Tài liệu Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin tái tổ hợp từ tế bào pichia

ðại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA -------------------- NGUYỄN HỮU QUYỀN THIẾT LẬP QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN, TINH CHẾ INSULIN TÁI TỔ HỢP TỪ TẾ BÀO PICHIA Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 6 năm 2008 CÔNG TRÌNH ðƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học : ......................................................................... Cán bộ chấm nhận xét 1 : ............................................................................... Cán bộ chấm nhận xét 2 : ............................................................................... Luận văn thạc sĩ ñược bảo vệ tại HỘI ðỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . . ðẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðộc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc ---------------- ---oOo--Tp. HCM, ngày . . . . . tháng . . . . . năm . . . . . NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: . . . Nguyễn Hữu Quyền. . . . . . . Giới tính : Nam
/ Nữ  Ngày, tháng, năm sinh : . . . 10/06/1982. . . . . . . . . . Nơi sinh : . . .Quảng Bình . . . . . Chuyên ngành : . . . . . . .Công nghệ sinh học . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Khoá (Năm trúng tuyển) : . . 2005. . . . . . . . . 1- TÊN ðỀ TÀI: . . . . .“Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .tái tổ hợp từ tế bào Pichia” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .+ Tối ưu hóa môi trường, ñiều kiện nuôi cấy Pichia pastoris ở quy mô erlen . . . . . . . . .+ Khảo sát khả năng tăng trưởng sinh khối và cảm ứng sản xuất mini-proinsulin ở . . . . . quy mô fermenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .+ Nghiên cứu phương pháp thu nhận, tinh sạch mini-proinsulin sau lên men. . . . . . 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : . . . 02/2007. . . . . . . . . . . . . . . . . . 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : . . . 06/2008. . . . . . . . . . . . . . . . . . 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : . . TS. Nguyễn Quốc Bình. . . . . . . . . . . . . Nội dung và ñề cương Luận văn thạc sĩ ñã ñược Hội ðồng Chuyên Ngành thông qua. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn thầy TS. Nguyễn Quốc Bình, Phó giám ñốc Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM, ñã ñịnh hướng ñề tài và tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện cho tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cám ơn cô ThS. Nguyễn Thị Thùy Dương, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp. HCM, ñã hỗ trợ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện các thí nghiệm lên men trong qúa trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cám ơn bạn ThS. Trần Thị Thúy Hằng và em KS. Phạm Thị Thùy Dương ñã hỗ trợ tôi trong việc chuẩn bị nguyên vật liệu, tiến hành các thí nghiệm và xử lý số liệu thí nghiệm trong qúa trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cám ơn cô TS. Nguyễn Thúy Hương, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp. HCM, ñã hỗ trợ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong việc thực hiện các thủ tục gia hạn thời gian thực hiện luận văn và bảo vệ luận văn. Tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp. HCM ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM ñã tạo ñiều kiện về các nguyên vật liệu cho tôi thực hiện qúa trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám ñốc Công ty Dược phẩm Phil Inter Pharma ñã tạo ñiều kiện về mặt thời gian cho tôi trong qúa trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cám ơn các bạn học cùng lớp Cao học CNSH-K2005 trường ðại học Bách khoa Tp. HCM ñã mang lại cho tôi niềm vui, tình bạn và những ý kiến ñóng góp chân thành trong qúa trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia ñình tôi ñã ủng hộ, khích lệ và ñộng viên tôi trong suốt qúa trình học tập và nghiên cứu. TÓM TẮT LUẬN VĂN Qúa trình lên men Pichia pastoris trong fermenter gồm 3 phase (pha): glycerol batch phase, glycerol fed-batch phase và methanol fed-batch