Tài liệu Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng bacillus subtilis xl62, ứng dụng thử nghiệm chế phẩm bcf trên mô hình in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------o0o----------- LÊ THANH HOÀNG TINH SẠCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Bacillus subtilis XL62, ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM BCF TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------o0o----------- LÊ THANH HOÀNG TINH SẠCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Bacillus subtilis XL62, ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM BCF TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO Chuyên ngành: Mã số: Học viên : Hướng dẫn khoa học: Sinh học thực nghiệm 60 42 30 Lê Thanh Hoàng TS Đỗ Thị Tuyên Luận văn được thực hiện tại Phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH Hà Nội - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm việc. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi xin cảm ơn Phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Hà Nội, tháng 11 năm 2012 Học viên Lê Thanh Hoàng i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC TỪ VIẾT TẮT AFC Antifungal compound APS Ammonium persulphate B. subtilis Bacillus subtilis BCF Biological Control Fungi CFU Conoly-Forming Unit DEAE-cellulose Dimethylaminoethyl-cellulose ĐC Đối chứng F. oxysporum Fusarium oxysporum kDa Kilo Dalton M Marker MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Pr Protein R. solani Rhizoctonia solani SDS Sodium dodecyl sulfate TB Trung bình TEMED N,N,N’,N’,- Tetramethyl ethylene diamine TN Thí nghiệm v/v Volume/volume w/v Weight/volume ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................i CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................vi MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1 Khái quát về chất đối kháng sinh trưởng nấm ...............................................3 1.2 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong kiểm soát sinh học ................................4 1.2.1 Đại cương về vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 4 1.2.2 Ứng dụng của các chủng Bacillus trong kiểm soát sinh học .................. 5 1.3 1.3.1 Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm ................................. 8 1.3.2 Sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm ........................................... 9 1.4 2 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh trên thế giới ................7 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh ở Việt Nam ..............10 1.4.1 Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng trừ nấm bệnh .................... 10 1.4.2 Nghiên cứu sản xuất và thương mại các chế phẩm phòng trừ nấm ..... 12 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 17 2.1 Vật liệu và hóa chất .....................................................................................17 2.1.1 Chủng giống .......................................................................................... 17 2.1.2 Hóa chất ................................................................................................ 17 2.1.3 Các loại đệm và dung dịch ................................................................... 17 2.1.4 Môi trường ............................................................................................ 18 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................19 2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật ........................................................ 19 2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm .............................................................. 19 iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 2.2.3 Xác định ảnh hưởng của dinh dưỡng và các yếu tố hóa lý .................. 20 2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ...................... 21 2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................... 22 2.2.6 Xác định hàm lượng protein tổng số .................................................... 23 2.2.7 Xác định tính chất protein tinh sạch ..................................................... 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 25 3.1 3.1.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch lọc tế bào từ B. subtilis XL62 .............. 25 3.1.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy ................................. 27 3.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ......................................................... 30 3.1.4 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ban đầu ................................................... 