Tài liệu Tạo chủng edw ardsiella ictaluri đột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá tra

Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ************ NGUYỄN TRỌNG BÌNH TẠO CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP GEN SỬ DỤNG LÀM VACCINE NGỪA BỆNH MỦ GAN CHO CÁ TRA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ************ NGUYỄN TRỌNG BÌNH TẠO CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP GEN SỬ DỤNG LÀM VACCINE NGỪA BỆNH MỦ GAN CHO CÁ TRA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP.HỒ CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học: TSKH. NGUYỄN QUỐC BÌNH ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... Cán bộ chấm nhận xét 1: ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... Cán bộ chấm nhận xét 2: ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA. Ngày….tháng….năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc TP.HCM, Ngày ….tháng….năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: NGUYỄN TRỌNG BÌNH Phái: Nam Sinh ngày: 05/02/1982 Nơi sinh: Phú Yên Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106664 Năm trúng tuyển: 2006 1. TÊN ĐỀ TÀI: “Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá” 2. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Phân lập và phát hiện vi khuẩn gây bệnh mủ gan trên cá tra Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu tiên của gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen cuối của gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu (HpurA) và đoạn gen cuối (HpurA) của gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen KmR từ pcambia Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid chứa gen purA biến đổi Tạo E. ictaluri đột biến gen purA 3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 25 tháng 02 năm 2008 4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 30 tháng 11 năm 2008 5. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Học hàm, học vị, họ tên và chữ ký) Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua. Ngày….tháng….năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH LỜI CẢM ƠN Con thành kính biết ơn công lao to lớn của Cha Mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng để con có ngày hôm nay, Xin chân thành cảm ơn! Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. Đặc biệt cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Quốc Bình đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Tp.HCM, Tháng 11 năm 2008. Nguyễn Trọng Bình TÓM TẮT Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có tiềm năng lớn về xuất khẩu đem lại lợi ích rất lớn cho người nuôi ở Việt Nam. Mỗi năm Việt Nam sản xuất được khoảng 1 triệu tấn, sản lượng cá tra nước ta năm 2008 có thể đạt 1,3 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 1,6 tỉ USD. Song hiện tại ngành nuôi trồng cá tra đang gặp nhiều khó khăn do xuất hiện nhiều loại bệnh, trong đó bệnh đốm trắng (bệnh mủ gan) là một trong những bệnh chính gây ra bởi Edwardsiella ictaluri. Hiện tại chưa có vaccine phòng bệnh, người nuôi chủ yếu là trị bệnh cho cá bằng thuốc kháng sinh. Sử dụng vaccine trong việc ngừa bệnh mủ gan cho cá tra đang là vấn đề cấp thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết lập qui trình tạo chủng đột biến Edwardsiella ictaluri nhược độc bằng phương pháp knock-out gene (đột biến mất gen) trên Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt Nam. Hai đoạn đầu và cuối của gen purA mã hóa adenylosuccinate synthetase được phân lập và tạo dòng. Sau đó gen kháng kháng sinh kanamycin được chèn gen vào giữa đoạn đầu và cuối của gen purA. Để thu nhận được chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gen purA, chúng tôi tiến hành theo 2 phương pháp: điện biến nạp và tiếp hợp. Trong phương pháp điện biến nạp, đoạn gen purA biến đổi được biến nạp vào Edwardsiella ictaluri hoang dại. Đối với phương pháp tiếp hợp, đoạn gen purA biến đổi được nhân dòng trong E. coli SM10 λ pir bằng vector suicide pGP704, rồi cho tiếp hợp với Edwardsiella ictaluri hoang dại. Tất cả các plasmid dùng cho việc tạo chủng đột biến Edwardsiella ictaluri đã được thiết lập, việc chọn chủng đột biến đang được tiến hành. ABSTRACT Tra catfish (Pangasius hypophthalmus) is one of the fish species having essential export to benefit for pisciculturists in Viet Nam. Every year, Viet Nam harvests approximately 1 million tonnes tra catfish, production of tra catfish will have been brought 1.3 million tonnes in 2008, export turn-over will be 1.6 billion USD. At present, aquaculture of tra catfish is meeting many serious difficulties causing many appearing pathogens, among them, white spot disease (liver pus disease) is one of the main diseases caused by Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri). Nowadays, nonvaccination for prevention of disease, pisciculturists mainly use antibiotics to treat for fish, so use of vaccine for liver pus