Tài liệu Tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (ananas comosus) bằng phương pháp lọc

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  LÊ NGỌC HÊN TÁCH CHIẾT ENZYME BROMELAIN TỪ PHẾ LIỆU VỎ DỨA (ANANAS COMOSUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Bảo NHA TRANG, 8/2015 ii LỜI CẢM ƠN Qua một thời gian được nghiên cứu và thực tập tại phòng thực nghiệm Trường Đại Học Nha Trang, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Để hoàn thành đồ án này, ngoài sự nổ lực của bản thân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ tận tình của quý Thầy Cô cùng bạn bè. Trước hết xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chế biến, cùng thầy cô trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành chương trình học tập và thực hiện tốt công tác tốt nghiệp. Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy giáo hướng dẫn: TS. Nguyễn Bảo đã định hướng, tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và em cũng xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Công Minh, tất cả các Cô phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, phòng Chế biến thủy sản, phòng Công nghệ cao, Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. Cuối cùng em xin bày tỏ sự biết ơn đến Cha Mẹ luôn tạo điều kiện, động viên lo lắng và bạn bè đã giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng như quá trình thực hiện đồ án này. Nha Trang, tháng 8 năm2015 Sinh viên thực hiện Lê Ngọc Hên iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... v DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH .................................................................................................vii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về dứa .............................................................................................. 3 1.2. Tổng quan về enzyme bromelain ....................................................................... 4 1.2.1. Khái niệm về enzyme ..................................................................................... 4 1.2.2. Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain .............................. 5 1.2.3. Tính chất của enzyme broemelain ................................................................... 8 1.3. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch của enzyme ...................................... 18 1.3.1. Tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa ............................................... 19 1.3.2. Phương pháp hấp phụ chọn lọc ..................................................................... 19 1.3.3. Phương pháp trao đổi ion .............................................................................. 20 1.3.4. Phương pháp tách hệ 2 pha nước [5] ............................................................. 20 1.3.5. Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration) ........................................................... 20 1.4. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme ....................................... 22 1.4.1. Phương pháp định lượng protein bằng Microbiuret ....................................... 23 1.4.2. Xác định protein bằng phương pháp A280 .................................................... 23 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 25 2.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 25 2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 25 iv 2.2.1. Đối tượng chiết rút enzyme bromelain .......................................................... 25 2.2.2. Xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain bằng Phương pháp microbiuret: ............................................................................................................ 33 2.2.3. Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp A280 .............................. 35 2.3. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 38 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát chế độ ly tâm cho quá trình lọc 11 µm. .................... 38 2.3.2 Thí nghiệm 2: Cut-off từng công đoạn khác nhau để khảo sát sự ảnh hưởng của hoạt tính của enzyme bromelain ............................................................................. 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 43 3.1. Kết quả khảo sát thông số ly tâm sau công đoạn lọc thô................................... 43 3.2. Hiệu suất thu hồi và định mức sản phẩm .......................................................... 45 3.4 Hàm lượng protein bằng phương pháp microbiuret ........................................... 46 3.5. Hoạt tính riêng của enzyme bromelain ở từng công đoạn bằng phương pháp A280 ...................................................................................................................... 48 3.6. Kết quả nghiên cứu cut-off tại các công đoạn ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain ............................................................................................................... 