Tài liệu Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy asen vào cây thuốc lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- ĐÀO THU TRANG TÁCH DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TÍCH LŨY ASEN VÀO CÂY THUỐC LÁ Chuyên ngành sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Thị Bích Thủy HÀ NỘI, 12/2015 Công trình được hoàn thành tại: - Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Bích Thủy Viện CNSH, Viện HL KHCN VN Phản biện 1: PGS. TS. Lê Văn Sơn Viện CNSH, Viện HL KHCN VN Phản biện 2: TS. Hồ Quỳnh Liên Viện Hóa sinh biển, Viện HL KHCN VN Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn họp tại: Nhà A11, tầng 2, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi 08 giờ30 ngày 22 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên - Thư viện Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thủy, trưởng phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn tập thể các cán bộ phòng Di truyền tế bào thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo cùng cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi được học tập tại đây. Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn tới gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Hà Nội, tháng 12, năm 2015 Học viên Đào Thu Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3 1. Tổng quan về tình hình ô nhiễm KLN ............................................................3 1.1. Tình hình ô nhiễm KLN trên thế giới ........................................................3 1.2. Tình hình ô nhiễm kim loại nặng ở Việt Nam ..........................................3 2. Tổng quan chung về Asen ................................................................................5 2.1. Asen và độc tính của asen ..........................................................................5 2.2. Sự phơi nhiễm Asen ...................................................................................6 2.3. Tác động của nhiễm độc Asen đến sức khỏe con người ..........................8 2.4. Điều trị nhiễm độc Asen ở người ...............................................................8 3. Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN ............................................................8 3.1. Phương pháp truyền thống ........................................................................8 3.1.1. Phương pháp cơ học ............................................................................ 9 3.1.2. Phương pháp vật lý và hoá học ............................................................ 9 3.2. Công nghệ xử lý KLN trong đất bằng thực vật .......................................10 3.3. Các nghiên cứu về biện pháp xử lý KLN bằng thực vật sử dụng công nghệ gen ...........................................................................................................13 3.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 13 3.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 15 4. Chuyển gen ở thực vật ....................................................................................18 4.1. Cơ sở khoa học của chuyển gen thực vật ................................................18 4.2. Giới thiệu chung về vector sử dụng trong chuyển gen thực vật ............19 4.2.1. Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen thực vật ................... 19 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.23 2.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................23 2.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................23 2.2.1. Nguyên vật liệu ......................................................................................23 2.2.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................23 2.2.2.1. Hóa chất .......................................................................................... 23 2.2.2.2. Thiết bị............................................................................................. 24 2.2.3. Môi trường nuôi cấy ..............................................................................24 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................25 2.3.1. Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn ........................................................25 2.3.2. Phương pháp tách ARN ........................................................................25 2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA ..............................................................26 2.3.4. Phương pháp xử lý với enzym giới hạn ................................................26 2.3.5. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli ..................27 2.3.6. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn E.coli.................................................................................................................28 2.3.7. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung điện ................................................................................................29 2.3.8. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ).......................................................................................29 2.3.9. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thuốc lá ............................... 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................32 3.1. Tách dòng gen arsC từ RNA của cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos ..........................................................................................................32 3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số ............................................................32 3.1.2. Phản ứng RT-PCR ................................................................................32 3.1.3. Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT .......................33 3.1.4. Kiểm tra vector pBT-arsC......................................................................34 3.1.5. Xác định trình tự gen trình tự gen arsC ...............................................36 3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC ................................38 3.2.1. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCambia 1301 ..............................38 3.2.2. Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301-arsC........................................40 3.3. Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58...................................................................................................42 3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC .............................................43 3.5. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR ..........................................................47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................50 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens As Asen Amp Ampicillin BAP 6-benzenladenine Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase Kb Kilo base LB Môi trường theo Luria và Bertani MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris bazơ – Axit acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus TBKB Tế bào khả biến T-DNA Transferred-DNA Ti-plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u UV Ultraviolet (light) Vir Virulence region = vùng gây độc DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh về Asen ........................................................................................5 Hình 1.2: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật ...................19 Hình 3.1. RNA tổng số tách từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa xử lý Dnase .....................................................................................................................32 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR. ..........................................33 Hình 3.3. Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC ......................................................34 Hình 3.4. Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu ..........................................35 Hình 3.5. Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4: Sản phẩm cắt pBT-ArsC bằng BamHI. ............................................................................35 Hình 3.6. Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I ...........................................36 Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos với trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI (X80057.1). ................ 