31 3.1.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc ..................................................................... 34 3.2 Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm...................................................35 3.2.1 Tinh sạch qua sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose .............................. 35 3.2.2 Tinh sạch qua sắc ký lọc gel Biogel P100 ............................................ 36 3.3 Đánh giá tính chất của protein tinh sạch .....................................................41 3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 41 3.3.2 Ảnh hưởng của proteinase K ................................................................ 42 3.3.3 Khả năng ức chế sợi bào tử nấm .......................................................... 42 3.4 4 Tính kháng nấm của hoạt chất ngoại bào từ B. subtilis XL62 ....................25 Sản xuất và thử nghiệm chế phẩm BCF ......................................................43 3.4.1 Sản xuất chế phẩm BCF quy mô phòng thí nghiệm .............................. 43 3.4.2 Thử nghiệm chế phẩm BCF trên mô hình in vitro ................................ 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 48 4.1 Kết luận........................................................................................................48 4.2 Kiến nghị .....................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 54 iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B. subtilis XL62 trên môi trường PDA................................... 4 Hình 2.1. Quy trì nh tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis XL62 ................................. 22 Hình 3.1. Động thái sinh trưởng của B. subtilis XL62 trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau .......................................................................................................................................................... 28 Hình 3.2. Hoạt tính ức chế sinh trưởng F. oxysporum của B. subtilis XL62 trong các môi trường khác nhau ......................................................................................................................................... 29 Hình 3.3. Hoạt tính ức chế sinh trưởng R. solani của B. subtilis XL62 trong các môi trường khác nhau .................................................................................................................................................. 29 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của B. subtilis XL62 ........................ 30 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên hoạt tính ức chế sinh trưởng F. oxysporum và R. solani ................................................................................................................................................ 31 Hình 3.6. Mật độ tế bào B. subtilis XL62 trong môi trường MT4 và MT2 với các giá trị pH ban đầu khác nhau................................................................................................................................... 32 Hình 3.7. Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên hoạt tính ức chế F. oxysporum ......................... 33 Hình 3.8. Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên hoạt tính ức chế R. solani ................................. 33 Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng XL62 ........................................... 34 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm F. oxysporum và R. solani ................................................................................................................................................ 35 Hình 3.11. Sắc ký đồ c ác phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE -cellulose (A); Hoạt tính kháng F. oxysporum của các đỉnh protein sau khi qua cột DEAE-52 cellulose (B) ........................ 36 Hình 3.12. Sắc ký đồ (A) và điện di đồ (B) các phân đoạn tinh sạch qua cột Biogel ở peak 1. ...... 37 Hình 3.13. Hoạt tính kháng nấm các phân đoạn tinh sạch ở peak 1 sau khi qua cột Biogel. .......... 37 Hình 3.14. ( A) Sắc ký đồ qua cột Biogel P 100; (B) điện di đồ các phân đoạn tinh sạch qua cột Biogel ở peak 2. ............................................................................................................................... 38 Hình 3.15. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum các phân đoạn tinh sạch peak 2. .......................... 38 Hình 3.16. Sắc ký đồ các phân đoạn qua cột Biogel P100 (A); Điện di đồ các phân đoạn tinh sạch trước và sau khi qua cột Biogel ở peak 3 (B). .................................................................................. 39 Hình 3.17. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum của các phân đoạn tinh sạch ở peak3. .................. 39 Hình 3.18. Hoạt tính kháng F. oxysporum và R. solani của protein tinh sạch ở peak 3. ................. 40 Hình 3.19. Hoạt tính kháng R. solani của protein tinh sạch từ B. subtilis XL62 ở peak 3. ............. 40 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tí nh kháng nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B). 42 Hình 3.21. Ảnh hưởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B). ................................................................................................................................................... 42 Hình 3.22. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein tinh sạch từ B. subtilis XL62 quan sát trên kính hiển vi quang học. .................................................................................... 42 Hình 3.23. Lên men sản xuất chế phẩm BCF trên quy mô 20 lít/mẻ .............................................. 44 Hình 3.24. Hoạt tính ức chế F. oxysporum (A,C) và R. solani (B,D) của chế phẩm BCF dạng đơn (A,B) và dạng đa (C,D) sau 5 ngày thí nghiệm. ............................................................................... 46 Hình 3.25. Hoạt tính ức chế F. oxysporum (A) và R. solani (B) của chế phẩm BCF dạng lỏng cô đặc 10 lần sau 5 ngày thí nghiệm. .................................................................................................... 46 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch ........................................................................... 17 Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật................................................................... 18 Bảng 2.3. Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng............................................................. 18 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis XL62 lên sinh trưởng của F. oxysporum ........................................................................................................................................ 26 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis XL62 lên sinh trưởng của sợi R. solani ................................................................................................................................................ 26 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis XL62 lên sinh trưởng của hạch R. solani ................................................................................................................................................ 26 Bảng 3.4. Sự biến động giá trị pH môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy ...................... 31 Bảng 3.5. Tóm tắt quá trình tinh sạch protein kháng nấm từ B. subtilis XL62 ở peak 3 khi qua các bước tinh sạch .................................................................................................................................. 39 Bảng 3.6. Khả năng ức chế F. oxysporum và R. solani của dịch nuôi cấy chủng B. subtilis XL62, sau các ngày lên men khác nhau. ..................................................................................................... 44 Bảng 3.7. Hoạt tính ức chế R. solani và F. oxysporum của chế phẩm BCF sau 5 ngày thử nghiệm 46 Bảng 3.8. Hoạt tính ức chế R. solani và F. oxysporum của chế phẩm BCF cô đặc 10 lần sau 5 ngày thử nghiệm ....................................................................................................................................... 46 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Chất đối kháng sinh trưởng nấm (antifungal compounds , AFC) là những chất có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm đặc biệt là nấm gây bệnh ở cây trồng như lạc , cà chua , đậu tương , cây cà phê . Các protein v à peptide có hoạt tính kháng nấm đều được tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi khuẩn và nấm. Dựa trên cấu trúc hoặc chức năng , các protein và peptide có khả năng kháng nấm được phân loại thành nhiều lớp khác nhau, chẳng hạn như chitinase và chitinase-like protein, ribonuclease, chất ức chế protease. Peptide kháng nấm đầu tiên được tách chiết từ B. subtilis là iturin và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng kháng nấm và tan huyết . Các chủn g Bacillus đã được biết đến với vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau như các chất kháng sinh , lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin. Một số chủng B. subtilis đã được ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra , chúng có phổ biến trong đất , chịu được nhiệt độ cao , sinh trưởng nhanh trong môi trường lỏng và có nhiều bào tử. Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hướng chủ yếu. Chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ưu việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả. Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh học đã được hình thành và phát triển ở Việt Nam nhưng vẫn còn nhiều hạn chế. Các chế phẩm dưới dạng tinh sạch tách chiết từ vi sinh vật mới nghiên cứu chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao. Các sản phẩm trên thị trường 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm chủ yếu là các sản phẩm có chứa tế bào vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn, hiệu quả không cao. Mặt khác, các sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy cơ gây bệnh rất lớn cho con người. Vì vậy, phát triển sản phẩm sinh hóa đạt độ tinh sạch cao để phòng chống nấm bệnh cây trồng là một vấn đề rất cấp thiết. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được chủng B. subtilis XL62 có khả năng ức chế mạnh các nấm gây bệnh cây trồng như F. oxysporum và R. solani. Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu ở Việt Nam, tôi đã thực hiện đề tài luận văn: "Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62, ứng dụng thử nghiệm chế phẩm BCF trên mô hình in vitro" trong khuôn khổ đề tài "Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm BCF phòng chống bệnh cây trồng do nấm Fusarium sp. và Rhizoctonia solani" do TS. Nguyễn Ngọc Dũng làm chủ nhiệm với các mục tiêu: (1) Tinh sạch được protein từ B. subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm, (2) Thử nghiệm khả năng ức chế F. oxysporum và R. solani của chế phẩm BCF trên mô hình in vitro. 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về chất đối kháng sinh trưởng nấm Chất đối kháng sinh trưởng nấm là những chất có khả năng ức chế sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của các loại nấm. Các chất này đã được ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng. Các protein và peptide có hoạt tính kháng nấm đều được tách chiết phần lớn từ động vật (Iijima et al., 1993; Wang, Ng, 2002), thực vật (Benhamou et al., 1993; Joshi et al., 1998; Lam et al., 2000), vi khuẩn (Delcambe et al., 1977; Kim, Chung, 2004; Moyne et al., 2004) và nấm (Lam, Ng, 2001; Wang, Ng, 2004). Trong các nguồn trên thì các chất AFC tách chiết từ đối tượng vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Bacillus được quan tâm đến nhiều nhất. Các chủng Bacillus có nhiều các đặc tính quý như: dễ nuôi cấy, phổ biến, sinh trưởng nhanh trong môi trường lỏng, cho nhiều bào tử và đặc biệt là chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất AFC cùng lúc. Các protein và peptide có khả năng kháng nấm được phân loại theo nhiều cách khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại đó là loại tác động vào vách tế bào nấm: ức chế sự tổng hợp chitin và glucan, loại tác động vào màng tế bào nấm: các chất gắn dính hay ức chế sự tổng hợp ergosterol của nấm và loại tác động vào quá trình tổng hợp protein và acid nucleic của nấm. Dựa trên cấu trúc hoặc chức năng, các protein và peptide có khả năng kháng nấm được phân loại thành nhiều lớp khác nhau, chẳng hạn như chitinase và chitinase-like protein (Benhamou et al., 1993; Lam et al., 2000), ribonuclease (Liu et al., 2007), chất ức chế protease (Joshi et al., 1998). Peptide kháng nấm đầu tiên được tách chiết từ chủng B. subtilis là iturin và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng kháng nấm và làm tan huyết (Latoud et al., 1986). B. subtilis cũng chính là đối tượng vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu đến nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tổng hợp rất nhiều các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và cho thấy tiềm năng trong việc kiểm soát các bệnh hại cây trồng do nấm gây ra cũng như trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm 1.2 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong kiểm soát sinh học 1.2.1 Đại cương về vi khuẩn B. subtilis 1.2.1.1 Lịch sử phát triển B. subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu , chủng được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của B. subtilis thì chúng mới được dùng để điều trị các bệnh về rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm, .... và đặc biệt là kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. 1.2.1.2 Đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: B. subtilis Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B. subtilis XL62 trên môi trường PDA 1.2.1.3 Đặc điểm phân bố Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước... Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu CFU/g. 1.2.1.4 Đặc điểm hình thái B. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước từ 0,5- 0,8 µm x 1,8- 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8- 12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào. kích thước từ 0,8- 1,8 µm. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, phóng xạ ... 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm 1.2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy Điều kiện phát triển khi nuôi cấy là môi trường hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 37C. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khí nhưng B. subtilis có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy. pH thích hợp nhất khi nuôi cấy với pH = 7,0- 7,4. Trên môi trường thạch đĩa: khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3- 5 mm. Sau 1- 4 ngày thì bề mặt nhăn và chuyển sang màu hơi sẫm (Hình 1.1). Trên môi trường thạch nghiêng: chủng dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng. Trên môi trường lỏng: chủng phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vấn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên. 1.2.2 Ứng dụng của các chủng Bacillus trong kiểm soát sinh học Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng Bacillus có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra . Một số chủng B. subtilis đã được ứng dụng để kiểm soát bệnh hại cây trồng , chúng có phổ biến trong đất , chịu được nhiệt độ cao , sinh trưở ng nhanh trong môi trường lỏng và có nhiều bào tử (Hwang, Chakravarty, 1992; Asaka, Shoda, 1996; Wulff et al., 2002; Okigbo, 2005). Các chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau như các chất kháng sinh, lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin (Peypoux et al., 1986; Ongena et al., 2005; Ongena, Jacques, 2008; Kim et al., 2010). Douville và cộng sự (1992) đã nghiên cứu ảnh hưởng và cơ chế tác động của vi khuẩn B. subtilis trên nấm Colletotrichum trifolii, tác nhân gây bệnh thán thư trên cỏ linh lăng (Medicago sativa) trong cả điều kiện in vivo và in vitro. Trong điều kiện nhiệt độ phòng, khi nghiên cứu tác động của dịch lọc tế bào của B. subtilis đã làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng trên cỏ linh lăng từ 56% xuống còn 16% và tương ứng từ 2,0 xuống 1,2. Trong điều kiện nghiên cứu in vitro, khi nghiên cứu tác động của dịch lọc thô lên men của chủng B. subtilis đã làm giảm mạnh sự nảy mầm của bào tử nấm gây bệnh. Hợp chất đã được tìm ra gây nên hiệu quả ức chế của vi khuẩn B. subtilis lên nấm C. trifolii là kháng sinh thuộc họ iturin, iturin D (Douville, Boland, 1992). 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm Kumar và cộng sự (2009) đã phân lập được chủng B. subtilis MTCC 8114 trong một số mẫu đất vườn, hoạt tính vòng ức chế nấm khi thử nghiệm bằng phương pháp cấy chấm điểm là 14- 16 mm và 22- 24 mm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch đối với nấm Microsporum fulvum và Trichophyton. Sau khi tối ưu môi trường nuôi cấy, đã tìm ra được nguồn dinh dưỡng là dịch chiết bột đậu tương, pH 7,0, nhiệt độ 37C và thời gian lên men 48 giờ là điều kiện thích hợp cho sản xuất kháng sinh của chủng vi khuẩn này. Phân tích dữ liệu phổ FITR đã xác định hợp chất thuộc nhóm pedtide kháng nấm, nồng độ ức chế tối thiểu MIC của kháng sinh kháng nấm là 135 145 µg/ml (Kumar et al., 2009). Bệnh thán thư do nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioides gây ra làm giảm năng suất và chất lượng đến nhiều loại cây trồng như hồ tiêu, quất, xoài và nhiều loại cây trồng khác, gây tổn thất nặng nề đến lợi ích thương mại trên thế giới. Trong quá trình phân lập một số chủng vi khuẩn từ đất, Kim và cộng sự (2010) đã tìm ra được chủng B. subtilis CMB32 có tiềm năng trong việc kiểm soát chủng nấm bệnh C. gloeosporioides, sử dụng phương pháp khối phổ MALDI-TOF để phân tích, kết quả đã cho thấy chủng B. subtilis CMB32 có khả năng sinh tổng hợp ra 3 loại peptide kháng nấm: iturin A, fengycin và surfactin A (Kim et al., 2010). Mendizabal và cộng sự (2012) đã tìm ra chủng B. subtilis CPA-8 có năng kiểm soát bệnh thối rễ do nấm bệnh Monilinia spp. gây ra trên cây đào. Thí nghiệm ức chế sự tăng trưởng bằng cách sử dụng hoạt chất từ dịch nuôi cấy tế bào được chiết xuất bằng butanol đã cho thấy kết quả ức chế mạnh đối với nấm M. laxa và M. fructicola. Hoạt chất kháng nấm từ chủng B. subtilis CPA-8 đã được xác định là fengycin, giống lipopeptide và có hoạt tính kháng nấm mạnh (Mendizábal et al., 2012). Yiu-Kowk và cộng sự (2012) đã phân lập được chủng B. subtilis D1/2 từ đất canh tác có khả năng ức chế nấm F. graminearum. Hoạt động kháng nấm của chủng vi khuẩn này do một loại polypeptide ngoại bào và đã được xác định là fengycin. Ứng dụng chủng vi khuẩn trên trồng ngô và lúa mì để kiểm soát bệnh thối tai và tàn rụi đầu do nấm Fusarium gây