháp nhuộm congo red ............................................................................... 9 2.5.5. Định danh vi khuẩn bằng hệ thống định danh vi sinh vật Biolog............................. 9 2.6. Tình hình nghiên cứu trên trong nƣớc và trên thế giới ............................................. 9 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................................. 9 2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................................... 10 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................11 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .............................................................................................. 11 3.1.1. Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................................... 11 3.1.2. Nguyên vật liệu ....................................................................................................... 11 3.1.3. Hóa chất .................................................................................................................. 11 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................ 11 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hàm lượng cellulose trong bột vỏ trấu .............................. 11 3.2.2. Thí nghiệm 2: Tách ròng các dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng phân hủy cơ chất bột vỏ trấu ......................................................................................................................... 13 3.2.3. Thí nghiệm 3: Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng sinh cellulase cao ..................................................................................................................................... 14 3.2.4. Thí nghiệm 4: Đường cong tăng trưởng của dòng vi khuẩn được chọn ................ 15 3.2.5. Thí nghiệm 5: Định danh dòng vi khuẩn có khả năng sinh cellulase cao .............. 16 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ-pH đến điều kiện nuôi cấy dòng vi khuẩn được chọn ............................................................................................................... 17 3.2.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của Lactose đến điều kiện nuôi cấy dòng vi khuẩn được chọn ............................................................................................................... 17 3.2.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của vi khuẩn kỵ khí ................................................................................................................................ 18 3.2.8.1. Khảo sát hàm lượng protein từng ngày bằng phương pháp Bradford 18 3.2.8.2. Khảo sát hoạt tính enzyme và lượng đường khử sinh ra từng ngày bằng phương pháp Nelson - Somogyi ............................................................................... 18 3.2.9. Thí nghiệm 9: Đánh giá khả năng thủy phân vỏ trấu, bã mía và rơm của dòng vi khuẩn được chọn ............................................................................................................... 20 3.2.9.1. Đánh giá khả năng thủy phân vỏ trấu, bã mía và rơm của dòng vi khuẩn được chọn trên môi trường thạch........................................................................................... 20 3.2.9.2. Đánh giá khả năng thủy phân vỏ trấu, bã mía và rơm của dòng vi khuẩn được chọn trên môi trường lỏng ............................................................................................ 21 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................22 4.1. Thí nghiệ m 1: Khảo sát hàm lƣợng cellulose trong bột vỏ trấu .............................. 22 4.2. Thí nghiệm 2: Tách ròng các dòng vi khuẩn kỳ khí có khả năng phân hủy cơ chất bột vỏ trấu ........................................................................................................................... 22 4.3. Thí nghiệ m 3: Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kỳ khí có khả năng sinh cellulase mạnh..................................................................................................................................... 25 4.4. Thí nghiệ m 4: Đƣờng cong tăng trƣởng của dòng vi khuẩn đƣợc chọn ............... 26 4.5. Thí nghiệ m 5: Định danh dòng vi khuẩn có khả năng sinh cellulase cao............... 27 4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ-pH đến điều kiện nuôi cấy dòng vi khuẩn đƣợc chọn............................................................................................................. 28 4.7. Thí nghiệ m 7: Khảo sát ảnh hƣởng của lactose đến điều kiện nuôi cấy dòng vi khuẩn đƣợc chọn................................................................................................................. 30 4.