37 Hình 3.8. Độ tương đồng các axit amin khi so sánh 2 trình tự .................................38 Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc vector pCambia 1301-arsC ...............................................38 Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC ................................39 Hình 3.11. Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I ..........................................................................................................40 Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301–arsC.....................................41 Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC.......................................41 Hình 3.14. Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I .................. 42 Hình 3.15. Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens C58 được biến nạp pCambia1301- arsC .........................................................................43 Hình 3.16. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen ..................45 Hình 3.17. Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường đa chồi bổ sung hygromycin 10mg/l và cefotaxime 500mg/l..................................................................................45 Hình 3.18. Khả năng ra rễ của các chồi trên môi trường RM hygromycin 10mg/l sau 3 tuần nuôi cấy. .........................................................................................................46 Hình 3.19. Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát ..................47 Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen .............. 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh mục thiết bị......................................................................................24 Bảng 2.2. Phản ứng tổng hợp cDNA ........................................................................26 Bảng 2.3. Phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn ...................................................27 Bảng 2.4. Phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector ...................................................27 Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn ............................................44 MỞ ĐẦU Tình hình ô nhiễm môi trường nói chung và ô nhiễm kim loại nặng nói riêng đang trở thành vấn đề hết sức cấp bách của xã hội hiện đại. Công nghiệp ngày càng phát triển dẫn tới các chất thải độc hại không được xử lý hay xử lý không đạt yêu cầu giải phóng vào môi trường là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng ô nhiễm kim loại nặng nghiêm trọng. Kim loại nặng (KLN) có Hg, Cd, Pb, As, Sb, Cr, Cu, Zn, Mn, v.v... thường không tham gia hoặc ít tham gia vào quá trình sinh hoá của các thể sinh vật và thường tích luỹ trong cơ thể chúng. Vì vậy, KLN thường là các nguyên tố độc hại với sinh vật. Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng điểm đang trong tình trạng ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: Chì (Pb), Cadmium (Cd), Crôm (Cr), Asen (As). Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới về ô nhiễm Asen trong nguồn nước, nồng độ Asen trong khu vực nam Iowa và tây Missouri của Mỹ dao động từ 0,034- 0,490 mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ Asen >0,050mg/l. Bệnh nhiễm độc Asen mãn tính do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm Asen (Arsenicosis) xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt. Gần đây tình trạng nhiễm độc Asen đã được báo động, không chỉ ở các quốc gia trên thế giới như Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc…mà ở Việt Nam cũng đã gia tăng ngày càng nhiều. Điển hình như khu vực Quỳnh Lôi, Hai Bà Trưng (Hà Nội) đã có nhiều gia đình phải chịu hậu quả và di chứng nặng nề do nhiễm độc Asen, nhiều trường hợp đã tử vong. Với tình trạng khoan giếng bừa bãi như hiện nay, đa số nguồn nước sau khi khoan lên sẽ được sử dụng trực tiếp mà không qua xử lý triệt để, thường chỉ sử dụng biện pháp thô sơ như: lắng, lọc để lấy nước trong…Các biện pháp này không thể loại bỏ được các kim loại nặng còn lẫn trong nước, lại thiếu sự kiểm soát và hướng dẫn của các cơ quan chức năng nên chất lượng nước làm ảnh hưởng đến sức khỏe người dân là điều khó tránh khỏi. Ở Hà Nội 40% giếng khoan có hàm lượng As lớn hơn mức an toàn nhiều lần. As hay còn gọi là thạch tím là chất rất độc. Các hợp chất As vô cơ được xếp vào nhóm A các chất gây ung thư ở người và gây ung thư da, phổi, thận và gan, phá hủy hệ thần kinh. Ngoài ra, As còn gây các bệnh về tim mạch, tiểu đường và thiếu 1 máu, ảnh hưởng đến hệ sinh sản và miễn dịch. Chính vì thế, giải quyết được vấn đề ô nhiễm As đang là vấn đề thời sự rất cấp thiết hiện nay. Xử lý ô nhiễm KLN là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu tư cao. Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi ion, ôxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp,...Hầu hết các phương pháp đó rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích...Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ KLN của một số loài thực vật, người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ đặc biệt. Khả năng làm sạch môi trường của thực vật đã được biết từ thế kỷ XVIII, tuy nhiên đến những năm 1990 phương pháp này mới được nhắc đến như một loại công nghệ mới dùng để xử lý môi trường đất và nước bị ô nhiễm bởi các kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ. Việc nghiên cứu một số gen liên quan đến hấp thụ KLN nói chung và As nói riêng trên thế giới đã thu được những kết quả nhất định, mở ra triển vọng áp dụng công nghệ gen vào tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN cao để phát triển công nghệ xử lý chất thải KLN bằng thực vật. So với những nghiên cứu tại các nước tiên tiến, ở Việt Nam chưa có công trình nào sử dụng công nghệ gen để tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN. Hầu hết các nghiên cứu tập trung đánh giá và sử dụng các loài cây sẵn có khả năng tích lũy KLN trong tự nhiên cho mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật hoặc bằng phương pháp xử lý truyền thống. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá”. Đây là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn với mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật ở Việt Nam. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tình hình ô nhiễm KLN 1.1. Tình hình ô nhiễm KLN trên thế giới Thế giới đang ngày càng phát triển làm con người phải đối mặt với nạn ô nhiễm môi trường trong đó ô nhiễm KLN đang là vấn đề đáng báo động hiện nay. Nguyên nhân chủ yếu là do hoạt động của con người như: khai khoáng, nấu kim loại, mạ điện, sản xuất nhiên liệu chất cháy nổ, sử dụng phân bón và chất thải từ các vùng dân cư và các khu công nghiệp . Trong mười năm qua, các nhà khoa học thế giới đã nhận thấy rằng nhiều nước gặp phải vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng do ô nhiễm Asen trong môi trường ngày càng tăng. Các quốc gia này bao gồm Ấn Độ, Đài Loan, Arhentina, Thái Lan, Mông Cổ, Mexico, Chile, Trung Quốc và Bangladesh (Willard Chappell 1999). Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng điểm đang trong tình trạng ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: Pb, Cd, Cr, As. Mỗi năm ngân sách nước Mỹ phải tốn 1,5 tỷ USD cho việc xử lý và ngăn chặn ô nhiễm. Trong năm 2005, ước tính lượng nước thải của Trung Quốc lên tới 31 tỷ tấn, kim loại nặng lên tới 15 triệu tấn, khoảng 20% đất nông nghiệp của Trung Quốc bị nhiễm kim loại nặng làm mất 10 triệu tấn hoa màu mỗi năm. Viện hàn lâm khoa học Trung Quốc, đã phát hiện đất ở nhiều khu vực có chứa As ở mức cao (Liao X 2004). Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới về ô nhiễm As trong nguồn nước, nồng độ As trong khu vực nam Iowa và tây Missouri của Mỹ dao động từ 0,034- 0,490 mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ As >0,050mg/l. Bệnh nhiễm độc As mãn tính do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm As xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt. 1.2. Tình hình ô nhiễm kim loại nặng ở Việt Nam Ở Việt Nam việc phát triển kinh tế và mức độ đô thị hoá cao cũng là nguyên nhân dẫn đến sự xuống cấp nghiêm trọng của hệ sinh thái. Ô nhiễm môi trường nhất là KLN ở nước ta đang là một vấn đề đáng lo ngại. KLN xuất phát từ rất nhiều nguồn khác nhau như: các khu công nghiệp, mỏ khai thác kim loại, bãi rác, làng nghề, hoạt động sản xuất nông nghiệp. Hầu hết các KLN như As, Cd, Zn, Cu, Pb, 3 Hg ... đều tìm thấy trong các chất thải. Trong đó As và Cd là phổ biến. Kết