phase. Pichia pastoris phát triển ñể ñạt mật ñộ sinh khối cao trong hai phase ñầu: Sử dụng cơ chất glycerol trong môi trường ban ñầu ñể phát triển sinh khối trong glycerol batch phase; sau ñó, cơ chất cho phát triển sinh khối này (glycerol) sẽ ñược bổ sung thêm trong glycerol fed-batch phase. Khi ñạt ñược mật ñộ sinh khối thích hợp thì sẽ bổ sung cơ chất thứ hai (methanol) trong methanol fed-batch phase ñể cảm ứng cho qúa trình sản xuất miniproinsulin. Mini-proinsulin trong dịch lên men sau ñó sẽ ñược ñịnh tính bằng phương pháp ñiện di và Western blot, ñịnh lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC. Glycerol batch phase: Tiến hành lên men với 4,1% glycerol trong môi trường ban ñầu. Glycerol fed-batch phase: Tiến hành bổ sung glycerol theo 3 chế ñộ thí nghiệm: Ở chế ñộ lên men 1, bổ sung liên tục: 0,5% glycerol/h trong 4 giờ ñầu và 0,75% glycerol/h trong 4 giờ sau (5% glycerol). Trong 2 chế ñộ còn lại thì chỉ bổ sung một lần: 5% glycerol ở chế ñộ lên men 2 và 7% glycerol ở chế ñộ lên men 3. Methanol fed-batch phase: Tiến hành bổ sung methanol liên tục: 0,3% methanol/h trong 4 giờ ñầu, 0,6% methanol/h trong 2 giờ tiếp theo và 0,9 % methanol/h cho ñến khi kết thúc thí nghiệm. ABSTRACT The process of Pichia pastoris fermentation in fermenter containing 3 phases: glycerol batch phase, glycerol fed-batch phase and methanol fed-batch phase. Pichia pastoris develops to reach the high mass density in the first two phases: Using glycerol in initial medium to develop the mass in glycerol batch phase; after that, this mass developing – substance (glycerol) will be added more in glycerol fed-batch phase. After reaching the suitable mass density, the second substance (methanol) will be added in methanol fedbatch phase for the induction process of producing mini-proinsulin. Mini-proinsulin in the cultured supernatant after fermentation will be identified by the method of polyacrilamide gel electrophoresis and Western blot, assayed by the method of high performance liquid chromatography – HPLC. Glycerol batch phase: Carry out the fermentation process with 4.1% glycerol in the initial medium. Glycerol fed-batch phase: Carry out adding glycerol with 3 experiment regulations: In the 1st experiment, add glycerol continuously: 0.5% glycerol/h in the first 4 hours and 0.75% glycerol/h in the next 4 hours (total 5% glycerol). In the 2 remain experiments, add glycerol only 1 time: 5% glycerol in the 2nd experiment and 7% glycerol in the 3rd experiment. Methanol fed-batch phase: Carry out adding methanol continuously: 0.3% methanol/h in the first 4 hours, 0.6% methanol/h in the next 2 hours and 0.9 % methanol/h to the end of experiment. MỤC LỤC Lời cám ơn Tóm tắt luận văn Danh mục hình Danh mục bảng PHẦN 1 MỞ ðẦU 1.1. ðẶT VẤN ðỀ ................................................................................................... 14 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC........................................... 15 1.2.1. Các nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới ........................................................ 15 1.2.2. Các nghiên cứu, ứng dụng trong nước .......................................................... 16 PHẦN 2 TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ðƯỜNG ......................................................... 19 2.1.1. Tiểu ñuờng là gì ........................................................................................... 19 2.1.2. Các dạng tiểu ñường..................................................................................... 19 2.1.2.1. Tiểu ñường tuýp 1 ................................................................................... 20 2.1.2.2. Tiểu ñường tuýp 2 ................................................................................... 21 2.1.2.3. Xuất hiện bệnh tiểu ñường tuýp 3............................................................ 21 2.1.3. Tác hại của bệnh tiểu ñường ......................................................................... 23 2.1.4. Tình hình bệnh tiểu ñường trên thế giới và ở Việt Nam ................................ 