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian lên sự phát triển của vi khuẩn kỳ khí........................................................................................................................ 30 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 4.8.1. Khảo sát hàm lượng protein từng ngày bằng phương pháp Bradford .................... 31 4.8.2. Khảo sát hoạt tính enzyme và lượng đường khử sinh ra từng ngày bằng phương pháp Nelson – Somogyi .................................................................................................... 32 4.8.3. Khảo sát hiệu suất thủy phân của enzyme từng ngày ............................................. 33 4.9. Thí nghiệm 9: Đánh giá khả năng thủy phân vỏ trấu, bã mía và rơm của dòng vi khuẩn đƣợc chọn................................................................................................................. 35 4.9.1. Đánh giá khả năng thủy phân vỏ trấu, bã mía và rơm của dòng vi khuẩn được chọn trên môi trường thạch........................................................................................................ 35 4.9.2. Đánh giá khả năng thủy phân vỏ trấu, bã mía và rơm của dòng vi khuẩn được chọn trên môi trường lỏng ......................................................................................................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................37 5.1. Kết luận......................................................................................................................... 37 5.2. Đề nghị .......................................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................38 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phƣơng pháp vi sinh 1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí 2. Các bước chuẩn bị môi trường CMC 1% 3. Các bước chuẩn bi môi trường phân lập 4. Các bước chuẩn bị môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng lactose 5. Cách pha thuốc nhuộm hoạt tính enzyme-congo red 0.1% 6. Phương pháp pha loãng 7. Phương pháp đếm mật số vi khuẩn bằng cách đếm sống 8. Phương pháp nhuộm gram 9. Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase bằng đường tròn thủy phân . Phụ lục 2: Các phƣơng pháp sinh hóa Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 1. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose 2. Phương pháp Bradford (1976) 3. Phương pháp Nelson – Somogyi (1944) Phụ lục 3: Kết quả thống kê 1. Kết quả thống kê thí nghiệm 3 2. Kết quả thống kê thí nghiệm 4 3. Kết quả thống kê thí nghiệm 6 4. Kết quả thống kê thí nghiệm 7 5. Kết quả thống kê thí nghiệm 8 6. Kết quả thống kê thí nghiệm 9 Phụ lục 4: Kết quả 1. Bảng 23. Kết quả thí nghiệm 1 2. Bảng 24. Kết quả thí nghiệm 3 3. Bảng 25. Kết quả thí nghiệm 4 4. Bảng 26. Kết quả thí nghiệm 6 5. Bảng 27. Kết quả thí nghiệm 7 6. Kết quả thí nghiệm 8 a) Bảng 28. Kết quả hàm lượng protein theo thời gian b) Bảng 29. Kết quả hoạt tính enzyme trên cơ chất CMC c) Bảng 30. Kết quả hoạt tính enzyme trên cơ chất Cellulose d) Bảng 31. Kết quả hiệu suất thủy phân 7. Kết quả thí nghiệm 9 a) Bảng 32. Kết quả đường kính thủy phân trên 3 loại cơ chất b) Bảng 33. Kết quả hàm lượng protein trên 3 loại cơ chất c) Bảng 34. Kết quả hoạt tính CMCase trên 3 loại cơ chất Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT d) Bảng 35. Kết quả hoạt tính Avicelase trên 3 loại cơ chất Chuyên ngành Công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1 . Thành phần hóa học trong vỏ trấu .......................................................................... 2 Bảng 2 . Hàm lượng cellulose trong vỏ trấu ...................................................................... 22 Bảng 3. Hình thái khuẩn lạc .................................................................................................. 23 Bảng 4. Hình thái vi khuẩn ................................................................................................... 24 Bảng 5. Kết quả đường kính vòng tròn thủy phân của 12 dòng vi khuẩn kỵ khí........... 25 Bảng 6. Kết quả hoạt tính và đường khử theo mỗi ngày ................................................... 33 Chuyên ngành Công nghệ sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian ................................................ 3 Hình 2. Cơ chế quá trình thủy phân cellulose....................................................................... 