disease prevention of tra catfish is necessary. In this study, we founded a process making attenuated live E. ictaluri strain by knock-out gene method (deleted gene) on E. ictaluri causing disease for tra catfish in Viet Nam. Head and tail gene fragment of purA encoding adenylosuccinate synthetase was isolated and cloned. After that, gene against kanamycin antibiotic was inserted between head and tail fragment of purA gene. To take in purA mutant E. ictaluri strain, we conducted both transformation electroporation and conjugate method. According to the transformation electroporation, modified purA gene fragment was tranformed into wild E. ictaluri. For bacterial conjugate method, modified purA gene fragment was cloned in E. coli SM10 λ pir by means of suicide pGP704 afterwards the genetic information from E. coli SM10 λ pir was transfered to wild E. ictaluri by conjugation. All the used plasmids for formed mutant E. ictaluri strain were founded, and selection of mutant E. ictaluri strain has being carried out. vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm ơn ..................................................................................................................iii Tóm Tắt .......................................................................................................................iv Mục lục........................................................................................................................vi Danh sách các bảng .....................................................................................................x Danh sách các hình......................................................................................................xi Danh sách sơ đồ ..........................................................................................................xiii Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu ...............................................................................................................2 1.3. Nội dung...............................................................................................................2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra............................4 2.2.Giới thiệu vaccine và các lọai vaccine ..................................................................6 2.2.1.Giới thiệu vaccine .............................................................................................6 2.2.2.Các loại vaccine .................................................................................................7 2.3. Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.3.1. Tình hình trên thế giới.......................................................................................9 2.3.2. Tình hình trong nước.........................................................................................10 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................11 3.2. Hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm ....................................................11 vii 3.2.1. Hóa chất ............................................................................................................11 3.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm ................................................................13 3.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................15 3.3.1. Phát hiện vi khuẩn gây bệnh mủ gan trên cá tra ...............................................17 3.3.1.1. Thu mẫu .........................................................................................................17 3.3.1.2. Phương pháp kiểm tra và mổ khám bệnh tích................................................17 3.3.1.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn có trong mẫu bệnh phẩm ............................18 3.3.1.4. Phương pháp nhuộm Gram ............................................................................18 3.3.1.5. Thiết kế primer...............................................................................................18 3.3.1.6. Khuếch đại vùng gen nằm giữa gen serC và aroA bằng PCR .......................19 3.3.1.7. Giải trình tự ....................................................................................................20 3.3.2. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa gen purA .........20 3.3.2.1. Thiết kế primer...............................................................................................21 3.3.2.2. Khuyếch đại gen purA bằng PCR ..................................................................22 3.3.2.3. Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α ........................................22 3.3.2.4. Khẳng định dòng biến nạp bằng PCR............................................................24 3.3.2.5. Giải trình tự plasmid tái tổ hợp .................................................................... 