25 2.2. TỔNG QUAN VỀ INSULIN VÀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP............................................................................................................. 25 2.2.1. Insulin là gì................................................................................................... 25 2.2.2. Cấu tạo insulin.............................................................................................. 25 2.2.3. Chức năng sinh học của insulin .................................................................... 28 2.2.4. Tại sao cần phải sản xuất insulin tái tổ hợp................................................... 30 2.2.5. Phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp........................................................ 30 2.3. TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN PICHIA PASTORIS .......................................... 32 2.3.1. ðặc ñiểm sinh học của nấm men Pichia pastoris .......................................... 32 2.3.1.1. Phân loại khoa học của Pichia pastoris .................................................. 33 2.3.1.2. ðặc ñiểm dinh dưỡng của Pichia pastoris ............................................... 33 2.3.1.3. ðặc ñiểm sinh hóa – di truyền của Pichia pastoris ................................. 33 2.3.1.4. Qúa trình trao ñổi chất của Pichia pastoris.............................................. 34 2.3.2. So sánh nấm men Pichia pastoris với các hệ thống biểu hiện khác ............... 36 2.3.3. ðặc ñiểm thuận lợi của Pichia pastoris phù hợp với ứng dụng sản xuất insulin người tái tổ hợp theo qui mô công nghiệp..................................................... 37 2.4. LÊN MEN PICHIA PASTORIS SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP .............. 38 2.4.1. Khái quát về kỹ thuật lên men ...................................................................... 38 2.4.2. Phương pháp lên men fed-batch.................................................................... 38 2.4.2.1. Khái quát về phương pháp lên men fed-batch.......................................... 38 2.4.2.2. Ưu ñiểm của phương pháp lên men fed-batch ......................................... 40 2.4.2.3. Nhược ñiểm của phương pháp lên men fed-batch.................................... 40 2.4.2.4. Các nhân tố ñược kiểm soát trong lên men fed-batch............................... 40 2.4.2.5. Các thiết bị cho hệ thống trong lên men fed-batch................................... 47 2.4.3. Lên men Pichia pastoris sử dụng phương pháp lên men fed-batch ............... 48 2.4.3.1. Glycerol batch phase (GBP) .................................................................... 48 2.4.3.2. Glycerol fed-batch phase (GFP) .............................................................. 49 2.4.3.3. Methanol fed-batch phase (MFP) ............................................................ 49 2.4.4. Các nghiên cứu ứng dụng lên men Pichia pastoris ....................................... 50 PHẦN 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ....................................................................................... 54 3.1.1. Môi trường ................................................................................................... 54 3.1.1.1. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) ............. 54 3.1.1.2. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-coplex Medium) .................. 54 3.1.1.3. Môi trường BS (Basal Salts Medium) ................................................ 54 3.1.1.4. PTM1 Trace Metals Solution ............................................................. 54 3.1.2. Chủng vi sinh vật.......................................................................................... 55 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 56 3.1.3.1. Dụng cụ .................................................................................................. 56 3.1.3.2. Thiết bị.................................................................................................... 56 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 56 3.2.1. Sơ ñồ khối qúa trình nghiên cứu ................................................................... 56 3.2.2. Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy Pichia pastoris thu sinh khối ở quy mô erlen.57 3.2.3. Khảo sát ñường cong tăng trưởng của chủng ở quy mô erlen ........................ 59 3.2.4. Khảo sát khả năng tăng trưởng sinh khối và cảm ứng sản xuất mini-proinsulin ở quy mô fermenter ...............................................................................................60 3.2.4.1. Khảo sát khả năng phát triển sinh khối (thay ñổi cách nạp liệu và nồng ñộ glycerol bổ sung)..................................................................................... 63 3.2.4.2. Khảo sát khả năng sử dụng cơ chất methanol tổng hợp mini-proinsulin . 64 3.2.5. Phương pháp phân tích ................................................................................. 64 3.2.5.1. Xác ñịnh hàm lượng sinh khối khô .......................................................... 64 3.2.5.2. Xác ñịnh tốc ñộ tăng trưởng riêng của chủng (µ)..................................... 65 3.2.5.3. Xác ñịnh protein tổng bằng phương pháp Bradford ................................ 66 3.2.5.4. ðịnh tính mini-proinsulin bằng phương pháp ñiện di và Western blot .... 67 3.2.5.5. ðịnh lượng mini-proinsulin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ............................ 70 PHẦN 4 KẾT QỦA VÀ BIỆN LUẬN 4.1. TỐI ƯU HÓA ðIỀU KIỆN NUÔI CẤY PICHIA PASTORIS THU SINH KHỐI Ở QUY MÔ ERLEN.......................................................................................... 74 4.1.1. Thực nghiệm yếu tố từng phần ..................................................................... 74 4.1.2. Tối ưu hóa thực nghiệm ñường dốc nhất....................................................... 74 4.2. KHẢO SÁT ðƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỦNG Ở QUY MÔ ERLEN .............................................................................................................. 76 4.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG SINH KHỐI VÀ CẢM ỨNG SẢN XUẤT MINI-PROINSULIN Ở QUY MÔ FERMENTER.......................................78 4.3.1. Khảo sát khả năng phát triển sinh khối (thay ñổi cách nạp liệu và nồng ñộ glycerol bổ sung) .......................................................................................... 78 4.3.2. Kiểm tra khả năng sử dụng cơ chất methanol tổng hợp mini-proinsulin........ 83 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ A. KẾT LUẬN .......................................................................................................... 88 B. ðỀ NGHỊ ............................................................................................................. 89 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ............................................................................................ 91 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI ............................................................................ 91 CÁC TRANG WEB................................................................................................... 94 PHẦN 7 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: CÁC BẢNG KẾT QỦA THÍ NGHIỆM............................................... 96 PHỤ LỤC B: CÁC HÌNH KẾT QỦA THÍ NGHIỆM ...............................................106 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG DANH MỤC HÌNH 2.1 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 1 2.2 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 2 2.3 – Công thức cấu tạo của insulin người 2.4 – Công thức cấu tạo của insulin heo 2.5 – Công thức cấu tạo của insulin bò 2.6 – Quá trình biến ñổi thành insulin từ pre-proinsulin 2.7 – Tổng hợp isulin tái tổ hợp từ các gene chuỗi A và B nhân tạo 2.8 – Số ấn bản phát hành về Pichia pastoris từ năm 1982 ñến năm 2002 3.1 – Sơ ñồ khối qúa trình nghiên cứu 3.2 – Sơ ñồ khối qúa trình khảo sát khả năng tăng trưởng sinh khối và cảm ứng sản xuất mini-proinsulin ở quy mô fermenter 4.1 – Sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và pH theo thời gian trong khảo sát ñường cong tăng trưởng ở quy mô erlen 4.2 – Lượng sinh khối khô (g/L), tốc ñộ tăng trưởng riêng (1/h) và tổng protein ngoại bào (g/L) trong chế ñộ lên men 1 4.3 – Lượng sinh khối khô (g/L), tốc ñộ tăng trưởng riêng (1/h) và tổng protein ngoại bào (g/L) trong chế ñộ lên men 2 4.4 – Lượng sinh khối khô (g/L), tốc ñộ tăng trưởng riêng (1/h) và tổng protein ngoại bào (g/L) trong chế ñộ lên men 3 4.5 – Tốc ñộ tăng trưởng riêng trong 2 pha ñầu phát triển sinh khối của 3 chế ñộ lên men ở quy mô fermenter 7.1 – Khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris trên môi trường YPD 7.2 – Hệ thống fermenter Bioflo 110 1,3 lít 7.3 – ðồ thị ñường chuẩn OD600nm và nồng ñộ sinh khối khô (g/L) 7.4 – ðồ thị ñường chuẩn OD595nm và nồng ñộ protein tổng (mg/L) 7.5 – Kết quả ñịnh tính mini-proinsulin (ñiện di Native và Western blot) 7.6 – ðồ thị ñường chuẩn nồng ñộ insulin – diện tích ñỉnh 7.7 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 4 IU/ml (thể tích tiêm 20µl) 7.8 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 8 IU/ml (thể tích tiêm 20µl) 7.9 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 12 IU/ml (thể tích tiêm 20µl) 7.10 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 16 IU/ml (thể tích tiêm 20µl) 7.11 – Sắc ký ñồ mẫu thử chế ñộ lên men 1 (thể tích tiêm 200µl) DANH MỤC BẢNG 2.1 – Phân loại khoa học của Pichia pastoris 2.2 – Các ứng dụng lên men sản xuất protein từ Pichia pastoris 3.1 – Các thí nghiệm của thực nghiệm yếu tố từng phần với 4 yếu tố 3.2 – Các mức của các yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa 3.3 – Các thí nghiệm ñược thiết kế của thực nghiệm yếu tố từng phần 3.4 – Chương trình chạy pha ñộng theo gradient cho HPLC 4.1 – Kết qủa các hệ số hồi quy 4.2 – Kết qủa tối ưu hóa các yếu tố thực nghiệm 4.3 – So sánh khả năng tăng trưởng và cảm ứng tổng hợp mini-proinsulin của 3 chế ñộ lên men ở quy mô fermenter 7.1 – Kết qủa các thí nghiệm thực nghiệm yếu tố từng phần 7.2 – Kết qủa các thí nghiệm tối ưu hóa thực nghiệm ñường dốc nhất 7.3 – Sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và pH theo thời gian trong khảo sát ñường cong tăng trưởng ở quy mô erlen 7.4 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và hàm lượng tổng protein ngoại bào trong chế ñộ lên men 1 7.5 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và hàm lượng tổng protein ngoại bào trong chế ñộ lên men 2 7.6 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và hàm lượng tổng protein ngoại bào trong chế ñộ lên men 3 7.7 – Kết qủa chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC Trang 13 PHẦN 1 MỞ ðẦU Phần 1: Mở ñầu Trang 14 1.3. ðẶT VẤN ðỀ Bệnh tiểu ñường hay ñái tháo ñường (diabetes) với những biến chứng nguy hiểm có thể dẫn ñến tử vong ñã và ñang gây thiệt hại lớn về kinh tế - xã hội toàn cầu. Mỗi năm, nhân Ngày ðái tháo ñường thế giới 14-11, người ta lại lựa chọn một chủ ñề hành ñộng nhằm kêu gọi cộng ñồng hãy quan tâm ñến căn bệnh này, có những hiểu biết cần thiết ñể phòng chống nó; những người bị tiểu ñường hoặc có nguy cơ bị tiểu ñường ñều xứng ñáng ñược hưởng chất lượng giáo dục, phòng ngừa và chăm sóc tốt nhất hiện có. Chủ ñề của ngày tiểu ñường thế giới năm 2007 vừa qua là “Ngày ñái tháo ñường của trẻ em và tuổi vị thành niên” với hy vọng mọi người hãy chung tay ngăn chặn căn bệnh nguy hiểm này. Theo Hiệp hội ðái tháo ñường quốc tế (IDF), ñây là năm ñầu tiên Liên hợp quốc tổ chức ngày ñái tháo ñường trên toàn thế giới với chủ ñề này vì có tới 95% bệnh nhân ñái tháo ñường mắc ở tuýp 2 và ñáng báo ñộng là số lượng bệnh nhân là trẻ em và vị thành niên ngày càng nhiều [43, 45]. Trong những năm gần ñây, các nhà khoa học và các công ty dược phẩm/công nghệ sinh học trên khắp thế giới ñã và ñang nỗ lực không ngừng ñể ñưa ra những giải pháp hiệu qủa trong việc sản xuất insulin tái tổ hợp từ vi sinh vật theo quy mô công nghiệp nhằm ñáp ứng ñược nhu cầu với số lượng lớn và khắc phục các nhược ñiểm của việc sử dụng insulin thu nhận theo cách truyền thống về giá thành và các tác dụng phụ không mong muốn. Theo số liệu năm 2007, Việt Nam ñã có khoảng 1,3 triệu người mắc bệnh tiểu ñường và số người mắc bệnh có khả năng tăng