quả phân tích đất trồng ở khu vực mỏ thiếc Sơn Dương, Tuyên Quang có hàm lượng As là 642mg/kg và Cu là 235mg/kg (Bùi Thị Kim Anh 2011), trong khi tiêu chuẩn đặt ra tương ứng là 12 mg/kg và 50mg/kg (QCVN 03:2008/BTNMT). Đầu những năm 1990, vấn đề ô nhiễm As được biết đến qua các nghiên cứu của Viện Địa Chất và các liên đoàn địa chất về đặc điểm địa chất thủy văn và đặc điểm phân bố As trong tự nhiên. Theo nghiên cứu khảo sát phân tích nước bề mặt và các nguồn nước đổ ra sông Mã ở khu vực Đông Nam bản Phúng, hàm lượng As trong các mẫu nước đều vượt quá 0,05 mg/l. Kết hợp với điều tra của trường đại học Y Hà Nội cho thấy, sự ô nhiễm này có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe dân cư sống ở khu vực đó. Từ những năm 1995-2000, nhiều công trình nghiên cứu điều tra về nguồn gốc As có trong nước ngầm, mức độ ô nhiễm, chu trình vận chuyển… đã tìm thấy nồng độ As trong các mẫu nước khảo sát ở khu vực thượng lưu sông Mã, Sơn La, Phú Thọ, Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thanh Hóa… đều vược tiêu chuẩn cho phép đối với nước sinh hoạt của Quốc Tế và Việt Nam (Đặng Đình Kim 2010). Trước tình hình đó, trong hơn 2 năm (2003-2005), chính phủ Việt Nam và UNICEF đã khảo sát về nồng độ As trong nước của 71.000 giếng khoan thuộc 17 tỉnh từ đồng bằng miền Bắc, Trung, Nam. Kết quả phân tích cho thấy nguồn nước giếng khoan ở các tỉnh vùng lưu vực Sông Hồng như : Hà Nam, Nam Định, Hà Tây, Hưng Yên, Hải Dương và các tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long như : An Giang, Đồng Tháp đều bị nhiễm As rất cao. Tỷ lệ các giếng có nồng độ As từ 0,1 mg/l đến > 0,5 mg/l (cao hơn tiêu chuẩn cho phép của Việt Nam và tổ chức Y Tế Thế Giới 10-50 lần) của các xã dao động từ 59,6-80%. Có thể thấy tình trạng ô nhiễm As trong nguồn nước của các giếng khoan tại các xã là rất nghiêm trọng. Tỷ lệ các giếng có nồng độ As cao > 0,1 mg/l (gấp hơn 10 lần tiêu chuẩn cho phép) ở hầu hết các xã chiếm từ 70%- 96% trừ Mai Động có tỷ lệ thấp hơn (46%)(Nguyễn Khắc Hải 2006) . Hiện nay, chính phủ đã có kế hoạch hành động quốc gia về giảm thiểu ô nhiễm As ở Việt Nam với các nội dung tiến hành khảo sát toàn quốc để xác định mức độ ô nhiễm As ở nguồn nước ngầm các khu vực khác nhau, xây dựng bản đồ ô nhiễm As ở Việt Nam, đánh giá thực trạng ảnh hưởng của ô nhiễm As trong nguồn 4 nước sinh hoạt tới sức khỏe của cộng đồng và xây dựng các biện pháp phòng chống, nghiên cứu và áp dụng các giải pháp làm giảm thiểu ô nhiễm As trong nguồn nước, tăng cường thông tin tuyên truyền nâng cao nhận thức của cộng đồng về vệ sinh nguồn nước, phòng chống bệnh tật do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm nói chung và ô nhiễm As nói riêng. 2. Tổng quan chung về Asen 2.1. Asen và độc tính của asen Asen hay còn gọi là thạch tín, một nguyên tố hóa học có ký hiệu As và số nguyên tử 33. Khối lượng nguyên tử của nó bằng 74,92. Nguyên tố As Arsenic Hình 1.1: Hình ảnh về Asen As là một á kim gây ngộ độc khét tiếng và có nhiều dạng thù hình: màu vàng (phân tử phi kim) và một vài dạng màu đen và xám (á kim). Ba dạng có tính kim loại của As với cấu trúc tinh thể khác nhau cũng được tìm thấy trong tự nhiên (các khoáng vật asen sensu stricto và hiếm hơn là asenolamprit, parasenolamprit). As hay tồn tại dưới dạng các hợp chất asenua và asenat. Trạng thái oxy hóa phổ biến nhất của nó là -3 (asenua: thông thường trong các hợp chất liên kim loại tương tự như hợp kim), +3 (asenat (III) hay asenit và phần lớn các hợp chất asen hữu cơ), +5 (asenat (V): phần lớn các hợp chất vô cơ chứa oxy của asen ổn định). As cũng dễ tự liên kết với chính nó, chẳng hạn tạo thành các cặp As-As trong sulfua đỏ (α-As4S4) và các ion As43- vuông trong khoáng coban asenua có tên skutterudit. Ở trạng thái ôxi hóa +3, tính chất hóa học lập thể của As chịu ảnh hưởng bởi sự có mặt của cặp electron không liên kết. 5 As về tính chất hóa học rất giống với nguyên tố đứng trên nó là phốt pho. Tương tự như phốt pho, nó tạo thành các oxit kết tinh, không màu, không mùi như As2O3và As2O5 là những chất hút ẩm và dễ dàng hòa tan trong nước để tạo thành các dung dịch có tính axit. Tương tự như phốtpho, As tạo thành hidrua dạng khí và không ổn định, đó là arsin (AsH3). Do vậy, As sẽ thay thế phần nào cho phốt pho trong các phản ứng hóa sinh học và vì thế nó gây ra ngộ độc. Theo nghiên cứu của Thomas và cộng sự, As vô cơ ở trạng thái hóa trị ba có độc tính cao hơn nhiều so với As vô cơ ở trạng thái hóa trị năm. Ý tưởng này xuất phát từ các thí nghiệm về liều tử vong cấp tính trên động vật (Thomas D. J. et al 2001). As hóa trị năm bị khử trong cơ thể thành As hóa trị ba (mà sau đó bị methyl hóa) nên nó tác động giống như As hóa trị ba, với giả thiết rằng phản ứng khử đủ nhanh so với thời gian bán hủy. Thông thường giai đoạn methyl hóa trong quá trình trao đổi chất thường được cho là bước giải độc. Gần đây hai nhóm nghiên cứu của Aposhian và cộng sự, Styblo và cộng sự đã công bố rằng, trạng thái As hóa trị ba của monomethyl arsenic độc hơn nhiều so với các dạng vô cơ, các dạng hóa trị năm của monomethyl và dimethyl arsenic thì kém độc hơn (Aposhian H.V et al 2001, Styblo M. and Lin S. 2001). Việc phát triển các phương pháp phân tích trạng thái hóa trị ba của monomethyl arsenic sẽ cho phép tiến hành các nghiên cứu này. 2.2. Sự phơi nhiễm Asen Sự phơi nhiễm có thể xảy ra qua nước và không khí. Sự phơi nhiễm cũng có thể là từ việc sử dụng thực phẩm và các thuốc cổ truyền cũng như từ các chất thải độc hại như phế thải khai thác mỏ. Ở Tây Bengal và Bangladesh xảy ra phơi nhiễm từ việc uống nước ngầm được bơm lên từ các “giếng khoan” (Chowdhurry T.R. 1997, Chowdhurry T.R. et al 1999). Các nhà nghiên cứu ở Nội Mông đã nghiên cứu về các tác hại đến sức khỏe từ việc sử dụng nước ngầm với nồng độ As cao. Ở các nước này As hòa tan trong nước ngầm có thể có nguồn gốc tự nhiên. Tuy nhiên một vài nghiên cứu cho thấy rằng ở Tây Bengal và Bangladesh, As liên kết với đá gốc được giải phóng vào nước do việc bơm hút quá nhiều nước phục vụ cho thủy lợi trong những năm gần đây. Nước bề mặt cũng có thể chứa As với nồng độ cao. Hàm lượng As cao trong nước bề mặt ở Thái lan và Chile đã gây ra các triệu chứng nhiễm độc As 6 (Choprapawon C. ; Ajjimangkul S. 1999, Sancha A.M. 1999) . Ở Thái Lan mức As tăng cao là do các chất thải từ các hoạt động khai thác mỏ thiếc. Nồng độ As gia tăng trong không khí có thể do việc đốt than có chứa As cao, như ở Slovakia (Bencko V. 1997) và Trung Quốc (Sun G.F. 1999) dùng than cho nhà máy nhiệt điện. Ở tỉnh Guizhou, Trung Quốc, nhiều gia đình dùng loại than có chứa hàm lượng As cao để sấy khô các nông phẩm được treo trên trần nhà. Họ đốt than trong một cái hố dưới nền nhà hoặc trong một cái lò không có ống khói hoặc ống xả. Điều này dẫn tới nồng độ As rất cao trong không khí và thấm sâu vào thực phẩm. Đất cũng là một nguồn phơi nhiễm As. Sự ô nhiễm đất có thể xảy ra do tiếp xúc với các chất thải rắn như chất thải hầm mỏ, hay với bùn cống có As nồng độ cao. Đất bị nhiễm As cũng có thể do sử dụng tưới tiêu bằng nước có chứa nhiều As, hay từ việc sử dụng các thuốc trừ sâu hay diệt cỏ chứa As (Folks D. J. 2001). Các loại đất này có thể gây ô nhiễm cho các loại cây lương thực mà con người hay vật nuôi ăn phải và làm giảm năng suất mùa màng. As là một nguyên tố tồn tại trong tự nhiên và có thể được tìm thấy trong bất kỳ mẫu vật chất nào nếu như sử dụng một phương pháp phân tích đủ nhạy. Thông thường As dạng vô cơ có độc tính cao gấp rất nhiều lần so với dạng hữu cơ. Trong thực phẩm, phần lớn As ở dạng hữu cơ và chỉ một lượng nhỏ As ở dạng vô cơ. Hàm lượng As vô cơ cao nhất được phát hiện trong lúa, bột mì, nước nho và rau spinach (Borum D.R. ; Abernathy C.O. 1994). Dược phẩm cũng có thể là một nguồn phơi nhiễm As. Năm 1969 các bệnh nhân ở Anh được cho dùng dung dịch Fowler (potassium arsenite) để điều trị một số loại bệnh về da (Sasieni P. ; Evans S. ; Cuzick J. 1994). Một số bệnh nhân sử dụng các liều tích lũy nhiều tới 10g As hoặc hơn dưới dạng vô cơ. Năm 1970, 142 bệnh nhân đã được khám vào để tìm các dấu hiệu của nhiễm độc As (tăng sừng hóa, sậm màu da hay ung thư da) cho thấy: 45% có ít nhất một dấu hiệu, 45% bị tăng sừng hóa và 10% bị ung thư da vào thời điểm tiến hành khám. Theo Choprapawon và Rodeline (1997), hơn 100 ca nhiễm độc As mãn tính có liên quan đến việc sử dụng các loại thuốc cổ truyền ở Thái Lan (Choprapawon C. ; Rodcline A. 1997). 7 2.3. Tác động của nhiễm độc Asen đến sức khỏe con người Các triệu chứng cổ điển của nhiễm độc As như sậm màu da, tăng sừng hóa và ung thư da đã được biết đến từ lâu. Từ những năm 1970 và đặc biệt trong thập kỷ qua, tình trạng phơi nhiễm As gia tăng gây ra nhiều tác động tiêu cực ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người, tiêu biểu là các bệnh về hệ mạch máu ngoại biên (chân đen) (Guo H. R. and Greene H. L 1994) và các tác động đến hệ thần kinh ngoại biên (Kilburn K. H. 1997), to chướng gan, các tác động tới hệ thần kinh trung ương, bệnh đái đường, cao huyết áp, bệnh tim, bệnh xơ gan, bệnh viêm cuống phổi và các bệnh hô hấp khác (Abernathy C. O.; Calderon R. L. and Chappell W.R. 1997, Chappell W.R.;Abernathy C.O. and Calderon R.L. 1999). Nhiễm độc As còn gây ra các bệnh ung thư nghiêm trọng. Trước đây các nghiên cứu chỉ cho thấy As có liên quan đến bệnh ung thư da, nay có rất nhiều bệnh ung thư nghiêm trọng đều do As gây ra như: ung thư phổi, ung thư bàng quang, ung thư thận, ung thư mũi, ung thư ruột kết. 2.4. Điều trị nhiễm độc Asen ở người Sự phát triển các phương pháp điều trị bệnh nhân nhiễm độc As vẫn còn chậm chạp. Một trong các hướng tích cực là sử dụng các chất tạo chelat mà đã được nghiên cứu là có hiệu quả trong điều trị nhiễm độc chì. Vì As không lưu quá lâu trong cơ thể, nhiều người không cho rằng quá trình tạo chelat là việc điều trị thành công. Các nghiên cứu ban đầu sử dụng chất tạo chelat DMSA (một dẫn xuất tan trong nước của dimecaprol) đã không thành công (Guha Mazumder D. N. et al 2001). Tuy nhiên, gần đây Aposhian và cộng sự, Cebrian và cộng sự đã công bố rằng, 40% đến 60% As lưu giữ trong cơ thể tiêu hóa được bằng việc sử dụng DMPS (một dẫn xuất tan trong nước của dimecaprol) (Aposhian H. V. 2001, Cebrian M.E. ; Aposhian H.V. 2001). Các nhà nghiên cứu này đã cho biết không có tác động tiêu cực nào của điều trị bằng DMPS. Họ đã thấy sự cải thiện đáng kể các triệu chứng của bệnh nhân so với nhóm đối chứng. 3. Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN 3.1. Phương pháp truyền thống Làm sạch đất ô nhiễm là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu tư cao. Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền 8 thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý, xử lý nhiệt, kết tủa hoặc sa lắng thụ động với sắt nguồn tự nhiên, đông tụ, sa lắng, lọc, hấp phụ, trao đổi ion, oxy hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp (Murcott S. 2001). 3.1.1. Phương pháp cơ học Trên thực tế, phương pháp này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn KLN. Tuy nhiên, nó làm hạn chế khả năng thấm ngấm của KLN vào hệ thống nước ngầm. Phương pháp chôn lấp tại chỗ được đánh giá là an toàn nhất bằng cách xây đập bê tông chặn xung quanh. Đối với khu vực gần dân cư và đất canh tác thì đất ô nhiễm phải được đào và vận chuyển đến nơi chôn lấp tập trung. Phương pháp này có nhược điểm là không những chi phí cao, cần diện tích lớn, đất không được tái sử dụng mà nó còn gây nguy hiểm trong suốt quá trình vận chuyển. 3.1.2. Phương pháp vật lý và hoá học Nhóm phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm soát và làm giảm bớt mức độ ô nhiễm KLN trong đất. Các phương pháp thường dùng là (Đặng Đình Kim 2010): Điện động học: Điện động học liên quan đến sự di chuyển KLN thông qua một điện trường được phát sinh từ các điện cực trong đất. Kỹ thuật này có hiệu quả xử lý đất sét bị ô nhiễm KLN: Pb, Cr, Cu, Zn và thường kết hợp với phương pháp sinh học. Rửa đất: Phương pháp này được dùng phổ biến ở Đan Mạch, Đức, Hà Lan… Đất được phân loại sau đó được rửa bằng nước có thể bổ sung thêm axit hoặc bazơ. KLN được giải phóng từ bề mặt đất vào nước cùng với các hợp chất hữu cơ cao phân tử. Kỹ thuật này phù hợp để xử lý đất chứa nhiều cát và sỏi. Sau xử lý vẫn còn một lượng KLN tồn dư trong đất. Xử lý nhiệt: Phương pháp này dựa vào phản ứng đốt cháy các hợp chất để tạo thành CO2 và nước. Đất được đào lên và đốt ở nhiệt độ cao thường từ 6000C17000C, KLN sẽ bị tách khỏi liên kết với đất, thu hồi KLN với tro và đem chôn. Phương pháp này cũng hữu hiệu trong việc xử lý các KLN dễ bay hơi như thủy ngân. 9 Cố định các chất ô nhiễm: Phương pháp này dựa vào các phản ứng oxy hoá khử, phản ứng tạo kết tủa, phản ứng trung hoà, keo tụ hay phân huỷ các chất độc hại. Có thể sử dụng thuốc thử Dichloromethane để nhận biết sự kết thúc của phản ứng hoá học. Phương pháp này được dùng để xử lý đất ô nhiễm natri (Na), nhôm(Al), kẽm (Zn) nhưng thường gây ảnh hưởng đến môi trường do lượng thuốc thử dư tồn tại trong đất. Hầu hết các phương pháp truyền thống đều rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích,... Đất sau xử lý vẫn còn chứa một lượng kim loại nhất định và có thể ảnh hưởng tới môi trường. Hơn nữa phương pháp này còn tỏ ra kém hiệu quả khi nồng độ kim loại trong đất thấp và mức độ phân tán của kim loại lớn. Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ KLN của một số loài thực vật, người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ môi trường đặc biệt. 3.2. Công nghệ xử lý KLN trong đất bằng thực vật Khả năng làm sạch môi trường của thực vật đã được biết từ thế kỷ XVIII bằng các thí nghiệm của Joseph Priestley, Antoine Lavoissier, Karl Scheele và Jan Ingenhousz. Tuy nhiên, mãi đến những năm 1990 phương pháp này mới được nhắc đến như một loại công nghệ mới dùng đề xử lý môi trường đất và nước bị ô nhiễm bởi các kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ. Thực vật có nhiều cách phản ứng khác nhau đối với sự có mặt của các ion kim loại trong môi trường. Hầu hết, các loài thực vật rất nhạy cảm với sự có mặt của các ion kim loại, thậm chí ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, vẫn có một số loài thực vật không chỉ có khả năng sống được trong môi trường bị ô nhiễm bởi các kim loại độc hại mà còn có khả năng hấp thụ và tích các kim loại này trong các bộ phận khác nhau của chúng (Barcelos J. ; Poschenrieder C. 2003). Trong thực tế, công nghệ xử lý ô nhiễm bằng thực vật đòi hỏi phải đáp ứng một số điều kiện cơ bản như dễ trồng, có khả năng vận chuyển các chất ô nhiễm từ đất lên thân nhanh, chống chịu được với nồng độ các chất ô nhiễm cao và cho sinh khối nhanh (Timothy Oppelt E. 2000, Jerald L. Schnoor 2002, Barcelos J. ; Poschenrieder C. 2003). Tuy nhiên, hầu hết các loài thực vật có khả năng tích luỹ 10 KLN cao là những loài phát triển chậm và có sinh khối thấp, trong khi các thực vật cho sinh khối nhanh thường rất nhạy cảm với môi trường có nồng độ kim loại cao. Xử lý KLN trong đất bằng thực vật có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau phụ thuộc vào từng cơ chế loại bỏ các KLN (Pilon-Smits E. 2005): Phytodegradation (phân hủy): Các chất ô nhiễm hữu cơ bị phân hủy (chuyển hóa) hoặc bị khoáng hóa bởi các enzyme chuyên biệt trong tế bào thực vật: nitroreductases, dehalogenases (phân giải dung môi và thuốc trừ sâu gốc Cl) và laccases (phân giải anilines). Loài họ Liễu (Populus sp.) và họ rong xương cá (Myriophyllium spicatum) là những cây có hệ thống enzyme này. Phytostabilization (cố định): Các chất ô nhiễm hữu cơ hoặc vô cơ, được kết hợp vào lignin của thành tế bào rễ hoặc vào mùn. Kim loại bị kết tủa do rễ cây tiết dịch và sau đó chúng bị giữ lại trong đất. Mục tiêu chính của cơ chế này là hạn chế sự di chuyển và khuếch tán của chất gây ô nhiễm. Loài chi Haumaniastrum (họ húng), Eragrostis (họ Hòa thảo), Ascolepis (họ Cói), Lay ơn và Alyssum (họ Cải có hoa) là ví dụ về cây trồng cho mục đích này. Phytovolatilization (bay hơi): Một số loài cây có khả năng hấp thu và bay hơi một số kim loại hoặc á kim. Một số nguyên tố của nhóm IIB, VA và VIA của bảng tuần hoàn (đặc biệt là Hg, Se và As) được hấp thu bởi rễ, được chuyển đổi thành các dạng không độc hại, và sau đó thải vào khí quyển. Ví dụ: Astragalus bisulcatus (loài có hoa Họ Đậu) và Stanleya pinnata (họ Cải có hoa) xử lý Se. Loài Nicotiana tabacum (thuốc lá), Liriodendron tulipifera hoặc Brassica napus (cải dầu) xử lý Hg. Kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng cho các hợp chất hữu cơ. Phytoextraction (tách chiết): Rễ hấp thu chất ô nhiễm sau đó chuyển vị và tích lũy trong các bộ phận bên trên (thân, lá). Cơ chế này chủ yếu được áp dụng cho việc loại bỏ kim loại (Cd, Ni, Cu, Zn, Pb) hay yếu tố khác (Se, As) và các hợp chất hữu cơ. Phytofiltration (lọc): Thực vật hấp thu, tổng hợp và kết tủa các chất ô nhiễm, đặc biệt là KLN, các yếu tố phóng xạ từ môi trường nước thông qua hệ thống rễ hoặc cơ quan ngập nước khác của cây. Các thực vật được trồng trong hệ thống thủy canh, theo đó nước thải đi qua và được "lọc" bởi rễ (Rhizofiltration). Những loài thực vật có diện tích tiếp xúc lớn, loài thủy sinh có khả năng siêu tích lũy, hấp thu 11