24 3.3.3.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu tiên của gen purA ........................................................................................................25 3.3.3.1. Thiết kế primer dựa vào trình tự đầu của gen purA từ ngân hàng gen .........25 3.3.3.2. Khuyếch đại đoạn gen đầu tiên của gen purA bằng PCR ..............................25 3.3.3.3. Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α .......................................26 3.3.3.4. Khẳng định dòng biến nạp bằng PCR và phản ứng cắt giới hạn ..................26 3.3.3.5. Giải trình tự plasmid tái tổ hợp ......................................................................27 3.3.4. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen cuối của gen purA ...............................................................................................................27 3.3.4. 1.Thiết kế primer dựa vào trình tự cuối của gen purA từ ngân hàng gen ........27 3.3.4. 2. Khuyếch đại đoạn gen cuối của gen purA ....................................................27 3.3.4.3. Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α .......................................28 viii 3.3.4.4. Khẳng định dòng biến nạp bằng PCR và phản ứng cắt ................................28 3.3.4.5. Giải trình tự plasmid tái tổ hợp ......................................................................28 3.3.5.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu (HpurA) và đoạn gen cuối (TpurA) của gen purA ......................................................29 3.3.5.1. Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α ........................................29 3.3.5.2. Khẳng định dòng biến nạp bằng PCR và phản ứng cắt ................................32 3.3.6.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen KmR từ pcambia ...................................................................................................................32 3.3.6.1.Thiết kế primer dựa vào gen KmR .................................................................32 3.3.6.2.Khuyếch đại đoạn gen KmR ...........................................................................33 3.3.6.3. Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α .......................................33 3.3.6.4. Khẳng định dòng biến nạp bằng PCR và phản ứng cắt giới hạn ...................34 3.3.6.5. Giải trình tự plasmid tái tổ hợp ......................................................................34 3.3.7. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid chứa gen purA biến đổi .............35 3.3.7.1. Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α ........................................35 3.3.7.2. Khẳng định dòng biến nạp bằng PCR và phản ứng cắt giới hạn ..................36 3.3.8. Tạo E. ictaluri đột biến gen purA .....................................................................36 3.3.8.1. Tạo E. ictaluri đột biến gen purA bằng phương pháp điện biến nạp.............36 3.3.8.2. Tạo E. ictaluri đột biến gen purA bằng phương pháp tiếp hợp .....................38 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Phát hiện vi khuẩn E. ictaluri...............................................................................41 4.1.1. Phân lập vi khuẩn trên môi trường BHI............................................................41 4.1.2. Chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường EIM .........................................................41 4.1.3. Xem hình thái vi khuẩn .....................................................................................41 4.1.4. Khuếch đại vùng gen nằm giữa gen serC và aroA từ các khuẩn lạc trên .........42 4.1.5. Giải trình tự vùng gen nằm giữa gen serC và aroA ..........................................44 4.2. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa gen purA ...........45 4.2.1. Khuyếch đại gen purA.......................................................................................45 4.2.2. Nhân dòng gen purA trong E.coli bằng pJET1.2/blunt.....................................46 ix 4.2.3. Kết quả giải trình tự pJET-purA ......................................................................47 4.3.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen HpurA..49 4.3.1. Khuyếch đại đoạn gen HpurA ...........................................................................49 4.3.2. Nhân dòng gen HpurA trong E.coli bằng pJET1.2/blunt..................................49 4.3.3. Kết quả giải trình tự pJET-HpurA....................................................................51 4.4.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen TpurA ..53 4.4.1. Khuyếch đại đoạn gen TpurA ...........................................................................53 4.4.2. Nhân dòng gen TpurA trong E.coli bằng pJET1.2/blunt ..................................54 4.4.3. Kết quả giải trình tự pJET-TpurA ....................................................................55 4.5. Tạo dòng gen TpurA trong E.coli mang pJET1.2/blunt chứa gen HpurA ...........56 4.6.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen KmR từ pcambia ...................................................................................................................58 4.6.1.Khuyếch đại đoạn gen KmR ...............................................................................58 4.6.2. Nhân dòng gen KmR trong E.coli bằng pJET1.2/blunt.....................................59 4.6.3. Kết quả giải trình tự pJET- KmR ......................................................................60 4.7. Tạo dòng gen KmR trong E.coli bằng pJET1.2/blunt chứa gen HpurA và TpurA ..........................................................................................................................62 4.8. Tạo E. ictaluri đột biến gen purA ........................................................................63 4.8.1. Tạo E. ictaluri đột biến gen purA bằng phương pháp điện biến nạp................63 4.8.2. Tạo E. ictaluri đột biến gen purA bằng phương pháp tiếp hợp ........................64 Phần 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ................................................................................................................65 5.2. Đề nghị .................................................................................................................65 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................66 Phụ lục x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1: Kết quả so sánh trình tự vùng gen nằm giữa gen serC và aroA của E. ictaluri được phân lập từ Phường Thới An- Quận Ô Môn-TP cần Thơ với dữ liệu vùng gen nằm giữa gen serC và aroA của chủng E. ictaluri 93-146 trên GeneBank của NCBI bằng công cụ blast. Bảng 4.2: Kết quả so sánh trình tự purA của E. ictaluri được phân lập từ Phường Thới An –Quận Ô Môn-TP cần Thơ với dữ liệu gen purA của chủng E. ictaluri 93-146 trên GeneBank của NCBI bằng công cụ blast Bảng 4.3: Kết quả so sánh trình tự H purA với dữ liệu trên GeneBank của NCBI bằng công cụ blast. Bảng 4.4: Kết quả so sánh trình tự TpurA với dữ liệu trên GeneBank của NCBI bằng công cụ blast. Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự genKmR với dữ liệu trên GeneBank của NCBI bằng công cụ blast. xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1: Khuẩn lạc của E. ictaluri phát triển trên môi trường BHI sau 72 giờ. Hình 4.2: Hình thái của vi khuẩn E. ictaluri dưới vật kính dầu (x 100 ). Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR của khuẩn lạc biến nạp trên gel agarose 1,5%. Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình 4.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR của khuẩn lạc biến nạp trên gel agarose 1,5%. Hình 4.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI và BamHI trên gel agarose 1,5%. Hình 4.11: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình.4.12: Kết quả điện di sản phẩm PCR của khuẩn lạc biến nạp trên gel agarose 1,5%. Hình 4.13: Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI và XbaI trên 1,5 % gel agarose Hình.4.14: Kết quả điện di sản phẩm PCR của khuẩn lạc biến nạp trên gel agarose 1,5%. Hình 4.15: Kết quả kiểm tra plasmid pJET1.2 bằng enzyme EcoRI và XbaI trên trên gel agarose 1,5%. Hình 4.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Hình:4.17: Kết quả điện di sản phẩm PCR của khuẩn lạc biến nạp trên gel agarose 1,5%. Hình 4.18. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI trên trên gel agarose 1,5%. xii Hình 4.19: Kết quả điện di sản phẩm PCR của khuẩn lạc biến nạp trên gel agarose 1,5%. Hình 4.20: Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI và XbaI trên gel agarose 1,5%. xiii DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 : Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen purA bằng phương pháp điện biến nạp và tiếp hợp. 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có tiềm năng lớn về xuất khẩu đem lại lợi ích rất lớn cho người nuôi. Theo VCI news (21/09/2008) cả nước thu hoạch hơn 900 nghìn tấn cá tra với kim ngạch xuất khuẩu đạt 1 tỉ USD, bằng năm 2007, cả năm 2008, sản lượng cá tra nước ta có thể đạt 1,3 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu 1,6 tỉ USD (theo bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn), chiếm 29 % giá trị xuất khẩu hải sản của cả nước, để có được sản lượng cao như vậy, bên cạnh tạo ra giống tốt, mở rộng diện tích còn có nuôi cá tra ở mật độ cao và nuôi thâm canh, vì vậy gây ô nhiễm môi trường và làm xuất hiện nhiều loại bệnh như đốm trắng nội tạng do Edwardsiella ictaluri, đốm đỏ do Pseudomonas , bệnh nhiễm huyết do Edwardsiella tarda, một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v. Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi. Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson và cộng sự, 2001). Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi, đồng thời trên gan, thận và lách xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên trong chứa dịch màu trắng đục. Khi cá bệnh người nuôi thường dùng thuốc hoá học và thuốc kháng sinh để chữa trị, tuy nhiên vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra kháng với một số loại thuốc kháng sinh Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [2]. Hơn thế các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hóa chất trong thịt, tạo chủng kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường nước (Huovinen, 1999; MacMillan, 2001; Smith và ctv, 1994, Tendencia và De La Pena, 2001). Để giải quyết vấn đề trên bằng cách không chữa trị bằng kháng sinh và thuốc hóa học mà thay vào đó là phòng bệnh bằng vaccine. Vaccine cấp cho cá theo các con đường: tiêm, ngâm và cho ăn. Đối với vaccine bị giết chết bằng formalin cấp cho cá bằng phương pháp ngâm và cho ăn đem lại đáp ứng kháng thể trong cá nhưng kháng thể tạo 2 ra ít, không đáp ứng miễn dịch trong thời gian dài và không hiệu quả [6],[10],[21],[23]. Điều này cho thấy rằng chỉ có đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào là quan trọng cho sự phát triển miễn dịch bảo vệ bệnh nhiễm trùng máu đường ruột. Giả thuyết này cung cấp cho nhiều nhà nghiên cứu dùng nhiều lọai kháng nguyên khác nhau mà có hiệu quả kích thích kháng thể nhưng đều không thành công nếu không thử nghiệm ở liều cao hoặc chất bổ trợ. Khi tiêm lipopolysaccharide (LPS) của E. ictaluri đã tinh sạch không đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống bệnh nhiễm trùng máu đường ruột nếu không dùng chất bổ trợ [22] .Sự tiêm vi khuẩn E. ictaluri đã bị giết kết hợp với chất bổ trợ là một cách kích thích miễn dịch trung gian tế bào tăng lên nhưng số lượng lớn, kích thước nhỏ và giá trị kinh tế của từng con cá thấp. Vaccine E. ictaluri sống nhược độc của các mầm bệnh tùy ý hoặc nội bào mà lan tỏa khắp mô của cá bằng các con đường tự nhiên nên nó vẫn tạo ra kích thích miễn dịch trung gian tế bào mạnh. Việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại các bệnh nhiễm khuẩn là vấn đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá tại Việt Nam. Một trong những hướng tìm vaccine đó là tạo ra các chủng vi khuẩn đột biến không mang độc tính sử dụng như vaccine sống, giảm độc lực. 1.2. Mục tiêu Tạo chủng E. ictaluri đột biến không mang độc tính sử dụng như vaccine sống, giảm độc lực để kháng lại bệnh mủ gan trên cá tra. 1.3. Nội dung Phân lập và phát hiện vi khuẩn gây bệnh mủ gan trên cá tra Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu tiên của gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen cuối của gen purA 3 Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu (HpurA) và đoạn gen cuối (TpurA) của gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen KmR từ pcambia Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid chứa gen purA biến đổi Tạo E. ictaluri đột biến gen purA 4 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Chúng có đặc điểm gram âm, hình que, phần lớn ở dạng đơn, đôi và một ít ở dạng chuỗi, kích thước 1x 2-3µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ tiêm mao, kị khí tùy tiện, catalase dương tính, cytocrom oxidase âm. E. ictaluri 93-146 gây bệnh nhiễm trùng máu trên cá nheo Mỹ có 2 plasmid pEI1 có kích thước 4807 bp, 51,15% G + C và có thể có 23 khung đọc của 40 acid amin hoặc nhiều hơn; pEI2 có 5643 bp, 51,13% G + C và có thể có 24 khung đọc [13], chứa gen lọai hệ thống điều tiết III, các protein gây bệnh chuyển vào tế bào nhân thật, trình tự bộ gen này cung cấp thông tin xa hơn về các yếu tố gây độc và giúp cho phát triển vaccine [7]. Thường gặp hai loài: E. tarda và E. ictaluri E. ictaluri là loài chịu đựng kém nhất của Edwardsiella. E. ictaluri được phân lập từ cá nhiễm lâm sàn trên môi trường thạch BHI hoặc TSA. Chúng phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần 36-48 h để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHI ở 28-30oC, phát triển yếu hoặc không phát triển ở 37oC. Trên môi trường EIM giúp tăng cường sự phân lập và định danh E. ictaluri, môi trường này ức chế vi khuẩn gram dương và hầu hết gram âm. Sau 48 giờ, trên môi trường EIM, khuẩn lạc E. ictaluri và E. tarda có đường kinh 0,5-1,0 mm, màu xanh mờ, khuẩn lạc A. hydrophila có màu xanh vàng và đường kinh 2-5 mm, trong khi đó các khuẩn lạc proteus sp xanh nâu, đường kính 2-3 mm và Y. ruckeri xanh vàng đường kính 1-2 mm, (Shotts và Waltman, 1990). Vi khuẩn E. ictaluri kén chọn vật chủ hơn nhiều so với E. tarda và gây thiệt hại nặng hơn. Phân lập E.ictaluri ở các loài cá da trơn như cá trê sông (Ictalurus spp); cá tra (pangasius spp). (Nakatsugawa, 1983; Egusa, 1976; Miyashito, 1984 và Crumlish, 2001), gây bệnh xuất huyết đường ruột ở cá da trơn (Beleau và Francis-Floyd, 1986). Ở Việt Nam, phân lập được E. ictaluri từ cá tra giống và cá tra thịt.