gấp ñôi vào năm 2025 [43, 45]. Hiện nay, các bệnh nhân tiểu ñường ở Việt Nam ñang ñược ñiều trị bằng nguồn insulin nhập khẩu từ nước ngoài. Nhu cầu về insulin ở Việt Nam ñã và ñang thúc ñẩy chúng ta bắt ñầu có những chính sách, chiến lược chú trọng ñến việc nghiên cứu ñể trong tương lai gần Việt Nam có thể ứng dụng sản xuất insulin tái tổ hợp theo quy mô công nghiệp. Chính vì vậy, một vấn ñề quan trọng, cấp thiết cần ñược quan tâm ñó là việc nghiên cứu công Phần 1: Mở ñầu Trang 15 nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên một số ñối tượng vi sinh vật công nghiệp (trong ñề tài này chúng tôi sử dụng ñối tượng nấm men Pichia pastoris với nhiều ưu ñiểm ñang nhận ñược nhiều sự quan tâm của giới khoa học) nhằm tiến tới khả năng triển khai ứng dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp trong ñiều kiện thực tế ở Việt Nam. Với mục ñích góp một phần nhỏ vào các nghiên cứu nhằm triển khai quy trình lên men sản xuất insulin tái tổ hợp theo quy mô công nghiệp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin tái tổ hợp từ tế bào Pichia” 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.2.3. Các nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới: Vào ñầu những năm 1980, hãng Eli Lilly và Genentech Inc. của Mỹ ñã ñưa ra quy trình sản xuất insulin người tái tổ hợp từ Echerichia coli. Nhờ công nghệ này mà hiện nay insulin ñã ñược sản xuất ñại trà với giá thành rẻ hơn nhiều so với trước kia [6]. Các nhà khoa học ñã sử dụng các gene nhân tạo mã hoá cho các chuỗi A và B và ñưa vào trong tế bào vi khuẩn Echerichia coli ñể tổng hợp insulin tái tổ hợp. Các chuỗi A và B sau ñó sẽ ñược gắn với nhau bởi cầu disulphide trong ống nghiệm. [6, 11, 39]. Tuy nhiên, phương pháp này gặp nhiều khó khắn. Trở ngại lớn nhất là sự hình thành cầu disulfide xảy ra khá ngẫu nhiên nên làm ảnh hưởng ñến cấu trúc và hoạt tính insulin [39]. Trước những khó khăn ñó, các nhà khoa học ñã cải tiến phương pháp bằng cách nhân dòng chuỗi DNA pro-insulin hay những dạng chuyển hóa của nó (bằng cách thay ñổi chiều dài, kích cỡ của peptide C) trong các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men; nổi bật vẫn là Echerichia coli, Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris. Cách làm này có ưu ñiểm hơn là insulin ñược tổng hợp có hoạt tính cao hơn. Tuy nhiên, một vấn ñề cần lưu ý ñó là ñoạn peptide C hay những vị trí ñược biến ñổi ñôi chút ở trong peptide C ñặc biệt nhạy cảm bởi enzyme cắt trong tế bào chủ, dễ bị phân hủy bởi protease trước Phần 1: Mở ñầu Trang 16 khi hình thành nên cầu disulfide dẫn ñến kết quả là tạo ra các chuỗi peptide A, B và C riêng biệt. Sau này, các nhà khoa học tiếp tục thay chuỗi polypeptide C bằng các peptide nối có kích thước nhỏ hơn (chỉ vài amino acid) và tiền insulin này ñược gọi là mini-proinsulin [39]. Cho ñến ngày nay người ta vẫn thương mại hoá các phương pháp sử dụng các ñối tượng Echerichia coli và Saccharomyces cerevisiae. Gần ñây, các nhà khoa học ñã và ñang không ngừng quan tâm nghiên cứu nhằm tiến tới thương mại hoá phương pháp sử dụng một ñối tượng mới hoàn hảo hơn ñó là nấm men Pichia pastoris. Promoter alcohol oxidase trong nấm men Pichia pastoris là một promoter mạnh và hoạt ñộng rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và ñiều khiển việc sản xuất protein ngoại. Nhờ sự ñiều khiển sản xuất rất chặt chẽ nên các biến ñổi sau phiên mã ở Pichia pastoris phù hợp hơn cho việc sử dụng ở người. Pichia pastoris phát triển trên môi trường khoáng chất ñơn giản và không tiết ra protein của bản thân nó nhiều nên dịch nuôi cấy chứa protein ngoại tiết ra sẽ tương ñối tinh khiết giúp cho việc chiết tách và tinh chế nó sẽ thuận lợi, dễ thực hiện. Do các protein ñược sản xuất từ Pichia pastoris có những biến ñổi sau dịch mã chính xác và tiết ra môi trường nên việc lên men sản xuất protein tái tổ hợp nói chung và insulin người nói riêng từ Pichia pastoris ñã cung cấp một giải pháp thay thế xuất sắc cho những hệ thống biểu hiện ở Echerichia coli [35]. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris ñã ñược sử dụng thành công ñể sản xuất insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 600 mg/L (Brierley và các cộng sự, 1998), human insulin precursor 500 mg/L (Wang Y và các cộng sự, 2001), mini-proinsulin (B1−30-Lys-ArgA1−21) 300 mg/L (José M. País-Chanfrau và các cộng sự, 2004), monomeric insulin precursor (MIP) 200 mg/L (Jin-Guo DING và các cộng sự, 2005).v.v.. 1.2.4. Các nghiên cứu, ứng dụng trong nước: Các nhà khoa học Việt Nam hiện nay chỉ mới dừng lại ở các nghiên cứu tạo dòng một số ñối tượng vi sinh vật công nghiệp tạo insulin tái tổ hợp (các ñề tài này tập trung ở Phần 1: Mở ñầu Trang 17 các Viện nghiên cứu và các trường ðại học chẳng hạn như Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM .v.v…). Hiện nay, Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM ñã tiến hành thành công giai ñoạn nghiên cứu tạo dòng nấm men Pichia pastoris mang gene mã hóa mini-proinsulin trong ñề tài nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris. Chính vì vậy rất cần có những nghiên cứu ñi sâu vào kỹ thuật lên men, khảo sát qúa trình lên men có kiểm soát sản xuất insulin tái tổ hợp trong fermenter. ðề tài chúng tôi ñang thực hiện là giai ñoạn tiếp theo của ñề tài nói trên nhằm nghiên cứu khảo sát quy trình lên men sản xuất mini-proinsulin trong fermenter, tiến tới khả năng triển khai ứng dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp. Phần 1: Mở ñầu Trang 18 PHẦN 2 TỔNG QUAN Phần 2: Tổng quan Trang 19 2.5. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ðƯỜNG 2.1.5. Tiểu ñường là gì? [1, 32, 33, 34, 36, 37, 40, 44] Tiểu ñường là một bệnh mà trong ñó mức glucose trong máu trên mức bình thường. Người mắc tiểu ñường có các vấn ñề về chuyển hóa thức ăn thành năng lượng. Sau khi ăn, thức ăn ñược chuyển hóa thành ñường glucose, ñược mang vào trong máu tới các tế bào ở khắp cơ thể. Các tế bào sử dụng insulin, hormone ñiều hoà ñường huyết ñược sản xuất bởi tuyến tụy, ñể giúp chúng chuyển hóa ñường trong máu thành năng lượng. Con người tiến triển ñến mắc bệnh tiểu ñường bởi vì tuyến tụy không sản xuất ñủ insulin hay bởi vì các tế bào ở các cơ, gan, và mỡ không sử dụng insulin hợp lý, hay là do cả hai nguyên nhân trên. Kết quả là số lượng ñường trong máu tăng lên trong khi các tế bào chết vì thiếu năng lượng. Qua nhiều năm, mức ñường trong máu cao, ñược gọi là hyperglycemia, gây hư hỏng các dây thần kinh và các mạch máu, mà có thể dẫn ñến các biến chứng như là bệnh tim mạch và ñột qụy, bệnh thận, mù, các vấn ñề về thần kinh, nhiễm trùng lợi, hoại tử .v.v… Tiền tiểu ñường là gì? Ở tiền tiểu ñường, mức glucose máu cao hơn bình thường nhưng không ñủ cao ñặc trưng cho tiểu ñường. Tuy nhiên, nhiều người mắc tiền tiểu ñường tiến triển thành tiểu ñường tuýp 2 trong vòng 10 năm. Tiền tiểu ñường cũng tăng nguy cơ bệnh tim và ñột qụy. Với sự giảm cân vừa phải và ñiều chỉnh hoạt ñộng thể chất, người mắc tiền tiểu ñường có thể trì hoãn hay ngăn chặn tiến triển thành tiểu ñường tuýp 2. 2.1.6. Các dạng tiểu ñường [1, 32, 33, 34, 36, 37, 40, 44] Bệnh tiểu ñường có hai dạng chính: tuýp 1 và tuýp 2. Gần ñây, nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ cho thấy có thể xuất hiện dạng mới của bệnh tiểu ñường – tuýp 3 [46]. Phần 2: Tổng quan Trang 20 2.1.6.1. Tiểu ñường tuýp 1 Tiểu ñường tuýp 1 (trước kia thường ñược gọi là tiểu ñường phụ thuộc insulin hoặc tiểu ñường khởi phát ở trẻ em) ñặc trưng bởi thiếu sản sinh insulin (do tuyến tụy tiết qúa ít hoặc không tiết insulin), phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi. Nếu không cung cấp insulin hằng ngày, tiểu ñường tuýp 1 rất dễ gây tử vong. Nhóm này chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân tiểu ñường. Các triệu chứng bao gồm ñi tiểu nhiều, khát nước, luôn ñói, giảm cân, thay ñổi thị lực và mệt mỏi. Những triệu chứng này có thể xảy ra ñột ngột. Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 1: thức ăn vào dạ dày sẽ ñược biến ñổi thành glucose, sau ñó glucose này sẽ ñi vào trong máu. ðối với người bị bệnh tiểu ñường tuýp 1 thì tuyến tụy tiết rất ít hoặc không tiết insulin ñi vào máu ñể ñiều hòa lượng glucose trong máu dẫn ñến lượng glucose trong máu tăng cao. Hình 2.1 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 1 Phần 2: Tổng quan