Tài liệu Thử nghiệm sản xuất phôi bò in vitro xác định trước giới tính

Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ************ LÊ CÔNG THIỆN THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT PHÔI BÒ IN VITRO XÁC ĐỊNH TRƯỚC GIỚI TÍNH Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2006 – 2008 Mã số ngành: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 i CÔNG TRÌNH NÀY ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. CHUNG ANH DŨNG ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... Cán bộ chấm nhận xét 1: ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... Cán bộ chấm nhận xét 2: ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, Ngày….tháng….năm 2008 ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc TP.HCM, Ngày ….tháng….năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: LÊ CÔNG THIỆN Phái: Nam Sinh ngày: 13/01/1983 Nơi sinh: Cần Thơ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106685 Năm trúng tuyển: 2006 1. TÊN ĐỀ TÀI: “Thử nghiệm sản xuất phôi bò in vitro xác định trước giới tính” 2. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG • Thu nhận buồng trứng từ lò mổ, chọc hút trứng và nuôi trứng trưởng thành. • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của nhiệt độ, loại tinh sử dụng đến tỷ lệ trứng trưởng thành, tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm và phát triển của phôi. • Đông lạnh phôi để bảo quản theo phương pháp thủy tinh hóa. 3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày …..tháng ….. năm 2008 4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày …. tháng …… năm 2008 5. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Học hàm, học vị, họ tên và chữ ký) Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua. Ngày….tháng….năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi cảm ơn đến Giám Hiệu Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức chuyên môn, những kinh nghiệm thực tiễn quý báu cho tôi trong suốt những năm tháng học cao học tại trường. Đặc biệt tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến thầy TS. Chung Anh Dũng, trưởng phòng Công Nghệ Sinh Học thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, đã hướng dẫn, tạo điều kiện, giúp đỡ, cho tôi nhiều kinh nghiệm quý giá trong lúc làm đề tài tại viện để tôi có thể hoàn thành được luận văn thạc sĩ này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em làm việc cùng phòng, đặc biệt là chị Ngọc Minh, chị Quỳnh Lan đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng lớp cao học ngành Công Nghệ Sinh Học trong những tháng ngày cùng học bên nhau, cùng trao đổi kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn bên con, hy sinh nhiều cho con trong cuộc sống này. Tp. HCM, ngày 30 tháng 11 năm 2008 Lê Công Thiện iv TÓM TẮT Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) áp dụng trong chăn nuôi đã và đang được sử dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Kỹ thuật IVF được sử dụng trong chăn nuôi nhằm gia tăng nhanh số lượng đàn gia súc, khai thác được tiềm năng di truyền của cả con đực lẫn con cái. Ngoài ra nó còn cung cấp vật liệu phôi với số lượng nhiều cho các nhà nghiên cứu với những nghiên cứu khác nhau. Kỹ thuật IVF kết hợp với một số phương pháp xác định giới tính của phôi đã trở thành công cụ đắc lực cho các nhà chọn giống trong chăn nuôi nhằm tạo ra những đàn gia súc biết trước giới tính mong muốn. Để tạo ra được những phôi biết trước giới tính, người ta có thể sử dụng các phương pháp như PCR với cặp mồi chuyên biệt, phương pháp phân tích thể nhiễm sắc…Đa số các phương pháp trên đều làm ảnh hưởng đến phôi do phải cắt một phần của phôi để phân tích, ngoài ra có những phương pháp đòi hỏi phải có những thiết bị đắt tiền như kính hiển vi vi thao tác dùng để cắt phôi. Trong đề tài này, chúng tôi dùng loại tinh đông lạnh đã được phân loại mang nhiễm sắc thể giới tính X nhằm tạo ra những phôi bò mang cặp nhiễm sắc thể giới tính XX. Thí nghiệm được tiến hành như sau: - Thu nhận buồng trứng tại lò mỗ và tiến hành bảo quản buồng trứng ở 3 loại nhiệt độ 37oC, nhiệt độ phòng, nhiệt độ 10oC trong 5 tiếng (đối với nhiệt độ bảo quản ở 37oC và nhiệt độ môi trường) và 16 tiếng (đối với nhiệt độ 10oC) nhằm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng lên tỷ lệ thụ tinh và phát triển của phôi. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng loại tinh bình thường chưa phân loại giới tính. - Tiến hành thụ tinh với hai loại tinh bình thường và tinh đã phân loại giới tính để so sánh tỷ lệ thụ tinh và phát triển phôi của hai loại tinh. - Thử nghiệm đông lạnh phôi theo phương pháp thủy tinh hóa. Kết quả chúng tôi thu được như sau: 1. Kết quả tỷ lệ trưởng thành của trứng (IVM) ở thí nghiệm bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ môi trường với khoảng thời gian bảo quản 5 giờ là 77.65%, ở nhiệt độ v 37oC với khoản thời gian bảo quản 5 giờ là 68.5%, ở nhiệt độ 10oC với thời gian bảo quản trong 16 giờ là 68.31%. Sự sai khác có ý nghĩa giữa nhiệt độ bảo quản môi trường và nhiệt độ 37oC, giữa nhiệt độ bảo quản môi trường và nhiệt độ 10oC với P < 0.05. Sự sai khác giữa nhiệt độ bảo quản ở 37oC và 10oC là không có ý nghĩa với P > 0.05. 2. Tỷ lệ thụ tinh (IVF) ở nhiệt độ bảo buồng trứng ở 37oC là 25.85%, ở nhiệt độ môi trường là 27.17%, ở nhiệt độ 10oC là 6.02%. Sự sai khác có ý nghĩa giữa nhiệt độ bảo quản ở nhiệt độ môi trường và nhiệt độ 37oC là không có ý nghĩa về mặt thống kê với P > 0.05. Sự sai khác giữa nhiệt độ bảo quản ở 37oC và 10oC, ở nhiệt độ môi trường và nhiệt độ 10oC là có ý nghĩa về mặt thống kê với P < 0.001. 3. Kết quả sự phát triển của phôi (IVC) cho thấy, ở nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ môi trường, số phôi phát triển đến giai đoạn 2 tế bào là 27.66%, giai đoạn 4 tế bào là 21.28%, giai đoạn 8 tế bào là 25.53%, giai đoạn phôi dâu là 17.02%, giai đoạn phôi nang là 8.51%. Đối với thí nghiệm bảo quản buồng trứng ở 37oC, số phôi phát triển đến giai đoạn 2 tế bào là 13.16%, giai đoạn 4 tế bào là 52.63%, giai đoạn 8 tế bào là 28.95%, giai đoạn phôi dâu là 5.26%, không ghi nhận có sự phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang. Đối với thí nghiệm bảo quản buồng trứng ở 10oC, số phôi phát triển đến giai đoạn 2 tế bào là 60%, giai đoạn 4 tế bào là 30%, giai đoạn 8 tế bào là 10%, không ghi nhận sự phát triển của phôi ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang. 4. Ở thí nghiệm ảnh hưởng của loại tinh sử dụng lên tỷ lệ thụ tinh và phát triển của phôi: Tỷ lệ thụ tinh ở loại tinh giới tính là 25.33%, tinh thường là 27.17%. Sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P > 0.05. Kết quả IVC ở tinh giới tính cho thấy: Các phôi phát triển ở giai đoạn 2 tế bào là 15.79%, ở giai đoạn 4 tế bào là 21.05%, ở giai đoạn 8 tế bào là 21.05%, ở giai đoạn phôi dâu là 42.11%, không ghi nhận có sự phát triển của phôi ở giai đoạn phôi nang. Trong khi đó ở loại tinh bình thường cho thấy: số phôi phát triển đến giai đoạn 2 tế bào là 27.66%, giai đoạn 4 tế bào là 21.28%, giai đoạn 8 tế bào là 25.53%, giai đoạn phôi dâu là 17.02%, giai đoạn phôi nang là 8.51%. vi 5. Thử nghiệm đông lạnh được 2 phôi giới tính ở giai đoạn phôi dâu, tuy nhiên các phôi này sau khi rã đông và tiếp tục nuôi thì không phát triển tiếp đến giai đoạn phôi nang. Qua các thí nghiệm trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: -Nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ môi trường trong vòng 5 giờ thích hợp cho sự trưởng thành của trứng in vitro, tỷ lệ thụ tinh và phát triển của phôi. -Việc sử dụng loại tinh giới tính không ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh so với loại tinh bình thường. Tuy nhiên sự phát triển của phôi thì kém hơn so với thí nghiệm sử dụng loại tinh bình thường. vii SUMMARY The in vitro fertilization technique (IVF) has been applied in husbandry in many coutries. This techque aimes at increasing the animal number in the herd and exployed the genetic potential of both male and female animal. Besides, it also supplies the materials for the scientists in other researches. The IVF combined with the sex-determining techniques has become the powerful tool for the breeder to select the animals with desirable sex. In oder to produce the sexed embryos, some methods have been used such as PCR with specific primers, chromosome analysis..Unfortunately, these techniques cause harmful to the embryos due to the partly cleavage of the embryos for analyzing. Furthermore, They requires some expensive instruments such as micro-manipulating microscope to cleave the embryos. In this thesis, we used freezing sex-sorted sperm in oder to produce sexed embryos. The experiment was conducted as following: -Collecting the ovaries at the slaughter house and storing at 3 different kinds of temperature: 37oC, environment temperature (ET) in 5 hours and 10oC in 16 hours. In this experiment, we used the freezing unsorted sperm. - Conducting the IVF with freezing sorted sperm and unsorted sperm. - Conducting the cryopreservation of embryos with the vitrification method. The results were showed as follow: 1. The maturation rate of oocytes from ovaries stored at environment temperature was 77.65%, at 37oC was 68.5% and at 10oC was 68.31%. The difference was significant beetween environment temperature and 37oC storing experiment, between environment temperature and 10oC storing experiment. But the maturation rate between 37oC and 10oC storing experiment was not significantly different. 2. The in vitro fertilization rate of ovaries stored at 37oC was 25.85%, at environment temperature was 27.17% and at 10oC was 6.02%. These rate was significantly different between environment temperature and 10oC storing viii experiment , betweent 37oC and 10oC storing experiment with P < 0.001. But the environment and 37oC storing experiment was not significantly different. 3. The embryos development rates showed that: at the environment temperature storing experiment the number of embryos developed to the 2 cell stage was 27.66%, the 4 cell stage was 21.28%, the 8 cell stage was 25.53%, the morula stage was 17.02%, the blastocyst stage was 8.51%. At the 37oC storing experiment, the number of embryos developed to the 2 cell stage was 13.16%, the 4 cell stage was 52.63%, the 8 cell stage was 28.95%, the morula stage was 5.26%, and there was no embryos at blastocyst stage. At the 10oC storing experiment, the number of embryos developed to the 2 cell stage was 60%, the 4 cell stage was 30%, the 8 cell stage was 10% and there no embryos developed to the morula and blastocyst stage. 4. The results of the experiment using two kind of sperm (sorted and unsorted) showed that: The IVF rate was 25.33% when using the freezing sorted sperm and 27.17% when using the freezing unsorted sperm. These rates were not significantly different. The result of IVC (in vitro culuture) showed that: At the experiment using sorted sperm, the number of embryos developed to the 2 cell stage was 15.79%, the 4 cell stage was 21.05%, the 8 cell stage was 21.05%, the morula stage was 42.11% and there was no embryo developed to the blastocyst stage. At the experiment using unsorted sperm showed that: the number of embryos developed to the 2 cell stage was 27.66%, the 4 cell stage was 21.28%, the 8 cell stage was 25.53%, the morula stage was 17.02% and the blastocyst stage was 8.51% 5. The result of cryopreservation showed that 2 embryos that had been cryopreserved had a quite normal appearance. But these 2 embryos stopped developing when cultured. We concluded that the environment temperature storage in 5 hours is suitable for the maturation of oocytes in vitro, the in vitro fertilization rate, the development of embryos. There is no difference between experiment using the sex sorted sperm and unsorted sperm at the IVF rate, but the IVC development was higher at the experiment using the unsorted sperm. ix MỤC LỤC Phần I: MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu .........................................................................................................2 1.3 Nội Dung........................................................................................................2 Phần II:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thụ tinh trong ống nghiệm.............................................................................3 2.1.1 Các phương pháp thụ tinh in vitro ..............................................................3 2.2 Sơ lược lịch sử của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)..............5 2.3 Môi trường nuôi cấy phôi...............................................................................6 2.3.1 Nước............................................................................................................6 2.3.2 Các ion ........................................................................................................6 2.3.3 Carbohydrate ...............................................................................................7 2.3.4 Các amino acid............................................................................................7 2.3.5 Vitamin........................................................................................................8 2.3.6 Tiền chất của nucleic acid ...........................................................................8 2.3.7 Chelators .....................................................................................................9 2.3.8 Các chất chống oxi hóa ...............................................................................10 2.3.9 Kháng sinh ..................................................................................................10 2.3.10 Protein .......................................................................................................11 2.3.11 Hormone và các yếu tố tăng trưởng ..........................................................11 2.3.12 Hệ đệm ......................................................................................................11 2.4 Noãn bào và sự trưởng thành của noãn bào ...................................................12 2.5 Đánh giá kết quả thụ tinh ...............................................................................15 2.6. Đánh giá phân loại phôi ................................................................................18 2.6.1. Cơ sở đánh giá phân loại............................................................................18 2.6.2. Đánh giá phân loại phôi theo giai đoạn phát triển .....................................20 2.6.3. Đánh giá phân loại phôi theo chất lượng phôi ...........................................20 2.6.4. Phôi có thể sử dụng được...........................................................................21 x 2.7 Các phương pháp xác định giới tính của phôi ...............................................22 2.7.1 Phương pháp di truyền tế bào .....................................................................22 2.7.1.1 Xác định thể Barr .....................................................................................22 2.7.1.2 Phân tích nhiễm sắc thể trong tế bào phôi ...............................................23 2.7.2 Phương pháp miễn dịch học........................................................................25 2.7.3 Phương pháp PCR với dấu hiệu phân tử DNA đặc trưng của thể nhiễm sắc Y .............................................................................26 2.7.4 Tinh trùng phân loại giới tính .....................................................................27 2.8 Phương pháp đông lạnh phôi .........................................................................29 2.9 Các nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực của đề tài .....................36 2.9.1 Các nghiên cứu ngoài nước.........................................................................36 2.9.2 Các nghiên cứu trong nước .........................................................................40 Phần 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu ...........................................................................................................42 3.1.1 Buồng trứng bò ...........................................................................................42 3.1.2 Tinh bò đông lạnh .......................................................................................42 3.2 Dụng cụ và thiết bị cần thiết ..........................................................................42 3.2.1 Dụng cụ thu mẫu buồng trứng tại lò mổ .....................................................42 3.2.2 Dụng cụ thu dịch nang trứng.......................................................................42 3.2.3 Dụng cụ dùng cho việc tìm trứng và rửa trứng...........................................43 3.2.4 Dụng cụ nuôi trứng trưởng thành và thụ tinh .............................................43 3.2.5 Thiết bị ........................................................................................................43 3.3 Hóa chất .........................................................................................................43 3.4 Phương pháp nghiên cứu................................................................................44 3.4.1 Thu mẫu trứng bò tại lò mổ.........................................................................44 3.4.2 Thí nghiệm bảo quản buồng trứng ở các nhiệt độ khác nhau .....................45 3.4.2.1 Bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ 37oC....................................................45 3.4.2.2 Bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ phòng..................................................45 3.4.2.3 Bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ 10oC....................................................45 xi 3.4.2.4 Chọc hút trứng tại phòng thí nghiệm .......................................................45 3.4.3 Giai đoạn nuôi trứng trưởng thành..............................................................46 3.4.4 Thụ tinh trong ống nghiệm..........................................................................47 3.4.4.1 Chuẩn bị tinh dịch (hoạt hóa tinh dịch)....................................................47 3.4.4.2 Thụ tinh trong ống nghiệm.......................................................................49 3.4.5 Nuôi cấy phôi ..............................................................................................49 3.4.5.1 Nuôi trứng thụ tinh trên môi trường Cr1aa có bổ sung 5% FBS .............49 3.4.5.2 Kiểm tra giai đoạn phát triển đầu tiên......................................................49 3.4.5.3 Kiểm tra sự phát triển đến phôi nang.......................................................50 3.4.6 Đông lạnh phôi bò bằng phương pháp thủy tinh hóa..................................50 3.4.6.1 Chuẩn bị thành phần của các dung dịch thủy tinh hóa ............................50 3.4.6.2 Giai đoạn cân bằng...................................................................................50 3.4.6.3 Load vào cọng rạ......................................................................................50 3.4.6.4 Nhúng vào nitơ lỏng.................................................................................51 4. Phân tích số liệu ...............................................................................................51 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản trứng lên sự trưởng thành của trứng.....................................................................................................52 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản trứng lên tỷ lệ thụ tinh và phát triển của phôi ..........................................................................................56 4.3 Ảnh hưởng của loại tinh sử dụng lên tỷ lệ thụ tinh và phát triển của phôi....63 4.4. Thử nghiệm đông lạnh phôi theo phương pháp thủy tinh hóa......................66 Phần v: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận ..........................................................................................................68 5.2 Đề Nghị ..........................................................................................................68 Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................69 Phụ Lục 1 .............................................................................................................71 Phụ Lục 2 .............................................................................................................85 Phụ Lục 3 .............................................................................................................94 xii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Kết quả nghiên cứu thành công IVF lần đầu tiên trên các đối tượng khác nhau.......................................................................................5 Bảng 2.2. Trình tự phát triển của phôi bò ............................................................20 Bảng 2.3. Phân loại phôi theo 4 mức độ A, B, C, D ............................................21 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và nhiệt độ môi trường lên sự trưởng thành của trứng sau 24 giờ nuôi cấy ......................54 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 25oC (nhiệt độ môi trường) và 10oC lên sự trưởng thành của trứng sau 24 giờ nuôi cấy.......55 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và nhiệt độ môi trường lên tỷ lệ thụ tinh............................................................................57 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và nhiệt độ môi trường lên sự phát triển của phôi ....................................................58 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ môi trường và nhiệt độ 10oC lên tỷ lệ thụ tinh ............................................................59 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở nhiệt độ môi trường và nhiệt độ 10oC lên sự phát triển của phôi ..............................................................60 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và 10oC lên tỷ lệ thụ tinh....................................................................................................61 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và 10oC lên sự phát triển của phôi ............................................................................62 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của loại tinh sử dụng lên tỷ lệ thụ tinh ...........................63 xiii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và nhiệt độ môi trường lên sự trưởng thành của trứng sau 24 giờ nuôi cấy ........53 Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và 10oC lên sự trưởng thành của trứng sau 24 giờ nuôi cấy .....................................54 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 25oC và 10oC lên sự trưởng thành của trứng sau 24 giờ nuôi cấy .............................................55 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và nhiệt độ môi trường lên tỷ lệ thụ tinh (IVF) ........................................................57 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và nhiệt độ môi trường lên sự phát triển của phôi (IVC)..........................................59 Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 25oC và 10oC lên tỷ lệ thụ tinh (IVF) ................................................................................60 Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 25oC và 10oC lên sự phát triển của phôi (IVC).................................................................61 Biểu đồ 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và 10oC lên tỷ lệ thụ tinh (IVF)...........................................................................61 Biểu đồ 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng ở 37oC và 10oC lên sự phát triển của phôi (IVC).............................................................62 Biểu đồ 4.10. Ảnh hưởng của loại tinh sử dụng lên tỷ lệ thụ tinh .......................64 Biểu đồ 4.11. Ảnh hưởng của loại tinh sử dụng lên sự phát triển của phôi.........65 xiv DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Buồng trứng và cấu tạo buồng trứng ....................................................... 12 Hình 2.3. Trứng trưởng thành với sự xuất hiện thể cực thứ I ..............................13 Hình 2.4. Trứng được thụ tinh với sự xuất hiện của thể cực thứ 2 ......................14 Hình 2.5. Sự hình thành tiền nhân của trứng được thụ tinh.................................16 Hinh 2.6. Các giai đoạn phát triển của phôi.........................................................19 Hình 2.7. Sự phân tách tế bào theo phương pháp flow cyometry........................28 Hình 3.1. Trứng được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý 0.9% .........45 Hình 3.2. Thao tác chọc hút trứng từ buồng trứng...............................................46 Hình 3.3. Trứng chưa trưởng thành biều hiện qua các tế bào cumulus chưa giãn nỡ ..........................................................................................47 Hình 3.4. Trứng trưởng thành với tế bào cumulus giãn nở..................................47 Hình 3.5. Ly tâm 1.800 vòng/phút trong 5 phút ..................................................48 Hình 3.6. Tinh trùng được xác định nồng độ bằng máy đo mật độ tinh..............48 Hình 3.7 Phương pháp load phôi vào cọng rạ......................................................51 Hình 4.1 Trứng trưởng thành với sự giản nỡ của lớp tế bào cumulus xung quanh…………… .....................................................................................52 Hình 4.2. Trứng chưa trưởng thành sau 24 giờ nuôi cấy, biểu hiện qua lớp bào cumulus bao quanh bên ngoài chưa giãn nỡ ........................................................52 Hình 4.3 Trứng được thụ tinh bên cạnh trứng không được thụ tinh sau 48 giờ kiểm tra........................................................................................56 Hình 4.4 Kết quả tạo phôi nang từ thí nghiệm bảo quản buồng trứng ở 25oC ....58 Hình 4.5 Phôi được tạo từ tinh giới tính đang ở giai đoạn phôi dâu ............................. 65 Hình 4.6 Phôi sau khi giải đông và tiếp tục được nuôi cấy ................................67 Hình 4.7 Phôi sau khi giải đông đang tiêu biến sau 24giờ nuôi cấy....................67 1 Phần I: MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu Phương pháp tạo phôi bò in vitro được áp dụng ở đây cũng tương tự như những phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm khác dùng tinh đông lạnh trong cọng rạ. Điểm khác biệt so với các phương pháp khác là chúng tôi dùng loại tinh đông lạnh đã được phân tách để cho cọng rạ chỉ chứa loại tinh trùng mang nhiễm sắc thể giới tính X. Phương pháp sử dụng loại tinh đã được phân tách nhiễm sắc thể cũng có những ưu điểm và nhược điểm. Ưu điểm là không cần phải xác định giới tính sau khi phôi được tạo ra như những phương pháp dùng loại tinh chưa phân tách. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là hoạt lực tinh trùng khá yếu do quá trình phân tách đã làm ảnh hưởng đến sức sống của tinh và mật độ tinh cũng rất thấp so cọng tinh chưa được phân tách. Tại Việt Nam, các nghiên cứu từ trước đến nay cũng chú trọng đến việc xác định giới tính của phôi trước khi thực hiện kỹ thuật cấy truyền phôi. Tuy nhiên, kỹ thuật sử dụng phổ biến vẫn là cắt (hoặc chọc hút) 1 phần của phôi để xác định giới tính bằng PCR. Nhược điểm của phương pháp này là phần phôi còn lại bị giảm khả năng sống. Đồng thời để thực hiện phương pháp này đòi hỏi phải có một số thiết bị đắt tiền như: kính hiển vi vi thao tác (micro-manipulation) dùng để cắt phôi; máy PCR dùng để xác định giới tính phôi. Trong khi đó, đề tài nghiên cứu này sẽ sử dụng loại tinh dịch chỉ chứa tinh trùng mang NST X, vì vậy nếu phôi (IVF) được tạo thành, chúng ta có những phôi với giới tính đã được xác định. Mặc dù loại tinh dịch chỉ chứa tinh trùng mang NST X có giá đắt hơn 10 lần so với loại tinh bình thường (50 USD so với 5 USD, tương ứng), nhưng vẫn rất có giá trị kinh tế nếu so với việc đầu tư hơn 1 tỷ đồng mua thiết bị để xác định giới tính của phôi. Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp này để chủ động biết trước giới tính của phôi, điều này còn giúp cải thiện đáng kể khả năng sống của phôi, bởi vì phôi vẫn được giữ gìn nguyên vẹn hình dạng (không bị cắt bớt để xác định giới tính). Như vậy, có 2 thể xem đây là sự sáng tạo của đề tài, vừa tiết kiệm được chi phí cần thiết cho nghiên cứu mà vẫn đạt mục tiêu đề ra. 1.2 Mục tiêu Mục tiêu của thí nghiệm là tạo được những phôi bò xác định trước giới tính, đồng thời xem xét tỉ lệ trứng nuôi tới giai đoạn thành thục (maturity) và thụ tinh tạo hợp tử ở các giai đoạn 2, 4, 6,8 …tế bào và giai đoạn phôi dâu, phôi nang (blastocyst). Đồng thời đề tài cũng tiến hành đông lạnh phôi để bảo quản lâu dài cho những mục đích sau này. 1.3 Nội Dung 1. Thu nhận buồng trứng từ lò mổ, chọc hút trứng và nuôi trứng trưởng thành. 2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản buồng trứng, loại tinh sử dụng đến tỷ lệ trứng trưởng thành, tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm và phát triển của phôi. 3. Đông lạnh phôi để bảo quản theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification). 3 Phần II:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thụ tinh trong ống nghiệm [18] Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí nghiệm (trong hộp lồng, đĩa petri, ống nghiệm). Tuy xảy ra bên ngoài, nhưng các điều kiện cho quá trình thụ tinh trong ống nghiệm như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố dinh dưỡng…cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình thường giống như trong cơ thể mẹ. 2.1.1 Các phương pháp thụ tinh in vitro a. Thụ tinh trong ống nghiệm 5ml Thích hợp hơn cả cho việc thụ tinh in vitro là ống ly tâm nhựa 5ml với nắp mở được vặn lỏng, điều này giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Thông thường tỷ lệ thụ tinh IVF tối ưu với một trứng/ ống nghiệm trong 0,5ml môi trường và 50.000 tinh trùng di động. Khó khăn duy nhất của kỹ thuật này là muốn kiểm tra sự thụ tinh cần phải chuyển mẫu sang một đĩa khác (một giếng hay bốn giếng) b. Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng Thêm một thể tích huyền phù tinh trùng đã đo trước vào mỗi giếng của đĩa bốn giếng (hay đĩa một giếng) với nồng độ tinh trùng là 100.000 tinh trùng di động tiến thẳng trên một giếng. Theo truyền thống, các trứng đã thụ tinh sẽ được ủ qua đêm cùng với tinh trùng đã được hoạt hoá, tuy nhiên sự gắn tinh trùng vào màng zona xảy ra từ một đến ba giờ khi bắt đầu ủ và do đó trứng có thể được rửa để loại bỏ tinh trùng thừa sau ba giờ ủ. Hạn chế của hệ thống này là không thể cho nhiều hơn 0,5ml môi trường trong mỗi giếng, trong khi đó nồng độ tinh trùng sử dụng cho một trứng ít nhất phải là 50.000 tinh trùng/trứng, nên khó thực hiện được đối với mẫu có số lượng tinh trùng ít. 4 c. Thụ tinh trong mao quản và cọng rạ Phương pháp này có ưu điểm tiết kiệm được trứng cũng như tinh trùng, đặc biệt trong trường hợp vô sinh do yếu tố tinh trùng, bởi tinh trùng và trứng được ủ trong thể tích nhỏ. Lần đầu tiên, Ranoux và Seibel đã sử dụng một cọng rạ có thể tích nhỏ để đồng ủ tinh trùng và trứng, sau đó ủ cọng rạ trong âm đạo. Do vậy kỹ thuật này còn gọi là nuôi cấy trong âm đạo. Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt được trong các ống mao quản (và cọng rạ sử dụng trong đông lạnh) với thể tích 5-10µl có thể chứa 2.000 đến 4.000 tinh trùng di động. Sau đó, Hammitt và cộng sự cũng đạt được tỷ lệ thụ tinh tốt với thể tích từ 10 - 150µl. Nội dung của phương pháp này là huyền phù trứng và tinh trùng được hút vào cọng rạ (hay ống mao quản) bằng syringe có gắn một adaptor. Các ống mao quản được làm bằng thủy tinh nên có thể dùng parafin lỏng để kiểm soát sự dao động làm thay đổi áp suất thẩm thấu. Huyền phù trứng và tinh trùng trong cọng rạ được bảo vệ bởi các khoảng môi trường, ngăn cách xen kẽ với các bóng không khí. Cả ống mao quản và cọng rạ được ủ trong điều kiện nhiệt độ 37oC, 5% CO2. Sau khi thụ tinh dùng pipette đẩy hết dung dịch chứa trong ống mao quản (hay cọng rạ) vào trong đĩa một hay bốn giếng để kiểm tra. Rửa nhiều lần cọng rạ (hay các ống mao quản) nếu không thấy trứng nằm trong đĩa. d. Thụ tinh trong vi giọt Phương pháp IVF phổ biến nhất là đưa các phức hợp trứng vào một vi giọt đã được chuẩn bị sẵn từ 20-50µl huyền phù tinh trùng dưới lớp dầu khoáng. Điều này có nhiều thuận lợi: kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu môi trường bởi thể tích nhỏ và số lượng tinh trùng ít (2.000- 5.000), rất hữu ích cho những trường hợp mẫu ít tinh trùng. Khó khăn chính yếu là yêu cầu người thao tác phải có kinh nghiệm. Các vi giọt có thể được chuẩn bị trong đĩa petri nhỏ, các đĩa một hay bốn giếng vô trùng. Dầu khoáng hay paraffin lỏng đều có thể được sử dụng, tuy nhiên phải kiểm tra kỹ về tính gây độc và gây sốc. Dầu khoáng phải được cân bằng hóa lý trong 24giờ ở 37oC và 5% CO2 trước khi sử dụng. 5 Các tinh trùng được chuẩn bị bằng phương pháp swim up hay ly tâm trên percoll, sau đó ly tâm tiếp tục và chỉnh về nồng độ 5.000 tinh trùng di động trong 50µl. Các đĩa sau đó được đặt trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. 2.2 Sơ lược lịch sử của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) [6] Năm 1959 Chang là người đầu tiên thu nhận được con thỏ bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF). Ở người hơn 1.000 đứa trẻ đã ra đời bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm kể từ khi thí nghiệm thành công của Steptoe và Edwards’s vào năm 1978. Ở nước Nhật, nhóm nghiên cứu tại bệnh viện đại học Tohoku đã thành công kỹ thuật IVF vào năm 1983. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm ứng dụng trên bò thành công bởi Bracket vào năm 1982. Ngày nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên khắp thế giới Bảng 2.1: Kết quả nghiên cứu thành công IVF lần đầu tiên trên các đối tượng khác nhau Tên tác giả nghiên cứu Đối tượng được nghiên cứu Chang (1959) Thỏ Whittingham (1968) Chuột (thai 17 ngày tuổi) Toyoda & Chang (1974) Chuột rattus Steptoe & Edwards (1978) Người Bracket và cộng sự (1982) Bò cái Hanada (1985) Dê Hanada (1985) Cừu Cheng và cộng sự (1986) Heo