4 Hình 3. Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân................................................... 5 Hình 4. Quy trình xác định hàm lượng cellulose trong vỏ trấu ........................................ 12 Hình 5. Quy trình nhuộm Gram vi khuẩn ........................................................................... 14 Hình 6. Quy trình tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cao ................. 15 Hình 7. Quy trình định danh vi khuẩn bằng hệ thống định danh vi sinh vật Biolog ..... 16 Hình 8. Quy trình xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford ................ 18 Hình 9. Quy trình xác định hoạt tính enzyme và lượng đường khử bằng phương pháp Nelson ...................................................................................................................................... 19 Hình 10. Gram và hình dạng vi khuẩn................................................................................. 24 Hình 11. Đường kính thủy phân của các dòng vi khuẩn 80, 67, 84................................. 26 Hình 12. Đường tăng trưởng của dòng vi khuẩn 84 .......................................................... 26 Hình 13. Kết quả định danh bằng phần mềm Biolog......................................................... 28 Hình 14. Khuẩn lạc vi khuẩn Acinetobacter ....................................................................... 28 Hình 15. Đường kính vòng tròn thủy phân dưới sự tương tác pH-Nhiệt độ................... 29 Hình 16. Nồng độ lactose ảnh hưởng đến đường kính vòng tròn thủy phân .................. 30 Hình 17. Hàm lượng protein tổng theo thời gian ............................................................... 31 Hình 18. Hoạt tính của enzyme cellulase theo thời gian ................................................... 32 Hình 19:Hiệu suất thủy phân qua từng ngày ...................................................................... 34 Hình 20. Đường kính thủy phân của dòng Acinetobacter trên 3 loại môi trường ......... 35 Hình 21. Hàm lượng protein tổng của dòng vi khuẩn sinh ra trên 3 loại cơ chất .......... 36 Hình 22. Hoạt tính enzyme của dòng vi khuẩn trên 3 loại cơ chất .................................. 36 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT BSA: Bovine serum albumin. CBB: Coomassie Brilliant Blue G250 . Avicelase : có hoạt tính exocellulase , cắt thể cellulose thành dạng bông. CMCase : có hoạt tính endocellulase và exocellulase , thủy phân bên trong các cellulose thành cellobiose. CMC: Carboxymethyl-cellulose. Rpm: Revolutions per minute : tốc độ vòng quay trong 1 phút. ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long đktp: đường kính thủy phân Chuyên ngành Công nghệ sinh học x Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Ước tính hàng năm có khoảng gần 2 triệu tấn trấu được thải ra từ các cơ sở xay xát. Nhiều nhà máy, xí nghiệp mà chủ yếu ở phía Nam đang phải đối mặt với việc xử lý lượng phế thải khổng lồ trên (không đủ mặt bằng kho chứa và thiếu đầu ra...). Chẳng hạn, một nhà máy xay xát có công suất trung bình 100 tấn/ca, 1 giờ sẽ thải ra 2,5 tấn trấu, 1 ngày là 60 tấn và 1 tháng là 1.800 tấn (http://www.sggp.org.vn. Ngày 25/07/2010). Với khối lượng riêng của trấu là 130 kg/m 3 thì phải cần một thể tích kho chứa trên 13.000 m3 . Mặt khác, do khối lượng riêng nhỏ nên chi phí vận chuyển đến các vùng nông thôn, nơi đang thiếu chất đốt và vẫn phải chặt phá rừng để lấy củi, là rất tốn kém. Vựa lúa ĐBSCL mỗi năm sản xuất khoảng 18 triệu tấn lúa, tính ra, lượng trấu thải ra ở ĐBSCL là 3,6 triệu tấn/năm (http://www.thesaigontimes.vn. Ngày 26/7/2010). Sản lượng lúa ngày càng tăng, trấu thiếu nơi tiêu thụ nên các nhà máy xay xát đã đưa thẳng trấu xuống sông gây ô nhiễm nguồn nước ảnh hưởng đến sinh hoạt của người dân nhưng đây là việc ngoài ý muốn của nhà máy xay xát. 1.2. Mục tiêu đề tài Hiện nay các nhà máy xay xát chỉ sử dụng trấu làm nhiên liệu đốt, nhưng vẫn không thể giải quyết hết lương trấu tồn động, nên việc tìm thêm những phương pháp khác để sử dụng triệt để trấu là 1 vấn đề quan trong. Thực tế hiện nay một số tỉnh nhất là ở ĐBSCL lượng trấu vẫn còn rất dồi dào nên cần lưu ý tăng cường việc nghiên cứu ứng dụng nguồn nguyên liệu này nhằm mở rộng khả năng sử dụng trấu vừa tiết kiệm chi phí sản xuất, vừa có lợi cho môi trường ( vaas.org.vn. Ngày 26/7/2100). Đề tài “Tối ưu điều kiện nuôi cấy một số dòng vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất vỏ trấu” nhằm phát hiện, nghiên cứu và khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu của những dòng vi khuẩn kỵ khí có thể sản sinh ra enzyme cellulase phân cắt cellulose trong trấu góp phần giải quyết lượng trấu còn tồn động. Bên cạnh đó còn góp phần tạo điều kiệ n cho những nghiên cứu sâu hơn sau này. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về trấu và cellulose 2.1.1. Trấu Trấu là lớp vỏ ngoài cùng của hạt lúa và được tách ra trong quá trình xay xát. Theo một số nghiên cứu, trấu thường chiếm khoảng 20% hạt lúa. Khối lượng riêng của trấu là 130 kg/m3 (http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Bien-vo-trau-thanh-chat-dot-cao- cap/10736274/188/. Ngày 26/7/2010). Trong vỏ trấu chứa khoảng 75% chất hữu cơ dễ bay hơi sẽ cháy trong quá trình đốt và khoảng 25% còn lại chuyển thành tro (Energy Efficiency Guide for Industry in Asi a – www.energyefficiencyasia.org. Ngày 26/7/2010). Chất hữu cơ chứa chủ yếu cellulose, lignin và hemicellulose, ngoài ra có thêm thành phần khác như hợp chất nitơ và vô cơ. Lignin chiếm khoảng 25 -30% và cellulose chiếm khoảng 35-40% (Elijah et al., 2009). Theo Zaid và Ganiyat (2008) thì bên cạnh cellulose, hemicellulose, lignin, trong vỏ trấu còn có các thành phần dinh dưỡng khác. Các chất hữu cơ của trấu là các mạch polycarbohydrat rất dài nên hầu hết các loài sinh vật không thể sử dụng trực tiếp được, nhưng các thành phần này lại rất dễ cháy nên có thể dùng làm chất đốt. Sau khi đốt, tro trấu có chứa trên 80% là sil ic oxid, đây là thành phần được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực. Theo Hwang và Chandra (1996) thì giữa những giống lúa khác nhau sẽ có thành phần cellulose khác nhau. Bảng 1 . Thành phần hóa học trong vỏ trấu Vỏ trấu Alcoholbenzene 1% NaOH Nước nóng Holocellulose Tro Lignin Japonica Indica Vỏ trấu khô 1.8 2.1 - 32.3 30.6 - 5.4 5.1 8 - 15 53.9 54.3 40 - 50 13.6 11.7 15 - 20 24.8 25.8 25 - 30 (*Nguồn: Hwang và Chandra, 1996) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 2.1.2. Cellulose Cellulose là một homopolimer mạch thẳng được cấu tạo bởi các -D glucose- pyranose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật (theo http://www.hoahocngaynay.com/vi/tin-tuc-hoa-hoc/hoa-hoc-viet-nam/432- 06112010.html, ngày 26/7/2010). Động vật có vú (kể cả con người) không thể tiêu hóa cellulose được, nhưng vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, những loài nhai lại khác và những động vật nguyên sinh trong ruột của mối có thể tiết ra enzyme phân cắt cellulose. Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật, một số ít có trong tế bào vi khuẩn kỵ khívà không có trong tế bào động vật, hiện diện dạng sợi rắn, màu trắng, không mùi, không vị, không tan trong nuớc, kể cả nuớc nóng. Là một homopolimer mạch thẳng được cấu tạo bởi các -D glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi các glucose không phân nhánh, các glucose này liên kết bởi -1,4 glucoside. Hình 1. Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian (*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose, ngày 26/7/2010) 2.2. Sơ lƣợc về cellulase 2.2.1. Phân loại Cellulase là một phức hệ enzyme gồm: + Exocellulase (1,4 -glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91): cắt đầu không khử của chuỗi cellulose thành cellobiose, không phân gi ải cellulose kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng + Endocellulase (1,4 -D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): phân giải liên kết -1,4 glucosid trong cellulose thành: cellodextrin, cellobiose, glucose. Tác động yếu đối với cellulose kết tinh. + -glucosidase (EC.3.2.1.21): phân hủy cellobiose thành glucose. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 2.2.2. Cơ chế tác động của cellulase lên cellulose Các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Mỗi một loại enzyme chỉ tham gia thủy phân một phần phân tử cellulose. Cellulose kết tinh Hình 2. Cơ chế quá trình thủy phân cellulose (*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulase. Ngày 26/7/2010) 2.3. Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong điều kiện tự nhiên vi sinh vật phân hủy cellulose rất phong phú gồm: nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn, và cả nấm men. + Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma koningi, Trichoderma reesei, Rihizopus species, Mucor pusilus,Acinetobacter.… + Xạ khuẩn: Actinomycescellulose, Act. aureus, Thremonospora curvata,… + Vi khuẩn: Bacteria megaterium, Bacteria mensenteroides, Clostridium cellobioparum, Cellulosemonas, Ruminococcus albus, Ruminobacter parvum,… + Nấm men: Saccharomycopsis sp, Saccharomycopsis fibuligera,…( http://en.wikipedia.org/wiki. Ngày 23/07/2010) Vi sinh vật phân huỷ cellulose cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Tuy nhiên một loại vi sinh vật không có khả năng tổng hợp cùng một lúc hệ enzyme cellulase và trong điều kiện tự nhiên thường chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ cơ chất,…nên việc phân hủy cellulose trong tự nhiên xảy ra rất chậm. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 2.4. Lƣợc khảo một số phƣơng pháp vi sinh 2.4.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí Mục đích: Tạo môi trường kỵ khí, giúp các loài vi sinh vật kỵ khí phát triển tốt. Nguyên tắc: Trước khi tiến hành cấy, buồng cấy phải được khử trùng cẩn thận bằng đèn cực tím trong 30 phút. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí trong đĩa Petri được đưa vào buồng cấy cùng một số dụng cụ cần thiết đã được khử trùng bằng tia UV, 15 phút. - Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí trong môi trường. - Để nguội môi trường còn 45 - 50 0C. - Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm. - Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong bình hút ẩm có để đèn cầy nhằm tạo môi trường kỵ khí. - Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. 2.4.2. Phương pháp pha loãng vi sinh vật ống gốc 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 9 ml nước cất vô trùng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 1 Độ pha loãng 10 102 103 104 105 106 107 108 Pha loãng Hình 3. Phƣơng pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Khi pha loãng mẫu cần đưa ống chứa mẫu lên máy lắc để trộn đều mẫu. Nguyên tắc: Do dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng độ cao, thường nhiều hơn 10 6 CFU/ml, nên cần thiết phải được pha loãng. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.4.3. Phương pháp đếm mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống Môi trường được pha loãng nhiều lần rồi chuyển đến dĩa Petri và trộn lẫn với môi trường chứa agar khoảng 45 0C, để nguội, môi trường đặc lại, đem ủ trong tủ ủ và đếm số khuẩn lạc (colony) rồi suy ra số tế bào trong dung dịch muốn đếm. Phương pháp này gọi là phương pháp đếm sống vì chỉ có vi khuẩn kỵ khí sống mới phát triển thành khuẩn lạc (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002). 2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn Mục đích: Để xác định vi khuẩn này Gram dương hay Gram âm. Phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram giúp phân biệt vi khuẩn nhờ đặc điểm hình thái, sự sắp xế p của tế bào và lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có màu tím, còn vi khuẩn Gram âm có lớp tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng. Theo phương pháp nhuộm Gram vết bôi vi khuẩn sẽ được tạo ra, làm khô và hơ nóng nhẹ để tế bào vi khuẩn dính chắc vào bề mặt phiến kính. Sau đó, vết bôi được nhuộm với crystal violet, thuốc nhuộm dư được rửa trôi rồi thêm dung dịch idone vào vết bôi. Idone làm nhiệm vụ gắn chất màu vào tế bào. Tiếp theo vết bôi được khử màu với chất cồn và được nhuộm màu với fuschin. Ở tế bào vi khuẩn Gram dương, màu tím của crystal violet được gắn chắc vào lớp vỏ tế bào nhờ idone, không bị khử với cồn vì thế mà tế bào vi khuẩn vẫn mang màu tím. Trái lại tế bào vi khuẩn Gram âm bị khử bởi cồn và tế bào không màu lại bắt màu hồng của fuschin. 2.4.5. Phương pháp đo đường kính thủy phân Mục đích: Đánh giá sơ bộ về khả năng phân hủy CMC của vi khuẩn để làm cơ sở cho những thí nghiệm sau. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Nguyên tắc: Khi enzyme cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải làm cho độ đục môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt. Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỉ lệ với độ hoạt động của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.4.6. Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn 2.4.6.1. Kỹ thuật hộp ria - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống. - Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. - Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. 2.4.6.2. Kỹ thuật hộp trải - Dùng pipetman và đ ầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. - Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. - Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường. - Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. 2.4.6.3. Kỹ thuật hộp đổ - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 55 0C vào đĩa petri đã cấy mẫu. - Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. - Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học