49 3.7 Đề xuất quy trình sản xuất hoàn thiện ............................................................... 49 Quy trình ................................................................................................................ 49 Thuyết mình quy trình ............................................................................................ 50 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .............................................. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 53 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 55 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BSA: Bovine serum albumin. TCA: Tricloroacetic Acid. BAA: Benzyol – L –Arginine Amidez. BAEE: Benzyol – L –Arginine Ethyl Esther. BAEM: Benzyol – L –Arginine Methyl Esther. vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013) .................. 4 Bảng 1.2 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain ...................... 11 Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải của bromelain............................................................... 14 Bảng 1.4 Hằng số Michaelis (pH 6,5, 50 ºC) với các cơ chất khác nhau..................... 14 Bảng 2.1 Mối quan hệ giữa áp suất và độ thăng hoa của nước đá ............................... 32 Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp microbiuret ............... 34 Bảng 2.3 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp A280 ........................ 36 Bảng 2.4 Đánh giá cảm quan của dịch dứa sau ly tâm ................................................ 40 Bảng 2.5. Miêu tả cảm quan của dịch dứa sau ly tâm ................................................. 40 Bảng 3.1. Kết quả đánh giá cảm quan thông số ly tâm sơ bộ ...................................... 43 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá cảm quan cho thời gian công đoạn ly tâm ở thông số 3000 vòng........................................................................................................................... 44 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quả dứa......................................................................................................... 3 Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon của enzyme bromelain ....................................... 10 Hình 1.3 Cấu trúc bậc 1 của bromelain ...................................................................... 11 Hình 1.4 Trình tự sắp xếp các amino acid của quả dứa............................................... 12 Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả ............... 13 Hình 1.6. Tổng quan về quá trình lọc ......................................................................... 21 Hình 2.1 Vỏ dứa ........................................................................................................ 25 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme bromelain .............................................. 26 Hình 2.3 Máy đông khô ............................................................................................. 29 Hình 2.4. Giản đồ pha của nước ................................................................................. 29 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí khảo sát chế độ ly tâm cho quá trình lọc 11 µm ....................... 39 Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme bromelain ở từng công đoạn .................... 41 Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi hỗn hợp enzyme bromelain qua từng công đoạn của qui trình chiết rút ............................................................................................................. 45 Hình 3.2. Khối lượng riêng của dịch chiết ở từng công đoạn trong quá trình chiết rút hỗn hợp enzyme bromelain. ....................................................................................... 46 Hình 3.3. Đồ thị hàm lượng protein (%) ..................................................................... 47 Hình 4.4. Đồ thị hoạt tính riêng của protein enzyme .................................................. 48 Hình 3.5. Quy trình tách chiết enzyme bromelain từ vỏ dứa ....................................... 49 1 LỜI MỞ ĐẦU Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Những nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa. Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất hết sức cần thiết trong việc chẩn đoán bệnh và nó đã trở thành công cụ thực tế không thể thiếu không những trong y học cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm. Hiện tại trên thế giới enzyme được sản xuất từ nguồn động vật đang đối mặt với nhiều vấn đề về đạo đức, tôn giáo, truyền thống văn hóa, phong tục truyền thống của các quốc gia và ngày càng cạn kiệt nguồn nguyên liệu nên việc thực hiện trên nguồn thực vật đang dần được chú trọng hơn. Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú, dồi dào (dứa, đu đủ…). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao. Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nha Trang và sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Bảo, em xin tiến hành thực hiện Đồ án tốt nghiệp “Tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) bằng phương pháp lọc”. 2 Nội dung nghiên cứu - Đề xuất qui trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa. - Khảo sát các thông số kỹ thuật của từng công đoạn. - Đánh giá hiệu suất thu hồi bã qua từng công đoạn. - Đánh giá hàm lượng protein qua từng công đoạn. - Đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain qua từng công đoạn. Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu quy trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) bằng phương pháp lọc, phương pháp mới nhưng vẫn tinh sạch được và cho sản phẩm enzyme có chất lượng tốt. Từ đó có thể áp dụng sản xuất rộng rãi trong thực tế. Ý nghĩa khoa học: Góp phần cung cấp thông tin về nghiên cứu tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu dứa và enzyme khác (papain từ nhựa đu đủ, ficin từ nhựa sung) bằng phương pháp lọc. Cung cấp thêm nguồn enzyme từ thực vật cho thị trường thế giới Ý nghĩa thực tiễn: - Năng cao thu nhập cho người nông dân trồng dứa. - Giảm ô nghiễm môi trường, giảm chi phí xử lý rác thải và mang lại nguồn lợi nhuận từ phế liệu dứa cho các nhà máy chế biến đồ hợp dứa. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về dứa Hình 1.1 Quả dứa Nguồn gốc – phân bố Dứa còn gọi là khóm (miền Nam). Loài dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới nổi tiếng. Hoa tập hợp quanh một trục lớn thành bông ngắn, mỗi hoa mọc ở kẽ một lá màu tím, bầu dưới, quả mọng. Quả dứa là một quả phức, phần ăn được gồm trục hoa và các lá bắc mọng nước, còn quả thật nằm trong các mắt dứa. Dứa chứa nhiều vitamin và vi chất rất có lợi cho cơ thể, giúp giảm stress. Ngoài quả dứa dùng để ăn, gần đây dứa đã trở thành nguyên liệu chiết bromelain dùng trong nhiều ngành công nghiệp và làm thuốc chữa bệnh. Loại quả này có thể chữa một số bệnh như khó tiêu, viêm ruột, sốt nóng, cảm nắng... Thuộc về họ Dứa (Bromeliaceae), được biết đến nhiều nhất là loài Ananas comosus, là loại dứa cho quả ăn được. Chi này có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ và được đưa tới các đảo khu vực Caribe nhờ những thổ dân Anh điêng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus lần đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe. Nó được đưa sang châu Âu và từ đây nó được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương. Các cánh đồng trồng dứa thương phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã trở thành một trong những loại cây ăn trái phổ biến nhất trên thế giới. Từ Ananas có nguồn gốc từ tiếng Guarani để chỉ cây dứa. Tại Việt Nam, dứa được trồng khá phổ biến, phân bố từ Phú Thọ đến Kiên Giang. Tiền Giang là tỉnh có sản lượng dứa đứng đầu cả nước. Năm 2013, sản lượng 4 dứa của tỉnh Tiền Giang đạt 233,000 tấn. Tiếp theo là Kiên Giang (114,400 tấn), Ninh Bình (48,900 tấn), Thanh Hóa (23,600 tấn), Quảng Nam (22,400 tấn), Nghệ An, Hậu Giang (19,000 tấn). Tổng sản lượng cả nước năm 2013 đạt 585,6 ngàn tấn. Nhiều địa phương xây dựng thương hiệu đặc sản quả dứa như dứa Đồng Giao (Tam Điệp - Ninh Bình), hoặc ở Kiên Giang (Khóm Tắc Cậu), Tiền Giang đều có những nhà máy chuyên sản xuất, chế biến các thực phẩm từ quả dứa. [13] Hằng năm tổng sản lượng phế phẩm của vỏ dứa từ các tỉnh là rất lớn, gây ô nhiễm môi trường và hết sức lãng phí. Đây cũng là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc tách chiết bromelain tăng giá trị kinh tế . Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013) Tỉnh Sản lượng dứa (tấn) Lượng vỏ dứa phế liệu (tấn) Phú Thọ 2000 515 Ninh Bình 48900 12591,75 Thanh Hóa 23600 6077 Quảng Nam 22400 5768 Nghệ An 19000 49892,5 Tiền Giang 233000 59997,5 Hậu Giang 19000 49892,5 Kiên Giang 114400 29458 Cả nước 585600 150792 Nguồn: Thống kê của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2013) 1.2. Tổng quan về enzyme bromelain 1.2.1. Khái niệm về enzyme 1.2.1.1. Khái niệm Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra các quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp các quy luật phản ứng của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau. Các phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều hòa lẫn nhau. 5 Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng. 1.2.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Dưới tác dụng của enzyme cơ chất có thể thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học mà còn thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra ở ba giai đoạn: - Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất thường xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng. - Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm. - Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzyme. Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme như sau: Ghi chú: E – enzyme; S – cơ chất (substrate); P – sản phẩm (products) 1.2.2. Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain Bromelain có tên gọi khác: Bromelin, Ananase.[7] Tên thương mại: Bromanase (Kramer – Novis) brormelain 2400 maximum strength (Vitalize Corp) Là tên gọi chung cho các enzyme phân giải protein được tìm thấy trong các thành viên khác nhau của gia đình nhà bromeliaceae. Bromelain từ dứa (Ananas comosus) 6 được nghiên cứu nhiều nhất. Nồng độ enzyme cao nhất được tìm thấy ở phần thân của cây dứa trưởng thành, cũng hiện diện với số lượng đáng kể trong trái và lá. Trước đây, cây dứa thường được sử dụng như một loại cây làm thuốc. Năm 1957, nhà nghiên cứu Heinicke đã nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelain và họ bắt đầu tìm cách tách chiết nó và sản xuất thuốc để chữa bệnh. Tùy theo nguồn thu nhận mà phân biệt bromelain thân hay bromelain quả. Bromelain thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế cao. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên thân cây dứa, bromelain có pH tối ưu và cấu tạo khác nhau. Bromelain có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều. Bromelain là enzyme thủy phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật. Một trong những lợi ích của nó được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động ở môi trường acid và cả trong môi trường kiềm của ruột non. Nó thay thế được cho cả những enzyme tiêu hóa khác như pepsin và trypsin. Bromelain có tác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm khớp do đó các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain làm giảm lượng prostaglandin trong cơ thể gay ra đau, viêm và ngăn cản sự thẩm thấu các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm. Bromelain có ảnh hưởng tích cực trên các prostaglandin hữu dụng. Trong một nghiên cứu trên thỏ đưa ra kết quả khẳng định: Bromelain làm giảm phù nề các vết thương tốt hơn khi kết hợp với trypsin và rutin. Bromelain phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophhyllin, ephedrin…) làm tăng tác dụng chống hen. Một nghiên cứu trên tạp chí Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy bromelain làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen và liều lượng càng cao thì hiệu quả được cải thiện. Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp người bị ung thư giảm được di căn (200 -300 mg bromelain/kg thể trọng kết hợp với xạ trị hoặc hóa trị). Nó còn có tác dụng chữa đau tim (làm tan máu tụ gây đau tim). Ngoài ra còn rất nhiều ứng dụng khác trong các ngành công nghiệp như: - Công nghiệp thực phẩm: Thủy phân gan bò: Bromelain được ứng dụng để xử lý gan bò nhằm thu dịch thủy phân gan có hàm lượng acid amine cao. Gan bò được xử lý bằng chế phẩm bromelain 7 trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ 55 0C, sau đó xử lý ở 100 0C trong vòng 3-4 phút. Dịch thủy phân tách được đem lọc và đông khô. Hàm lượng acid amine của chế phẩm tăng lên gấp 1,5 – 2 lần so với sản phẩm ban đầu (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998). - Làm đông tụ sữa: Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông sữa truyền thống, enzyme này được thu từ ngăn thứ 4 của dạ dày bê. Tuy nhiên, lượng renin không đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của công nghiệp làm sữa. Vì vậy, ngày nay người ta có xu hướng thay thế enzyme renin bằng enzyme thực vật, trong đó bromelain được quan tâm sử dụng nhiều hơn (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998). - Trong chế biến bia và nước giải khát: Trong chế bia và nước giải khát; bromelain được dùng để làm trong bia và nước quả (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998; Quách Đĩnh và ctv, 1996. - Tăng cường sự ổn định protein của các loại bia và ngăn chặn sự hình thành sương mù trong công nghiệp sản xuất rựu bia.[8] - Cải thiện độ đàn hồi và tăng mức co giãn của bột, sản xuất bột không gây kích ứng trong công nghiệp nướng. - Thủy phân protein myofibril của thịt, làm tác nhân thủy phân cho thịt gà, sò và mực trong việc làm mềm thịt - Thủy phân protein cá để tạo ra protein cá thủy phân. - Ức chế sự biến nâu của trái cây và oxy hoá phenol - Bổ sung vô thức ăn chăn nuôi: Trong việc phân hủy protein trong thức ăn ở động vật nhai lại. - Giảm thời gian làm mềm trong kén ăn, giảm bỏ tạp chất và qui mô của các sợi len, tăng cường tính nhuộm của các sợi protein trong công nghiệp dệt may. - Làm trắng răng: Loại bỏ các vết bẩn, mảng bám, mãnh vụn thức ăn thừa bám trên răng. - Mỹ phẩm: Trị mụn trứng cá, nám, giảm sưng và bầm tím sau khi tiêm. 8 1.2.3. Tính chất của enzyme broemelain 1.2.3.1. Thành phần Bromelain là một hỗn hợp của: - Thiol Endo-peptidase như Ananain và comosain được coi là thành phần hoạt động chính [7] . Ngoài ra còn có: - Phosphatases - Glucosidases - Peroxidases - Cellulases - Glycoproteins - Protein ức chế chẳng hạn như cystatin Hỗn hợp tổng thể này của bromelain có xu hướng hoạt động phản ứng trên liên kết có analyl, glycyl và leucyl. Khi tách chiết và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của bromelain thì không chỉ phụ thuộc vào phân đoạn mà còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác có trong bromelain. Hiện tại người ta ghi nhận được bromelain trong dứa có trọng lượng phân tử 33000 dalton lớn gấp 1.5 lần so với papain. Trọng lượng phân tử của bromelain thân (EC.3.4.22.32- stem bromelain) ở giá trị trung bình (22830,93 dalton), đoạn chính (22816,26 dalton). Nó có tám thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein như trên. Hai thành phần chính được gọi là F4 (24397 dalton) và F5 (24472 dalton) [7] . Phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là F9 (23464 dalton) chiếm khoảng 2 % protein trên tổng số. Người ta ước tính rằng khoảng 50 % protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate. pH tối thích của phân đoạn F4 và F5 là 4,0 đến 4,5 và của F9 thì gần với pH trung tính.[9] So với bromelain thân thì bromelain quả (EC. 3.4.22.33-fruit bromelain) có trọng lượng phân tử nguyên tử (39029,6 dalton), đoạn propepetide (36417,12 dalton), đoạn chín (24880,75 dalton). 9 Có sự khác nhau giữa các trọng lượng phân tử của bromelain quả và thân như trên là do các PTM của các acid amin thay đổi, dẫn đến trọng lượng phân tử của đoạn code của mã di truyền thay đổi theo. Dịch chiết được chiết tách từ các thành phần khác nhau trên cây dứa sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân thì giống nhau. Bromelain có thể thấm qua hoàn toàn dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao nhất của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thủy phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có thể do tác động của các enzyme nội sinh và yếu tố α-2-macroglobuline của huyết thanh. [2] 1.2.3.2. Cấu tạo hóa học Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain (từ đu đủ), ficin (nhựa sung) ở chỗ nó là glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fuctose. Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Trong sợi hydrate này dường như một nữa sợi không kiên kết đến cơ chế xúc tác phân tử. Người ta đề nghị cấu trúc sợi hydrate carbon của phân tử bromelain như sau: 10 OH OH OH fructose OH OH Maltose CH2O2 OH CH2 OH OH Maltose OH Glucofamine Maltose CH2O2 CH2O2 OH C NHCONH2 NH-CO-CH2-CH OH OH N OH NHCONH2 Xylose Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon của enzyme bromelain Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelain thân và quả thì tùy vào phương pháp thu nhận và phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác nhau. Thay đổi trong khoảng 144-321 amino acid và bromelain quả là 161-283 amino acid. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu carbonhydrate là glycine, còn bromelain quả có amino acid ở đầu amine là alanine. 11 Bảng 1.2 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain Amino acid Thân Quả xanh Quả chín Aspartic acid 29 - 29,4 29,8 29,8 Glutamicacid 23 23,2 23,4 Glycine 24,6 – 35 32,6 32,2 Alanine 35 - 35,4 23,8 24,4 Valine 21,6 – 22 19,8 20,1 Leucine 10 10 10 Threonine 21 – 21,2 16,4 16,2 Cystine 28 – 28,2 32,2 32 Methionine 13,6 – 14 13,5 13,8 Proline 14 – 14,2 11,6 12,1 Phenylalanie 8,8 – 9 7,6 8 Tyrosine 20,8 – 21 22,4 22,2 Tryptophan 8 – 8,1 5,6 -s Histidine 1,9 – 2 1,4 1,3 Lysine 22,9 – 23 7,8 8,3 Arginine 11,5 – 12 8,6 9,1 Amid 41,6 – 42 43 43,4 Glucosamine 5,8 – 6 0,2 0,2 Carbohydrae 1,46 3,2 3,2 Nguồn: [2] 1.2.3.3. Cấu trúc không gian của bromelain Theo Murachi và Busan[10] , cấu trúc bậc 1 của bromelain được sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: Hình 1.3 Cấu trúc bậc 1 của bromelain 12 Bromelain là protein là một trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S-. Phân tử có dạng hình cầu dó đó có cách sắp xếp phức tạp, bao gồm 351 amino acid: Hình 1.4 Trình tự sắp xếp các amino acid của quả dứa Nhưng trong đó enzyme bromelain chỉ từ amino acid 122 đến 351. Còn lại amino acid 1 đến 24 là các hoạt chất sinh học bắt tính hiệu kết hợp với các propeptide 25 đến 121 ngắt tách protein enzyme bromelain ra ngay tại vị trí đó. Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfulhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme. Ngoài ra nó cũng không có khác biệt lớn về trình tự sắp xếp và thành phần amino acid của bromelain quả. Bảng so sánh các thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả:[10] 13 Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả 1.2.3.4. Tính riêng biệt Hai hình thức (A và B) của Bromelain với độ đặc hiệu tương tự đã được phân lập từ thân dứa [10] 1.2.3.5. Hoạt tính của bromelain Hoạt tính phân giải Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase và esterase. Bromelain thân có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA (Benzyol – L –Arginine amidez), BAEE (Benzyol – L –Arginine Ethyl Ester), BAEM (Benzoyl – L – Arginine Methyl Ester). [2]