Tài liệu Thạc sỹ sinh học Biểu hiện và tiết Enzym Nattokinase tái tổ hợp ở Bacillus subtilis

Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Biểu hiện và tiết Enzym Nattokinase tái tổ hợp ở Bacillus subtilis ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ KHÁNH HỒNG BIỂU HIỆN VÀ TIẾT ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP Ở BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ THÚY ÁI THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012 Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI 3 1.1.1. Khái niệm về huyết khối 3 1.1.2. Tình hình nghẽn mạch do huyết khối 3 1.1.3. Cơ chế hình thành huyết khối 4 1.1.4. Sự phân hủy huyết khối bởi enzym nội sinh plasmin 8 1.1.5. Các nhân tố trong điều trị bệnh nghẽn mạch do huyết khối 9 1.2. NATTOKINASE 12 1.2.1. Nguồn gốc, đặc tính của Nattokinase 12 1.2.2. Cơ chế phân hủy fibrin của Nattokinase 14 1.2.3. Sinh tổng hợp và sản xuất Nattokinase 15 1.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp trong và ngoài nước 17 1.3. CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 19 1.3.1. Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ E. coli và Bacillus subtilis 19 1.3.2. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector sát nhập 20 1.3.3. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector plasmid có khả năng tự sao chép 25 1.4. HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS 27 Luận văn Thạc sĩ Sinh học CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 29 2.1.1. Dụng cụ 29 2.1.2. Thiết bị 29 2.1.3. Hóa chất 30 2.1.4. Môi trường 33 2.1.5. Vật liệu sinh học 34 2.2. PHƯƠNG PHÁP 37 2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37 2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38 2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ 2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39 2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40 2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46 và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5 48bào khả nạp E. coli DH5 2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49 2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B. subtilis 49 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa gen aprE 50 2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE 52 2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53 2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54 2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54 2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO 56 3.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN 59 3.2.1. Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. phân lập từ Natto 59 3.2.2. Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ 3.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli mang gen aprE 61 có mang plasmid chứa gen aprE 613.2.3.1. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE3.2.3.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 bằng phương pháp PCR 61 có mang plasmid chứa gen aprE3.2.3.3. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5 bằng phương pháp cắt bằng enzym cắt hạn chế 63 3.2.3.4. Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase 64 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 3.3. DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU HIỆN Ở BACILLUS 68 3.3.1. Hệ thống biểu hiện pAX01 68 3.3.2. Hệ thống biểu hiện pBG01 72 3.4. TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74 3.4.1. Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào bộ gen các chủng Bacillus subtilis 75 3.4.2. Dòng hóa casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pgrac vào bộ gen các chủng Bacillus subtilis DB104 78 3.5. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE 80 3.5.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80 3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83 3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85 3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85 3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86 CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 88 4.2. ĐỀ NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC 93 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Luận văn Thạc sĩ Sinh học -iDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Amp APC bp dH 2 O dNTP DNA EDTA EGTA Ery GRAS Kb kDa LB LS MCS Neo OD PAI-1 pB PCR Rnase SD Amp icillin Activated Protein C base pair Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ distilled water DeoxyriboNucleotide Triphosphate DeoxyriboNucleic Acid Ethylene Diamine TetraAcetic Acid Ethylene Glycol Tetraacetic Acid Erythromycin Generally recognized as safe organism Kilobaze kilo Dalton Luria – Bertani Linsmaier - Skoog Multicloning site Neomycin Optical Density Plasminogen Activator Inhibitor 1 pBluescript II KS (+) Polymerase chain reaction RiboNuclease Shine - Dalgarno Kháng sinh ampicillin Protein hoạt hóa C Cặp baze Nước cất Các loại axít nucleotid Axít deoxyribonucleic Kháng sinh erythromycin Vi sinh vật an toàn Trọng lượng kDa Môi trường LB Môi trường LS Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Vị trí tạo dòng Kháng sinh neomycin Mật độ quang học Chất kìm hãm hoạt hóa plasminogen Plasmid pB Phản ứng PCR Enzym Rnase Trình tự gắn ribosom Luận văn Thạc sĩ Sinh học - ii SDS SDSPAGE SK Spec TE tPA TAE u-PA X-gal S odium D odecyl S ulphate SDS-PolyAcrylamide Gel Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Electrophoresis Streptokinase Spectinomycin Tris-EDTA tissue Plasminogen Activator Tris-Acetic acid- EDTA urokinase Plasminogen Activator 5-bromo-4 chloro-3 indolyl-beta-Dglactoside Dung dịch SDS Điện di SDS-PAGE Thuốc chống đông máu Kháng sinh spectinomycin Dung dịch TE Chất hoạt hóa plasminogen mô Dung dịch đệm chạy điện di TAE Chất hoạt hóa plasminogen urokinase Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu 6 Bảng 2.1. Thành phần môi trường HS 33 Bảng 2.2. Thành phần môi trường LS 34 Bảng 2.3. Các trình tự mồi được sử dụng trong luận văn 36 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR 39 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV 42 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối pB và aprE 43 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE bằng BamHI . 43 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI 45 Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII 45 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng nối 45 Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng BamHI và XbaI 47 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng nối 47 Bảng 3.1. So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus 87 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cơ chê hình thành huyết khối 5 Hình 1.2. Sự hoạt hóa và tác động lẫn nhau của các yếu tố đông máu 7 Hình 1.3. Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo 9 Hình 1.4. Sản phẩm Natto 13 Hình 1.5. Cơ chế phân giải fibrin in-vivo bởi Nattokinase 14 Hình 1.6. Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA được sử dụng trong luận văn 23 Hình 1.7. Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng tại locus lacA . 24 Hình 1.8. Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 được sử dụng trong luận văn 26 Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37 Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40 Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57 Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto . 58 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng phân lập sau 6 giờ ủ 59 Hình 3.4. DNA bộ gen chủng Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% . 60 Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5  có mang pB-aprE bằng phản ứng PCR 62 Hình 3.6. Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E. coli DH5  có mang pB-aprE tương ứng bằng phản ứng PCR, bản mẫu là các plasmid . 63 Luận văn Thạc sĩ Sinh học -vHình 3.7. Kết quả đại diện chọn dòng tế bào E. coli DH5  có mang pB- aprE bằng enzym cắt hạn chế BamHI 64 Hình 3.8. Trình tự peptide trưởng thành gồm 275 amino acid ở Nattokinase 65 Hình 3.9. So sánh một phần trình tự nucleotide gen aprE của chủng phân lập với trình tự chuẩn 66 Hình 3.10. Trình tự codon mã hóa gen aprE khuyết cytosine tại vị trí 437 66 Hình 3.11a. Trình tự gen aprE của chủng B2 cho thấy có sự khác biệt 9 nucleotide so với aprE công bố 67 Hình 3.11b. Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với Nattokinase cho thấy khác biệt ở vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 ở Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ peptide trưởng thành) 68 Hình 3.12. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 1012, DB104 69 Hình 3.13. Kết quả dòng hóa ở E. coli DH5  70 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi pAX01F/aprE-R. 71 Hình 3.15. Plasmid tái tổ hợp cắt với EcoRV. 71 Hình 3.16. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 . 72 Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprEF/pMTL-R. 73 Hình 3.18. Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE cắt với HindIII 74 Hình 3.19. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis 1012 khả nạp trên 2 đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh . 76 Hình 3.20. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R 77 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - vi Hình 3.21. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR với bản mẫu là bộ gen, mồi pAX01-F/aprE-R. 78 Hình 3.22. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis DB104 khả nạp trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh chloramphenicol. 79 Hình 3.23. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprEF/pMTL-R 79 Hình 3.24. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R 80 Hình 3.25. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ nuôi cấy 81 Hình 3.26. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82 Hình 3.27. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P Sgrac 84 Hình 3.28. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P Sgrac 85 Hình 3.29. Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86 Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Luận văn Thạc sĩ Sinh học -1Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Philippin do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống. Nếu huyết tụ ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay huyết khối xơ vữa) sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây. Huyết khối xơ vữa đã thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người. Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và thu hút nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì Natto chứa enzym phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố mang đến sự Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ trường thọ cho người Nhật. Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Enzym này có khả năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối. Hơn nữa, Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc). Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết tụ thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (tPA). Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể. Nattokinase có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp 4 lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy Nattokinase phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu trúc huyết khối trong cơ thể. Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm sàng và không gây phản ứng phụ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học -2Từ trước đến nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể. Thực Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ tế, Nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định. Vì thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong tự nhiên ở Bacillus subtilis natto khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa. Tuy nhiên, các công nghệ này thường ít được công bố. Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật Bản và Đài Loan. Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc và Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng. Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm từ Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao. Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hướng của nhiều công ty trong nước. Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng. Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau: Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật Bản Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector khác nhau ở Escherichia coli Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104. Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 29 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Dụng cụ Một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Vi sinh như sau: que cấy, que trải, đèn l), đầu típ các loại,l, 100-1000l, 20-100l, 10-100cồn, eppendorf, bộ pipetman (0,5-10 ống đong, ống falcon các loại, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm thủy tinh, đĩa petri, tăm vô trùng, bình tia, thùng đá, giấy thấm, kéo, kẹp, bông thấm, bông không thấm, giấy bạc, găng tay cao su, đồng hồ bấm giây… 2.1.2. Thiết bị - Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology) Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ - Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V) - Bộ điện di protein (Biorad) - Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich Zentrifugen) - Máy đo quang phổ Ultrospec 2000 - Máy đo quang phổ chuyên dụng GenQuantpro (Amersham Biosciences) - Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific) - Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences) - Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY) - Máy điều nhiệt theo chu kì Eppendorf Mastercycler Personal - Máy Vortex (IKA, Mỹ) - Máy đo pH (Orion, Anh) - Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức) - Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ) - Bể ổn nhiệt (Memmert) - Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ) - Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh ) - Tủ mát 4 o C (Nhật ), Tủ lạnh -20 o C (Nhật ) Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 30 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong luận văn bao gồm: a) Hóa chất dùng cho tách chiết DNA vi khuẩn - Lysis buffer: 0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0 - Dung dịch SDS 10%, - Lysozym 20mg/ml, Proteinase K 20mg/ml - Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0 - Chloroform, Sodium acetat 3M - Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20 o C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20 Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ o C) - Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0 b) Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn - Dung dich I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0 - Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N - Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH 3 COOK 0,2M pH 4,8 - RNase 10mg/ml - Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0 - Chloroform, Sodium acetat 3M - Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20 o C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20 o C) - Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0 c) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) - PCR buffer Taq DNA polymerase 10X - PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X - Dung dịch MgCl 2 , MgSO 4 25mM - dNTP 8mM - Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R - Nước cất hai lần (ddH2O) Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 31 d) Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose - Agarose (Sigma), Safe View - Ethidium bromide 10mg/ml, Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ - Dung dịch điện di TAE 50X (242g Tris, 57,1g acetic acid băng, 100ml EDTA 500 mM trong 1 lít). - Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%, bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% và EDTA 60mM). e) Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE - Dung dịch tạo gel polyacrylamide 12,5%: gel polyacrylamide 100x100x0,75mm nồng độ 12,5% polyacrylamide có thành phần như sau: + Gel phân tích 12% (4 gel): nước cất 4,46ml, Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 3,95ml, ll SDS 10%, 7930% Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 7,1ml, 157,5 l TEMEDammonium persulfate 10%, 7,9 + Gel gom 4% (4 gel): nước cất 3,5ml, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) 1,625ml, 30% l ammoniuml SDS 10%, 15Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 2,264 ml, 75 l TEMEDpersulfate 10%, 5 - Dung dịch điện di 5X: Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml, pH 8,3 - Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris-HCl 0,3M, SDS 10,28%, glycerol 36%, DTT 0,6M, bromophenol blue 0,012%, pH 6,8 - Dung dịch nhuộm gel: coomassie brilliant blue 0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml, glacical acetic acid 25ml, nước cất đủ 250ml - Dung dịch giải nhuộm: glacical acetic acid 100ml, ethanol tuyệt đối 100ml, nước cất đủ 1000ml f) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế - Enzym: BamHI, SacII, HindIII, EcoRV, EcoRI, XbaI - Buffer Blue 10X, Green 10X, Red 10X Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 32 g) Hóa chất dùng cho tinh chế phản ứng PCR và phản ứng cắt - Chloroform, Sodium acetat 3M - Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20 o C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20 o C) Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ h) Hóa chất dùng cho phản ứng nối - Enzym T4 DNA ligase - Buffer ligation 10X - ATPase, PEG i) Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen - Xylose 25%, IPTG 100mM - Dung dịch TE, Tris 1M - Enzym lysozym - TCA 100% - Ethanol tuyệt đối lạnh, Ethanol 70% lạnh j) Kháng sinh Ampicillin, Spectinomycin, Erythromycin, Neomycin, Chloramphenicol k) Hóa chất làm tế bào khả nạp E. coli DH5  - Glycerol 50% (hấp riêng) (giữ ở 4 o C) - CaCl 2 1M (hấp riêng) (giữ ở 4 o C) - Hỗn hợp dung dịch CaCl 2 0.1M và Glycerol 15% vô trùng (giữ ở 4 o C) l) Hóa chất cho xác định hoạt tính Nattokinase - Tris-HCl 1M (pH 7,8) - Fibrin heo 0.12% - TCA 0,1M Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 33 -