ra, kết quả là đối với lúa mì thì bệnh tàn rụi đầu đã được kiểm soát hoàn toàn, trên cây ngô thì bệnh thối tai đã giảm đi một nửa. Mặc dù chưa kiểm soát được triệt để trên cây ngô, nhưng có thể thấy chủng B. subtilis D1/2 có tiềm năng 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm rất lớn trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng và sản xuất chế phẩm kháng nấm (YiuKwok et al., 2012). Theo nghiên cứu gần đây nhất, Malfnova và cộng sự (2012) khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã phát hiện tới 8 loại hợp chất polypeptide mạch vòng có hoạt tính kháng nấm trong dịch chiết ngoại bào của chủng B. subtilis HC8. Dựa vào thời gian lưu và khối lượng phân tử, đã xác định được các hợp chất kháng nấm này đều thuộc 3 họ kháng sinh lớn đó là iturin, fengycin và surfactin. Trong đó thì họ kháng sinh fengycin cho kết quả tác động mạnh nhất đến việc ức chế sự phát triển của nấm đối kháng. B. subtilis HC8 được xác định là chủng đầu tiên có khả năng sinh tổng hợp ngoại bào cả 3 họ kháng sinh lớn, đây là chủng vi khuẩn có tiềm năng rất lớn trong kiểm soát dịch bệnh hại cây trồng do nấm gây nên (Malfanova et al., 2012). 1.3 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh trên thế giới Hàng năm trên thế giới, bệnh hại cây trồng gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2005 thì có khoảng 14% các khoản thiệt hại trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra, và hơn 50% các bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm (Agrios, 2005). Trong các loại bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tương đối lớn. Nấm bệnh gây bệnh chết héo mạch dẫn và bệnh thối thân, thối rễ, lở cổ rễ ở nhiều loại cây rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, đậu tương…(Kim, Chung, 2004). Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong nông nghiệp sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, dẫn đến mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật đất có ích, tạo môi trường bất lợi đối với các sinh vật có ích phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loài thiên địch có ích. Dư lượng thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại trên sản phẩm nông nghiệp và trên đất sẽ làm ô nhiễm vào nguồn nước ngầm, gây ra tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe của người và vật nuôi. Vì vậy ở một số nước phát triển, thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng (Gerhardson, 2002). 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học trong canh tác và bảo vệ cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Chế phẩm sinh học trong sản xuất nông nghiệp có nhiều ưu điểm: không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi, cân bằng sinh thái trong môi trường đất, không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất, tăng năng suất cây trồng, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác. Do những nguyên nhân trên mà con người quan tâm đặc biệt tới việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh. Hiện nay trên thế giới, các nghiên đều tập trung mạnh về hóa sinh, di truyền và bản chất của các hợp chất do vi sinh vật tạo ra có khả năng hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của các loại vi sinh vật có hại. 1.3.1 Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm Các chủng Bacillus Rất nhiều loài thuộc chi Bacillus đã được biết đến với khả năng sinh tổng hợp đa dạng về chức năng và cấu trúc các chất chuyển hóa thứ cấp. Việc sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính đối kháng vi sinh vật là một trong những yếu tố quyết định đến khả năng kiểm soát các bệnh hại cây trồng. Những chất chuyển hóa có thể là hợp chất ribosome như subtilin (Zuber et al., 1993), subtilosin A (Babasaki et al., 1985), TasA (Stover, Driks, 1999), và sublancin (Paik et al., 1998). Các peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome như họ surfactin: surfactin và lichenysin; họ kháng sinh iturin : iturin A, C, D, và E, bacillomycin D, F, L, và mycosubtilin; họ kháng sinh fengycin: fengicin và plipastatin; các aminopolyol như zwittermycin A (Sarangi et al., 2009). Trong chi Bacillus thì B. subtilis là loài có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại hoạt chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật nhất. Loài này thường tổng hợp các loại peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome (<2.000 Da) có hoạt tí nh kháng nấm , chẳng hạn như iturin (Stein, 2005; Christopher et al., 2011), surfactin (Carrillo et al., 2003; Ali et al., 2010), fengycin, bacilysin (Loeffler et al., 1986; Li et al., 2012), 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm bacillomycin (Peypoux et al., 1980), mycosubtilin (Peypoux et al., 1986), và mycobacillin (Sengupta et al., 1971). B. subtilis hầu như cũng sinh tổng hợp ra rất nhiều loại protein (Moyne et al., 2004; Liu et al., 2007). Tuy nhiên , một số ít trong tổng số các loại protein trên đã được công bố là có hoạt tí nh kháng nấm . Các chủng Pseudomonas, Burkholderia và các chủng khác Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trưởng nấm khác nhau. Nhiều chủng sinh tổng hợp các chất kháng sinh như phenazine, 2,4diacetylphloroglucinol, pyrrolnitrin, pyoluteorin, hoặc siderophore. Chủng P. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có hoạt tính kháng nấm. Syringomycin là các lipodepsipeptide nhỏ và trong số các peptide kháng nấm vi khuẩn tiềm năng đã được phát hiện ra. Syringomycin-E (SE) là peptide phổ biến nhất. SE diệt nấm A. flavus, A. fumigatus, A. niger, F. moniliforme, và F. oxysporum, giá trị LD95 đạt 7,8 µg/ml đối với A. flavus và các giá trị LD95 với 1,9 µg/ml đối với các chủng nấm khác (Segre et al., 1989; De Lucca et al., 1999). Chủng Burkholderia là một vi sinh vật đất phổ biến và rất nhiều chủng đã được phát hiện có khả năng sinh tổng hợp ra lượng lớn các chất AFC như cepacin, altericidin, pyrrolnitrin, xylocandin (còn được gọi là cepacidine). Cepacidine là các glycopeptide từ B. cepacia và có tác dụng cộng hưởng hơn là amphotericin B và hoạt động kháng nhiều nấm gồm Candida sp., A. niger, Cryptococcus neoforman, và F. oxysporum (Lee et al., 1994; Lim et al., 1994). Chủng Streptomyces tendae có khả năng sinh tổng hợp ra nikkomycin, không độc đối với tế bào động vật có vú, là một họ của các chất kháng nấm peptidyl nucleoside. Nikkomycin X và Z được sinh tổng hợp ở nồng độ ức chế tối thiểu (MICs) 0,77 và 0,1 µg/ml, tương ứng, kháng lại Coccidiodes immitis với MIC cao hơn 8 và 30 µg/ml, tương ứng, kháng lại Blastomyces dermatitidis (Hector et al., 1990). 1.3.2 Sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm Trên thực tế, đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật được thương mại hóa. Ballad là một chế phẩm từ chủng B. pumilus QST 2808 của hãng AgraQuest, là sản phẩm mới năm 2005, có thể sử dụng cho khoai tây, đậu tương, ngũ cốc.... B. pumilus sinh tổng hợp một hợp chất đường amino chống nấm mà ngăn sự hình thành 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm của các thành tế bào mới và làm rối loạn trao đổi chất tế bào, dẫn đến phá hủy tế bào và diệt thể gây bệnh cây trồng. Ballad cũng tạo ra các rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá, ngăn thể gây bệnh như nấm gây rỉ sắt và mốc sương từ khi hình thành trên thực vật. Thuốc này có phổ sử dụng rộng. Được ghi vào danh sách chất kiểm soát gỉ sắt (gồm cả gỉ sắt trên cây đậu tương châu Á), mốc sương, mốc lông tơ và bệnh bạc lá. 1.4 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu lại tập trung nhiều vào việc sản xuất các chế phẩm phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng dùng làm thuốc bảo vệ thực vật. Hầu hết các nghiên cứu đã thực hiện tập trung vào sản xuất các sản phẩm sinh học chứa các chủng nấm đối kháng (chủ yếu là các chủng Trichoderma) hoặc vi khuẩn đối kháng (chứa B. subtilis). Các chế phẩm thương mại phần lớn chứa các chủng nấm đối kháng ở dạng phân bón. 1.4.1 Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng trừ nấm bệnh Nghiên cứu biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã được quan tâm và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nước trong những năm vừa qua: Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện KH&CNVN), Viện Bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhưỡng và nông hóa (Bộ NN&PTNT), Đại học Nông lâm Tp HCM, Đại học Cần Thơ. Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật như Trichoderma (Trần Thị Thuần, 1997; Đào Kiều Dung, 1999; Nguyễn Kim Vân, 2003; Trần Thị Thuần et al., 2004), Bacillus (Nguyễn Ngọc Dũng et al., 2005; Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh, 2007; Trần Phương Thảo et al., 2007), Pseudomonas (Nguyễn Minh Anh et al., 2003; Nguyễn Ngọc Dũng et al., 2003; Nguyễn Thị Tuyết Nhung et al., 2004; Nguyễn Thị Tuyết Nhung et al., 2006) huỳnh quang và Serratia (Lê Thị Hồng Minh et al., 2005) đã được phân lập, tuyển chọn và được đánh giá là những tác nhân tiềm tàng cho phát triển các chế phẩm BCF để phòng chống nấm bệnh cây. Việc nghiên cứu ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây đã được thực hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt được những thành tựu sau: i) Sử dụng vi sinh vật đối kháng nấm như một sinh vật chức năng trong sản xuất sinh bón hữu cơ vi sinh; ii) Các 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm Trichoderma. Có vài chục công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma để phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng. Kết quả tìm biện pháp sinh học đề phòng trừ nấm R. solani bằng cách dùng nấm đối kháng Trichoderrna viride đã được nhóm nghiên cứu của Nguyễn Kim Vân thử nghiệm cho thấy: Nấm T. viride có hiệu lực ức chế cao nấm R. solani trong điều kiện phòng thí nghiệm và thí nghiệm bán đồng ruộng làm giảm mức độ thiệt hại của nấm R. solani gây bệnh thối cải bắp (Nguyễn Kim Vân, 2003). Có thể sử dụng chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma viride để phòng trừ bệnh lở cổ rễ hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh cao 86% (trên cây cà chua) và 78% (trên cây dưa chuột) trong điều kiện thí nghiệm chậu vại. Nấm đối kháng Trichoderma spp. có khả năng hạn chế sự phát sinh và gây hại của bệnh lở cổ rễ hại bông. Quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh lở cổ rễ hại bông có tác dụng hạn chế tốt khả năng phát sinh, phát triển và gây hại của nấm R. solani trong điều kiện vụ Đông xuân 2005/2006 tại Quảng Nam. Tỷ lệ cây chết do bệnh trên mô hình khoảng 1% nhưng đối chứng gần 20%. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, một số chủng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối kháng tốt đối với nấm R. solani; có hiệu quả đối kháng cao đối với nấm F. oxysporum gây bệnh trên cây bắp trên môi trường dinh dưỡng. Trong điều kiện nhà lưới, áp dụng Trichoderma spp. (HG02 & HG04), liều lượng (10 g/kg đất) có khả năng phòng trừ tốt bệnh đốm vằn trên cây lúa R. solani, tương tự áp dụng Trichoderma spp. (AG01 & HG02), liều lượng (10 g/kg đất) có khả năng phòng trừ tốt bệnh chết cây con trên bắp (R. solani). Đặc biệt, trong những năm qua, chế phẩm Antiforhis có tác dụng phòng chống bệnh thối rễ, lở cổ rễ cây trồng do nấm F. oxysporum và R. solani có nguồn gốc từ trong đất đã được phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các chủng P. fluorescens, P. chlororaphis và chủng B. pumilus tại Phòng vi sinh vật học đất, Viện CNSH. Chế phẩm đã được khảo nghiệm trên diện hẹp trong điều kiện in vivo tại Viện bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT); kết qủa cho thấy chế phẩm Antiforhis cho hiệu quả giảm bệnh gần bằng hoặc tương đương các hóa chất diệt nấm, tuỳ theo từng chất. Kết qủa khảo 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm nghiệm trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tưới chế phẩm Antiforhis đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối rễ trên cây dưa ăn qủa các loại, cây cải bắp, cây cà chua và cây ớt ngọt. Hiện nay, chế phẩm Antiforhis đã được đăng ký giấy phép sử dụng. Một vài công bố đề cập tới sản phẩm trao đổi chất của tế bào có hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm bệnh cây, như chất iturin từ Bacillus. Trong thời gian qua, tại Phòng vi sinh vật học đất (Viện CNSH), một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm Burkholderia và Chryseomonas đã được phân lập từ các mẫu vật khác nhau ở Việt Nam. Thử khả năng đối kháng nấm F. oxysporum và R. solani của các chủng này đã được tiến hành. Kết quả cho thấy, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các chất ngoại bào với hoạt lực ức chế sinh trưởng hay nẩy mầm của bào tử nấm rất mạnh. Mặc dù vậy, các chủng này không thể sử dụng ở dạng tế bào để làm tác nhân phòng chống nấm bệnh cây, do các nhà khoa học nhận thấy, sự tương đồng về di truyền giữa chủng B. cepacia có nguồn gốc từ bệnh nhân và chủng có nguồn gốc từ đất tự nhiên là 100%. Cũng vì lý do này, ở Mỹ, bắt đầu từ năm 2004, tất cả các giấy phép sử dụng các chủng B. cepacia và các sản phẩm chứa B. cepacia đều bị thu hồi. Năm 2006, hai bệnh nhân bị tử vong đầu tiên trên thế giới do nhiễm vi khuẩn Chryseomonas ở Maroc đã được tổ chức Y tế thế giới thông báo. Tuy vậy, các chủng như vậy rất có ý nghĩa công nghệ sinh học bởi những đặc tính hữu ích của chúng, nếu con người biết cách khai thác. 1.4.2 Nghiên cứu sản xuất và thương mại các chế phẩm phòng trừ nấm Ngoài những chế phẩm sinh học đã được sản xuất hàng loạt và thương mại hóa, hiện nay nhiều đề tài nghiên cứu và dự án vẫn đang được thực hiện để tìm ra và thử nghiệm các chế phẩm sinh học khác có khả năng phòng trừ nấm gây hại cây trồng có hiệu quả cao. Khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường ĐH Cần Thơ đã công bố 2 chế phẩm sinh học Biobac và Biosar để phòng trừ bệnh đốm vằn và cháy lá thường gặp trên lúa. Biobac được sản xuất từ một chủng vi khuẩn có sẵn ở địa phương, có khả năng tiêu diệt và ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh đốm vằn. Biosar là sản phẩm được chiết xuất từ một số loài thực vật, có khả năng kích thích tính kháng bệnh 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn