Tài liệu Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo chaetoceros gracillis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất biodiesel

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ------------------ NGUYỄN LÊ KỲ PHÁN THỬ NGHIỆM NHÂN NUÔI VI TẢO Chaetoceros gracillis QUY MÔ 1m3 PHỤC VỤ SẢN XUẤT BIODIESEL CHUYÊN NGÀNH MÃ SỐ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : 60. 42. 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HCM, THÁNG 8 NĂM 2015 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI CƠ SỞ NUÔI TÔM GIỐNG KHU VỰC HẢI ĐĂNG – TP. VŨNG TÀU Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ THUÝ ÁI Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. NGUYỄN TẤN TRUNG Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. HOÀNG KIM ANH Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. HCM ngày 08 tháng 08 năm 2015 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1. Chủ tịch hội đồng: PGS. TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG 2. Cán bộ phản biện 1: TS. NGUYỄN TẤN TRUNG 3. Cán bộ phản biện 2: TS. HOÀNG KIM ANH 4. Uỷ viên hội đồng: PGS. TS. LÊ THỊ THUỶ TIÊN 5. Thư ký hội đồng: PGS. TS. NGUYỄN THUÝ HƯƠNG Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự Do - Hạnh Phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Lê Kỳ Phán MSHV: 12054865 Ngày, tháng, năm sinh: 23/08/1989 Nơi sinh: Khánh Hoà Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 I. TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceoros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG 1. Thực hiện nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis bằng mô hình bể hở nhằm đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng của chủng tảo này trong điều kiện tự nhiên. 2. Thực hiện nhân nuôi thu sinh khối vi tảo Chaetoceros gracilis bằng mô hình bể hở 1m3 nhằm đánh giá khả năng ổn định và dự đoán năng suất sinh khối của chúng 3. Thiết lập mô hình quang phản ứng dạng tấm nhằm đánh giá khả năng chuyển hoá sinh khối được sản xuất từ bể hở sang trạng thái thu sinh khối giàu lipít bằng phương thức quang phản ứng tổng hợp sử dụng CO2 trong điều kiện phơi sáng ngoài trời III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/01/2015 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/06/2015 V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Lê Thị Thuý Ái CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) Tp. HCM, ngày 01 tháng 8 năm 2015 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) TS. Lê Thị Thuý Ái TRƯỞNG KHOA (Họ tên và chữ ký) LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành tốt các môn trong suốt khóa học. Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS. Lê Thị Thúy Ái, người đã chỉ bảo, hỗ trợ tận tình, hướng dẫn và góp ý chân thành để em hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình em học tại trường. TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2015 Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel ABSTRACT Chaetoceros gracilis of Vietnam is the most popular microalgae applied in Aquaculture. My reaseach is constructed to assess the potential application of this microalgae in biomass production to supply the biodiesel The open pond system with volume of 1m3 and feed-back style was constructed to assess the dry biomass yield of Chaetoceros gracili. We obtain the yield of 0,41g/ liter, an average average level of dry biomass production. The establishment and operator of photobio reactor simulate lipid synthesis in outdoor, Chaetoceros gracilis acumilate lipid in cell with rate is 39.04% (% lipid /dry weight biomass). With the result, we propose the process to culture microalge and product biomass and lipid in the previously pilot scale covering the stage: prepairation breeding and feeding biomass growth, trimming revenues, reducing operating nutrition at least aquarium system, and control forced the optical excitation in photobioreactor HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: I HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel TÓM TẮT ĐỀ TÀI Chaetoceros gracilis là một chủng tảo được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản. Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng thực tế của chủng tảo này vào sản xuất sinh khối và sử dụng làm nguyên liệu cho Biodisel. Với biện pháp nhân nuôi vi tảo trên hệ thống bể hở 1m3 và phương thức vận hành liên tục theo kiểu mẻ bổ sung, chủng Chaetoceros gracilis đạt được năng suất sinh khối khô 0,41g/lít đạt được kết quả trung bình với thế giới. Kết quả thiết lập và vận hành mô hình quang phản ứng kích thích tổng hợp lipít ở điều kiện ngoài trời đã tạo được lượng lipít tích lũy trong tế bào đạt được 39,04% (% lipít /trọng lượng khô sinh khối). Từ những kết quả đạt được, đề xuất quy trình công nghệ nhân nuôi vi tảo cho sản xuất sinh khối và lipít ở quy mô tiền pilot gồm các khâu: chuẩn bị giống, nhân nuôi tang trưởng sinh khối, thu tỉa, vận hành giảm thiểu dinh dưỡng tại hệ thống bể nuôi, và kiểm soát cưỡng bức kích thích tại mô hình quang phản ứng sinh học. HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: II HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng luận văn này là sản phẩm do chính bản thân tôi thực hiện, không có sự sao chép kết quả trong bất cứ tài liệu hay bài báo nào đã công bố trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan nói trên. TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2015 Người thực hiện Nguyễn Lê Kỳ Phán HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: III HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 7 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 10 1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG VI TẢO CHO NHIÊN LIỆU SINH HỌC ............ 10 1.1.1. Đặc điểm cơ bản của vi tảo thích hợp làm nguyên liệu bền vững cho sản xuất biodiesel ........................................................................................................ 10 1.1.2. Chủng loài vi tảo tiềm năng và tiêu chí sàng lọc........................................ 12 1.2. TÌNH HÌNH NHÂN NUÔI VI TẢO CHO NHIÊN LIỆU SINH HỌC ......... 16 1.3. CÁC HỆ THỐNG NHÂN NUÔI ĐIỂN HÌNH CHO NGHIÊN CỨU KHẢO NGHIỆM .................................................................................................................. 20 1.3.1. Hệ thống bể hở ........................................................................................... 21 1.3.2. Hệ thống quang phản ứng kín .................................................................... 22 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VI TẢO ................... 25 1.4.1. Nguồn dinh dưỡng ...................................................................................... 26 1.4.2. Yếu tố môi trường ...................................................................................... 28 1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TỔNG HỢP VÀ TÍCH LŨY LIPÍT 29 1.5.1. Thiết dinh dưỡng nitơ, phốtpho .................................................................. 29 1.5.2. pH cực đoan ................................................................................................ 31 1.5.3. Kim loại nặng ............................................................................................. 31 1.5.4. Cường độ chiếu sáng .................................................................................. 31 1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPÍT TẢO ................. 32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 34 2.1. VẬT LIỆU: ..................................................................................................... 34 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 34 2.2.1. Xác định sinh trưởng bằng đếm mật độ tế bào và đo mật độ quang ở bước sóng 680nm........................................................................................................... 34 2.2.2. Xác định sinh trưởng thông qua trọng lượng khô ...................................... 35 2.2.3. Xác định tốc độ tăng trưởng, thời gian nhân đôi và số lần nhân đôi trong ngày ...................................................................................................................... 36 2.2.4. Phương pháp nhuộm lipít trung tính nội bào và phân tích hình ảnh .......... 36 2.2.5. Phương pháp định lượng lipít tổng số ........................................................ 36 2.2.6. Phương pháp chuyển este dầu tảo trực tiếp từ sinh khối ............................ 38 2.2.7. Phương pháp phân tích thành phần axít béo metyl este bằng sắc ký khí ... 38 HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 1 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel 2.2.8. Phương pháp định lượng nitrat (N-NO3) .................................................... 38 2.3. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THỰC NGHIỆM ................................................. 38 2.3.1. Thực nghiệm phơi sáng bằng mô hình quang phản ứng túi nhựa 10 lít ..... 38 2.3.2. Thực hiện nhân nuôi mẻ bổ sung mô hình bể hở 1 m3 ............................... 39 2.3.3. Chế độ thu mẫu đo và thu hoạch ................................................................ 40 2.3.4. Thực nghiệm nhân nuôi tạo điều kiện áp lực cho tích lũy lipít ở mô hình quang phản ứng dạng tấm ..................................................................................... 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 42 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ THÍCH HỢP TĂNG TRƯỞNG Ở MÔI TRƯỜNG TỰ NHIÊN BẰNG BỂ HỞ GUỒNG ĐẢO TRỘN 1m3 ................................................ 42 3.1.1. Kết quả quan trắc các thông tin về điều kiện thời tiết, khí hậu .................. 42 3.1.2. Thiết lập mô hình đánh giá ......................................................................... 45 3.2. THỬ NGHIỆM NHÂN NUÔI VI TẢO Ở HỆ THỐNG BỂ HỞ 1m3 Ở ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN ..................................................................................................... 47 3.2.1. Xây dựng hệ thống thử nghiệm .................................................................. 47 3.2.2. Chế độ vận hành và các thông số kỹ thuật chính ....................................... 48 3.2.3. Kết quả triển khai thử nghiệm .................................................................... 49 3.3. THIẾT LẬP MÔ HÌNH KÍCH THÍCH TỔNG HỢP LIPÍT Ở ĐIỀU KIỆN NGOÀI TRỜI ........................................................................................................... 53 3.3.1. Thiết kế mô hình quang phản ứng dạng tấm .............................................. 54 3.3.2. Điều kiện thực nghiệm ............................................................................... 54 3.3.3. Kết quả thực nghiệm................................................................................... 55 3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN NUÔI VI TẢO CHO SINH KHỐI VÀ LIPÍT Ở QUY MÔ TIỀN PILOT ........................................................... 65 3.4.1. Sơ đồ quy trình ........................................................................................... 65 3.4.2. Diễn giải quy trình ...................................................................................... 66 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ............................................................... 69 4.1. KẾT LUẬN ..................................................................................................... 69 4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 70 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 79 Phụ lục 1. Thành phần môi trường nuôi cấy ............................................................ 79 Phụ lục 2. Quan trắc nhiệt độ và ánh sáng trong ngày ............................................. 80 Phụ lục 3: thông số tăng trưởng của chủng Chaetoceros gracilis trong điều kiện phòng thì nghiệm ...................................................................................................... 82 HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 2 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ dầu ở các chủng loại tảo điển hình .....................................................10 Bảng 1.2 Năng suất biodiesel từ vi tảo và các nguồn thực vật có dầu khác................11 Bảng 1.3 Các công ty sản xuất vi tảo trên thế giới với đa dạng chiến lược phát triển nhiên liệu sinh học và phương thức nuôi trồng............................18 Bảng 1.4 Sản lượng sinh khối ở các hệ thống quang phản ứng ..................................25 Bảng 3.1 Biến động nhiệt độ từ tháng 2 đến tháng 5/2015 ………………………... 43 Bảng 3.2 Biến động về lượng mưa và ngày mưa từ tháng 2 đến tháng 5/2015……. 43 Bảng 3.3 Biến động về số giờ nắng từ tháng 2 đến tháng 5/ 2015 ……………........ 44 Bảng 3.4 Năng suất sinh khối Chaetoceros gracilis ở mô hình bể 1m3 ....................51 Bảng 3.5 Hiệu quả giảm N-NO3 tại bể thu hoạch và mô hình tấm .............................55 Bảng 3.6 Phân tích hàm lượng lipít tích lũy chủng Chaetoceros gracilis tại mô hình quang phản ứng bằng phương pháp đo tín hiệu huỳnh quang .....................56 Bảng 3.7 Phân tích hiệu suất chiết lipit tổng số ………... ..........................................57 Bảng 3.8 Năng suất lipit tổng ở mô hình nuôi tiền pilot .............................................59 Bảng 3.9 Tỷ lệ axít béo methyl ester (% axít béo tổng) của các chủng vi tảo nuôi trồng .....................................................................................................................61 Bảng 3.10 Dự đoán vài đặc tính quan trọng biodiesel dựa trên thành phần FAME .......................................................................................................63 HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 3 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chu trình tổng hợp axít béo đơn giản ở lục lạp vi tảo ..................................15 Hình 1.2 Sơ đồ minh họa sinh tổng hợp triacylglycerol ở vi tảo ................................15 Hình 1.3 Hệ thống bể hở guồng đảo trộn ....................................................................22 Hình 1.4 Hệ thống quang phản ứng dạng tấm .............................................................23 Hình 1.5 Hệ thống quang phản ứng dạng ống thẳng ...................................................24 Hình 1.7 Hệ thống quang phản ứng dạng túi polymer ................................................24 Hình 2.1 Mô hình quang phản ứng túi polymer điều kiện ngoài trời ..........................39 Hình 2.2 Mô hình bể hở guồng đảo trộn 1m3 .............................................................39 Hình 2.3 Mô hình quang phản ứng dạng tấm ..............................................................41 Hình 3.1 Số giờ nắng tháng 3, 4 và 5/2015 .................................................................44 Hình 3.2 Tổng số giờ nắng từ tháng 2 đến tháng 5/2015 ............................................45 Hình 3.3 Mô hình quang phản ứng túi nhựa 10 lít ......................................................46 Hình 3.4 Mô hình bể hở guồng đảo trộn 1m3 .............................................................48 Hình 3.5 Hệ thống bể thử nghiệm quy mô bể 1m3 .....................................................48 Hình 3.6 Biểu đồ diễn biến nhiệt độ không khí tại các thời điểm cao nhất nhất trong ngày của và thấp tháng 7 và 8/2013 tại Vũng Tàu ....................50 Hình 3.7 Biểu đồ cường độ ánh sáng tại các thời điểm cao nhất và thấp nhất trong ngày của tháng 7 và 8/2013 tại Vũng Tàu .........................................50 Hình 3.8 Biểu đồ năng suất sinh khối Chaetoceros gracilis ở mô hình 1m3 ..............51 Hình 3.10 Hàm lượng lipít tích lũy ở chủng Chaetoceros gracilis tại mô hình quang phản ứng tấm ....................................................................................56 Hình 3.11 Nhuộm Nile red tế bào Chaetoceros gracilis tích lũy lipít tại mô hình tấm điều kiện ngoài trời .............................................................................57 Hình 3.12 Hiệu suất chiết lipít sinh khối tảo Chaetoceros gracilis nhân nuôi ở mô hình quang phản ứng tấm ............................................................................58 Hình 3.13 Phổ đồ sắc ký GC-MS mẫu FAME chủng Chaeoceros gracilis ................60 Hình 3.14 Phổ đồ sắc ký GC-FID mẫu FAME chủng Chaeoceros gracilis ...............60 HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 4 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AFOSR Văn phòng Nghiên cứu Khoa học Không quân (The Air Force Office of Scientific Research) ATP Adenosine triphosphate CCAP Bộ sưu tập giống tảo và phiêu sinh động vật, Anh quốc (The Culture Collection of Algae and Protozoa) CNSH Công nghệ sinh học DGDG Digalactosyldiacylglycerol DMSO Dimethyl sulfoxide EPA Eicosapentaenoic KHCN VN Khoa học Công nghệ Việt Nam MGDG Monogalactosyldiacylglycerol MITI Bộ Thương mại và Công nghiệp Quốc tế, Nhật Bản (Ministry of International Trade and Industry) NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCNT Nghiên cứu nuôi trồng NEDO Tổ chức Phát triển Kỹ thuật Công nghiệp và Năng lượng mới, Hoa Kỳ (New Energy and Industrial Technology Development Organization) Nile-red 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one NLSH Nhiên liệu sinh học NREL Phòng Thí nghiệm Năng lượng Tái tạo Quốc gia, Hoa Kỳ (National Renewable Energy Laboratory) OD Optical Density ORPs Bể hở guồng đảo trộn (Open raceway ponds) PBRs Quang phản ứng sinh học (Photobioreactors) PC Phosphatidylcholine PG Phosphatidylglycerol PSII Hệ thống quang hóa II (Photosystem II) HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 5 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel PUFA Axít béo không bão hòa đa nối đôi (Polyunsaturated Fatty Acid) SQDG Sulfoquinovosyl diacylglycerols TAG Triacylglycerol UTEX Đại học Texas (University of Texas) CÁC THUẬT NGỮ P Năng suất sinh khối khô Pdt Năng suất sinh khối khô theo đơn vị diện tích (gam/m2/ngày) Ptt Năng suất sinh khối khô theo thể tích (gam/lít/ngày) Plipít Năng suất lipít Hlipít Hiệu suất chiết lipít  Tốc độ tăng trưởng (Growth rate) Td Thời gian thế hệ (Doubling time) Xsk Hàm lượng sinh khối (g/l) Xlipít Hàm lượng lipít (g/l) HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 6 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel MỞ ĐẦU Vấn đề an ninh năng lượng, sự biến động lớn về giá dầu thô từ năm 2008 đến nay đã thúc đẩy chính sách nhiên liệu thay thế đi rất nhanh ở các nước. Sáu loại năng lượng thay thế đang được Liên Hiệp Quốc ưu tiên xem xét là: năng lượng sinh học, mặt trời, gió, địa nhiệt, thủy điện và năng lượng đại dương. Về nhiên liệu sinh học (NLSH), tiềm năng khai thác NLSH từ vi tảo trên thế giới ngày càng được khẳng định. Khởi phát từ 1978, Bộ Năng lượng Hoa kỳ đã chi 25 triệu USD cho Chương trình các Chủng loài Thủy sản (Aquatic Species Program) tại Roswell-New Mexico trong 18 năm nhằm nghiên cứu thăm dò tổng thể tiềm năng khai thác năng lượng thay thế từ sinh khối vi tảo, tảo lớn, và rong biển bằng các hệ thống nuôi mở. Nghiên cứu này đã giúp định hướng khả năng khai thác sinh khối vi tảo cho lên men tạo ethanol, cho phân hủy yếm khí tạo methan, làm nguồn sản xuất hydro, nhưng tiềm năng nhất là khả năng chuyển hóa tạo biodiesel từ nguồn lipít tảo. Cuối năm 2009, từ chương trình Tái đầu tư và Phục hồi (the American Recovery and Reinvestment) Bộ Năng lượng Hoa Kỳ đầu tư 564 triệu USD nhằm đẩy mạnh việc xây dựng và vận hành các quy trình công nghệ thử nghiệm, trình diễn và thương mại hóa NLSH tảo. Trong số đó, 4 dự án liên quan đến khía cạnh phát triển nhiên liệu tảo được giao cho các tập đoàn uy tín như Algenol Biofuels, Sapphire Energy, Solazyme và Universal Oil Products (Honeywell). Năm 2010 được xem là năm “bước ngoặt” trong đầu tư nghiên cứu tảo và vi tảo với tổng mức đầu tư hàng chục tỉ USD cho hơn 200 công ty trên thế giới tập trung nghiên cứu phát triển nhiên liệu từ sinh khối tảo. Hiện có khoảng 10 công ty đang thực hiện nâng cấp quy mô để có thể hướng đến thương mại hóa nguồn nhiên liệu này trong vài năm tới. Trong nước, hiện chỉ có vài công trình nghiên cứu vi tảo cho biodiesel và quy mô nghiên cứu khá hạn chế: đề tài do Viện CNSH chủ trì (Bộ Công thương chủ quản) kinh phí hơn 2 tỉ (2009-2011); đề tài của Đại học Khoa học Tự Nhiên (cấp trọng điểm Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh) kinh phí khoảng 500 triệu (2010-2012); đề tài của Đại học Nông Lâm (do Bộ Giáo dục và Đào tạo chủ quản) kinh phí khoảng 200 triệu. Nhìn chung, các nghiên cứu chủ yếu sàng lọc chủng nội địa với số lượng vừa phải, tập trung điều tra sơ bộ phương thức nhân nuôi (hóa dị dưỡng/quang tự dưỡng, tảo biển/tảo nước ngọt, mô hình nuôi kín/hở). Riêng đề tài Bộ Công đã thực hiện một phần nghiên cứu cơ bản và phương thức nhân nuôi ở vài loài vi tảo được ưa chuộng trên thế giới phục vụ cho dinh dưỡng và NLSH như Schizochytrium mangrovie (nuôi dị dưỡng bằng nồi lên men và sử dụng glucose làm nguồn carbon), Nannochoropsis oculata và Chlorella HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 7 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel vulgaris (nuôi quang tự dưỡng bằng mô hình ống 300 lít và bể hở 24m3, sử dụng CO2 và năng lượng sáng tự nhiên). Hiện các vấn đề còn tồn tại từ công trình này là nhân nuôi bằng theo phương thức dị dưỡng đạt hiệu quả cao nhưng chi phí lớn, cần khai thác các sản phẩm phụ đi kèm để có giá thành hợp lý đối với tảo nguyên liệu; nhân nuôi bằng phương thức quang tự dưỡng, chi phí thấp phù hợp với quan điểm hiện nay cho phát triển NLSH nhưng gặp phải vấn đề tạp nhiễm, khó vận hành ổn định với điều kiện thời tiết biến động ở khu vực Bắc bộ, năng suất sinh khối đạt 7-8g sinh khối khô/m2/ngày (khoảng 40% năng suất thế giới công bố). Về nguyên liệu tảo, chủ động nguồn nguyên liệu sinh khối tảo là một trong những yếu tố có tính quyết định cho hướng phát triển biodiesel từ tảo. Khâu nuôi trồng hay sản xuất nguyên liệu sinh khối hiện chiếm 60% chi phí nhiên liệu thành phẩm từ tảo. Tuy vậy, điều kiện thuận lợi cho nhân nuôi phải được đánh giá ở từng khu vực cụ thể. Bốn yếu tố cốt lõi cho khả năng sản xuất tảo là sự phù hợp khí hậu, nguồn nước, diện tích ven biển và nguồn khí CO2 phải tập trung. Việt Nam có nhiều ưu thế về điều kiện khí hậu, năng lượng bức xạ, diện tích lợ mặn ven biển, nguồn lao động dồi dào, nhu cầu tại chổ cho sản phẩm phụ rất lớn, là cơ hội thuận lợi cho nhân nuôi tảo làm nguyên liệu mới cho NLSH. Với những điều kiện tự nhiên thuận lợi, điều quan trọng trước mắt cần phải chọn lựa được chủng tảo phù hợp để nuôi trồng trong điều kiện thực tế nhằm sản xuất Biodiesel. Một trong những chủng đã nuôi trồng phổ biến tại Việt Nam là chủng Chaetoceros gracilis dùng phục vụ cho ngành nuôi trồng thủy sản. Tuy gần như rất ít tài liệu công bố về việc ứng dụng chủng tảo này vào sản xuất biodisel nhưng Chaetoceoros gracillis lại có khả năng phát triển và kháng lại tạp nhiễm rất tốt và điều này được khẳng định trong thời gian dài khi trở thành chủng tảo phổ biến trong nuôi trồng thủy sản. Những ưu điểm này là một trong những đặc điểm quan trọng trước tiên cần được quan tâm khi chọn lựa chủng tảo để nuôi trồng trong điều kiện tự nhiên. Thêm vào đó, trước khi thực hiện đề tài, chủng Chaetoceos gracilis đã được tôi khảo sát trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm chọn lựa điều kiện thuận lợi và thiết kế thí nghiệm trong tự nhiên. Một điều khá bất ngờ khi tôi thực hiện khảo nghiệm chủng này là lượng lipít tích lũy trong tế bào tảo đến 45,01% ± 0,61, tăng 1,7 lần so với điều kiện môi trường đầy đủ. Với những ưu điểm như vậy, chủng Chaetoceros gracilis là một chủng tảo rất tiềm năng với mục tiêu phát triển biodiesel từ vi tảo. HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 8 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel Mục tiêu đề tài: Đánh giá tiềm năng và tính khả dụng của chủng tảo Chaetoceros gracilis được nhân nuôi trong hệ thống ao mở ứng dụng phương thức vận hành liên tục theo kiểu mẻ bổ sung để thu nhận sinh khối và lipít; Thiết lập được mô hình thực nghiệm nhân nuôi vi tảo quy mô tiền pilot; vận hành nhân nuôi vi tảo ở điều kiện tự nhiên nhằm khảo sát sản lượng sinh khối và hàm lượng lipít được tích lũy của chủng vi tảo Chaetoceros gracilis. Nội dung thực hiện: Đúc kết kinh nghiệm của nhiều nơi trên thế giới, nhiều chủng vi tảo phát triển rất tốt ở điều kiện phòng thí nhiệm nhưng không thành công khi nhân nuôi mở rộng ở điều kiện tự nhiên. Vì vậy, để đánh giá được tiềm năng ứng dụng thực tế của chủng tảo Chaetoceros gracilis vào sản xuất sinh khối và sử dụng làm nguyên liệu cho Biodisel đề tài được chia làm 3 phần bao gồm: - Mô hình bể hở ngoài trời được xây dựng nhằm đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng của chủng Chaetoceros gracilis với các điều kiện ngoại cảnh bao gồm: nguồn nước biển, nhiệt độ ngày đêm, cường độ chiếu sáng, mức độ tạp nhiễm. Đồng thời, đây là bước huấn luyện giúp vi tảo thích nghi phát triển tốt với điều kiện ngoại cảnh và nhân giống trong các túi polymer 10 lít để chuẩn bị cho các thử nghiệm. - Ứng dụng các thông số kỹ thuật từ các kết quả khảo sát tối ưu trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thử nghiệm vận hành ở các bể 1m3 nhằm đánh giá tính ổn định và dự đoán năng suất sinh khối vi tảo Chaetoceros gracilis ở điều kiện tự nhiên. - Thiết lập mô hình quang phản ứng dạng tấm phẳng (Flat Panel Reactors) nhằm đánh giá khả năng chuyển hóa sinh khối được sản xuất từ bể hở sang trạng thái sinh khối giàu lipít bằng phương thức quang tổng hợp sử dụng CO2 trong điều kiện phơi sáng ngoài trời HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 9 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel CHƯƠNG 1. 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU TIỀM NĂNG SỬ DỤNG VI TẢO CHO NHIÊN LIỆU SINH HỌC 1.1.1. Đặc điểm cơ bản của vi tảo thích hợp làm nguyên liệu bền vững cho sản xuất biodiesel Vi tảo là đối tượng quang hợp, sử dụng năng lượng chiếu sáng tự nhiên, nguồn CO2, nitơ và phốtpho để tích lũy sinh khối và dự trữ năng lượng. Tảo phát triển nhanh, nhân đôi số lượng 1-3 lần/ngày, chu kỳ tăng trưởng hoàn tất trong vài ngày nên cho phép thu hoạch thường xuyên. Tảo tích lũy dầu cao, có thể cạnh tranh được với sự khai thác nhiên liệu từ nông sản. Nếu dầu ở đậu nành chiếm 20% sinh khối, hoa hướng dương là 55%, thì dầu tảo dao động từ 20-50% sinh khối (Bảng 1.1). Tiềm năng khai thác tảo cho NLSH được nhận định chủ yếu dựa trên sản lượng dầu khai thác trên đơn vị diện tích canh tác. Năng suất cao được giải thích bởi hiệu suất quang hợp và tốc độ phát triển ở tảo nhanh hơn (tính theo mật độ (gam sinh khối/ngày) so với các thực vật cho dầu khác. Mata (2010) và Chisti (2007) tóm tắt rằng sản xuất dầu vi tảo trên đơn vị diện tích thì có năng suất lớn hơn từ 15 – 300 lần so với các loại cây trồng năng lượng sinh học khác (Bảng 1.2). Hơn nữa, sản lượng sinh khối trên hecta ở vi tảo có giá trị lớn hơn 16 lần so với dầu cọ, cây trồng dầu tốt nhất hiện nay 75. Bảng 1.1. Tỷ lệ dầu ở các chủng loại tảo điển hình Tỉ lệ dầu (% trọng lượng khô) Loài vi tảo Botryococcus braunii 25-75 Chlorella sp. 28-32 Crypthecodinium cohnii 20 Cylindrotheca sp. 16-37 Dunaliella primolecta 23 Isochrysis sp. 25-33 Monallanthus salina > 20 Nannochloris sp. 20-35 Nannochloropsis sp. 31-68 Neochloris oleoabundans 35-54 Nitzschia sp. 45-47 Phaeodactylum tricornutu 20-30 HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 10 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel Tỉ lệ dầu (% trọng lượng khô) Loài vi tảo Schizochytrium sp. 50-77 Tetraselmis sueica 15-23 (Nguồn: 21) Bảng 1.2. Năng suất dầu biodiesel từ vi tảo và các nguồn thực vật có dầu khác Các nguồn Hàm lượng dầu Sản lượng Nhu cầu Năng suất nguyên liệu (% theo trọng dầu sử dụng đất biodiesel 2 lượng khô) (lít/ha năm) (m /kg năm) (kg/ha năm) Ngô 44 172 66 152 Dầu gai 33 363 31 321 Đậu nành 18 636 18 562 Canola 41 974 12 862 Hướng dương 40 1.070 11 946 Castor 48 1.307 9 1.156 Cọ 36 5.366 2 4.747 Vi tảo a 30 58.700 0,2 51.927 Vi tảo b 50 97.800 0,1 86.515 Vi tảo c 70 136.900 0,1 121.104 a: lượng dầu thấp; b: lượng dầu trung bình; c: lượng dầu cao (Nguồn: 52) Chương trình Nghiên cứu các Giống loài Thủy sản đã nhận định có hơn 10% trong số 3.000 loài tảo tạo được lipít, và hydrocarbon thích hợp trong chế biến NLSH như xăng, biodiesel và nhiên liệu phản lực. Vài loài sản xuất phân tử hydrocarbon được tìm thấy từ dầu mỏ [122]. Những chủng loại khác lại có khả năng tích lũy lượng lớn dưới dạng triacylglycerol (TAG) có tính chất tương đương như thành phần ở hạt cho dầu, nên có thể chế biến thành biodiesel. Theo Griffiths và Harrison (2009), các dẫn xuất carbohydrat từ tảo chiếm đến 40% sinh khối, có thể được chuyển hóa thành ethanol hoặc butanol bằng quy trình lên men chuẩn. Phế phẩm từ sinh khối tảo có thể được tiếp tục chế biến làm nguồn dinh dưỡng cho động vật và sản xuất ethanol. Một trong những ưu điểm nỗi bật của tảo là khả năng phát triển tốt với nguồn nước lợ, mặn, hay nước thải [122]. HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 11 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel Bên cạnh những thuận lợi, sản xuất biodiesel từ vi tảo cũng gặp phải nhiều thách thức. Thứ nhất, quá trình sản xuất nguyên liệu tảo dầu có chi phí lớn ở khâu nuôi trồng và thu hoạch dẫn đến giá thành biodiesel từ dầu tảo cao hơn nhiều so với diesel dầu mỏ. Chi phí cho quá trình sản xuất nguyên liệu gốc từ vi tảo phải giảm 5 lần để có thể cạnh tranh với diesel dầu mỏ [21]. Hiện tại, vi tảo có thể nuôi trồng ở các hệ thống có chi phí thấp như các bể hở. Tuy nhiên, các hệ thống bể hở sản xuất ra sinh khối có sản lượng thấp, dẫn đến chi phí cho khử nước và thu hoạch sinh khối tăng cao, và vấn đề tạp nhiễm. Vì vậy, cần nghiên cứu tối ưu hóa chế độ vận hành giảm chi phí sản xuất sinh khối; Thứ hai, quá trình chiết tách dầu và chuyển hóa biodiesel cần phải nghiên cứu chuyên sâu. Nhằm giảm giá thành sản phẩm biodiesel gốc vi tảo, cần có chiến lược khai thác các thành phần có giá trị khác ở sinh khối tảo như nguyên liệu làm thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm, thủy sản, và phân bón; Thứ ba, nguồn nguyên liệu dầu vi tảo chứa thành phần các axít béo không bão hòa mạch dài sẽ ảnh hưởng đến chất lượng biodiesel. 1.1.2. Chủng loài vi tảo tiềm năng và tiêu chí sàng lọc Từ chương trình các Giống loài Thủy sản, Sheehan (1998) đã công bố nhiều loài vi tảo có thể tích lũy lipít trung tính phù hợp cho biodiesel. Tuy nhiên, chỉ một số loài khuê tảo và tảo lục được đánh giá là có tiềm năng, và Chaetoceros gracilis là một trong số đó. [77]. Hu (2008) nhấn mạnh các tiêu chí chọn tảo cho biodiesel nên dựa trên các đặc tính sau đây: tốc độ sinh trưởng nhanh (>1 lần nhân đôi/ngày); hàm lượng lipít đủ (ít nhất >30% khối lượng khô) ở điều kiện nuôi trồng tự nhiên; có thể hấp thu các nguồn carbon hữu cơ thải (như phương thức sinh trưởng quang tự dưỡng kết hợp hóa dị dưỡng (mixotrophic)), vì thế sản lượng sinh khối và tích lũy lipít có thể được tăng cường đáng kể [47]. Hơn thế nữa, tảo biển sẽ được ưu tiên chọn vì không cạnh tranh với nguồn nước sạch [53]. Trong quá trình sàng lọc, sự ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ và cường độ ánh sáng sớm được đánh giá [18]. Ngoài ra, tiêu chí về khả năng chịu mặn, chịu pH cao, chịu nhiệt cao, biên độ đáp ứng nhiệt rộng, khả năng sử dụng CO2 từ khí thải hiệu quả (1 kg sinh khối khô vi tảo cần 1,83kg CO2) [91] cũng ưu tiên lưu ý. Khả năng tránh tạp nhiễm có thể được hạn chế khi nhân nuôi vài chủng loại tảo trong môi trường cực đoan mà vi sinh vật khác không thể tồn tại [80]. Vì vậy, việc nhân nuôi đơn chủng dễ dàng được duy trì ở điều kiện tự nhiên. Tuy vậy, việc sàng lọc cũng nên được kết hợp với quá trình thuần hóa tăng trưởng với nhiệt độ, cường độ chiếu sáng ở điều kiện tự nhiên khu vực nhân nuôi. Nghiên cứu tối ưu hóa khả năng sử dụng dinh dưỡng và nồng độ CO2 là cần thiết. Trong hầu hết trường hợp, lipít trung tính (tồn tại chủ yếu dạng TAG) được tăng cường khi các điều kiện nuôi cấy không thuận lợi cho sự sinh trưởng HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 12 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán Thử nghiệm nhân nuôi vi tảo Chaetoceros gracilis quy mô 1m3 phục vụ sản xuất Biodiesel vi tảo. Do đó, quá trình tối ưu của sản xuất TAG phải được nghiên cứu trước khi tiến hành quá trình nuôi cấy hàng loạt. Nhận định chung, tuyển chọn giống là khâu khá quan trọng trong quá trình sản xuất NLSH từ vi tảo, các tiêu chí tuyển chọn quan trọng gồm: (1) sản lượng lipít cao; (2) khả năng tăng trưởng mạnh với điều kiện nhân nuôi với áp lực thường có (áp lực khí, nhiệt độ) bởi hệ thống nuôi quang phản ứng; (3) tăng trưởng ưu thế ở hệ thống nuôi bể hở; (4) khả năng kháng nồng độ CO2 cao, (5) đáp ứng được khoảng biên độ dao động nhiệt rộng theo chu kỳ ngày đêm và theo mùa; (6) chu kỳ sản xuất sinh khối nhanh; (7) hiệu quả quang hợp cao; và (8) có khả năng tự lắng tụ. Hơn nữa, theo Sheehan (1998), đáp ứng nhân nuôi ở một vi trí cụ thể là yếu tố cốt lõi cho khả năng sản xuất thương mại. Điều này giúp việc vận hành đơn giản và giảm chi phí phát sinh thông qua việc kiểm soát điều kiện nuôi cấy. Vậy khả năng thích ứng và điều kiện nuôi cấy tối ưu cần được đánh giá tại vị trí chọn triển khai nhân rộng. Sheehan cũng nhận định rằng: sự phân lập các chủng địa phương để sản xuất NLSH nên được được xem là một lĩnh vực nghiên cứu cơ bản; và cũng cần lưu ý rằng chủng chiếm ưu thế có thể không phải là tối ưu để sản xuất dầu. Do đó, biến đổi di truyền là cần thiết. 1.1.3. Sinh tổng hợp và đặc trưng lipít vi tảo 1.1.3.1. Sinh tổng hợp lipít ở vi tảo Nghiên cứu của Hu và cộng sự (2006) 40 đã ghi nhận khả năng tổng hợp axít béo tự do chỉ tập trung ở vài ngành vi tảo như: lục tảo, khuê tảo và vi khuẩn lam; và khả năng tổng hợp và tích trữ lipít của vi tảo đặc trưng ở mức độ loài nhưng rất biến động ở cấp độ giống. Trong điều kiện bình thường các loài tảo thuộc ngành khuê tảo tích luỹ lipít vào khoảng 22%. Trong điều kiện áp lực sinh lý, khả năng tích lũy lipít ở khuê tảo tăng lên 37,8%. Tổng hợp lipít là quá trình hình thành mới (de novo), được xúc tác bởi hệ enzym tại lục lạp. Khả năng sinh tổng hợp thể lipít mới là điểm rất đặc trưng ở chủng loài tảo có khả năng tích lũy dầu khi được nhân nuôi ở điều kiện thiếu hụt nitơ (hoặc các áp lực khác làm hạn chế tăng trưởng), nguồn carbon thừa và năng lượng được đi vào lưu trữ lipít (chủ yếu là TAG). TAG gồm các axit béo bão hòa và không bão hòa đơn, được đóng gói rất hiệu quả ở nội bào và tạo ra nhiều năng lượng hơn khi được oxy hóa. Do đó TAG là nguồn dự trữ tốt nhất để tạo lập mới các tế bào sau điều kiện không thuận lợi [71]. Cũng có đề nghị rằng sự tổng hợp TAG có thể giúp làm giảm mức độ tổn hại ở tế bào tảo do hiện tượng quang oxy hóa ở điều kiện ánh sáng mạnh [40]. HDĐT: TS. Lê Thị Thuý Ái Trang: 13 HVTH: Nguyễn Lê Kỳ Phán