Tài liệu Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử mas chọn lọc các dòng lúa triển vọng cho năng suất cao mang qtl gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------ ------ ĐỖ NGỌC TUYỀN SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------ ------ ĐỖ NGỌC TUYỀN SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN ĐĂNG KHÁNH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện hầu hết các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! Tác giải luận văn Đỗ Ngọc Tuyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học này, tôi xin bày tỏ sự biết ơn vô cùng sâu sắc tới TS.Trần Đăng Khánh – Phòng sinh học phân tử - Viện di truyên Nông Nghiệp về những hướng dẫn tận tình, chu đáo bên cạnh những kiến thức sinh học bổ ích khác. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu, nhiệt tình của tập thể cán bộ thuộc: 1. Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp 2. Khoa Khoa học sự sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên là những nơi tôi đã tiến hành luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học của mình. Luận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia. Tác giả luận văn Đỗ Ngọc Tuyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt............................................................ iv Danh mục bảng.................................................................................................. v Danh mục hình ................................................................................................. vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Nguồn gốc, phân loại, ý nghĩa của cây lúa ............................................. 4 1.2. Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ........................................ 6 1.2.1. Chỉ thị phân tử .................................................................................. 6 1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ( Phương pháp Marker assisted selection- MAS) ..................................................... 11 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu ........................................................... 15 1.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế ........................................ 15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................... 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 24 2.1.1.Giống lúa nghiên cứu ....................................................................... 24 2.1.2.Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm ..................................... 24 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................... 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 25 2.2.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng ............................................. 25 2.2.2. Các phương pháp thí nghiệm trong phòng ..................................... 25 2.2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu. ......................................... 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Chƣơng 3: KẾT QỦA NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 31 3.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 giữa giống Khang Dân 18 và giống KC25........................................................... 31 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ..................................................... 31 3.1.2. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 .... 31 3.2. Kết quả lai tạo thế hệ F1 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 .......... 32 3.3. Kết quả xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25 ................................................................... 33 3.4. Kết quả xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F2 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25 ................................................................... 34 3.5. Kết quả xác định các cá thể trong quần thể F3 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt/bông ............. 37 3.6. Kết quả xác định dòng lúa triển vọng mang QTL/gen Yd7 cho năng suất cao ......................................................................................................... 40 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 42 4.1. Kết luận ................................................................................................. 42 4.2. Kiến nghị ............................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ Cs : Cộng sự dNTP : Deoxynucleotide triphosphate MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/QTLs : Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản TBE : Tris-Boric Acid-EDTA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thông tin những cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu ............ 24 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 27 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 27 Bảng 3.1: Bảng thống kê kết quả thí nghiệm .................................................. 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Minh họa QTL/gen Yd7………….………………………………. 26 Hình 3.1: Kết quả tách DNA tổng số trên gel agarose 0,8%..……...….… . …31 Hình 3.2: Sản phẩm điện di với các chỉ thị trên gel agarose 2,5%.........… . …32 Hình 3.3: Kết quả lai tổ hợp Khang dân 18 và KC25……………….………. 33 Hình 3.4: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM500 ............. 33 Hình 3.5: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM21615 ......... 34 Hình 3.6 : Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM21615 .......... 35 Hình 3.7: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM500 ............... 36 Hình 3.8: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F3 với chỉ thị RM500 ............... 38 Hình 3.9: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F3 với chỉ thị RM445 ............... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lúa (Oryza sativa) là cây lương thực quan trọng, với diện tích trồng khoảng 148,4 triệu hecta trên toàn thế giới (trong đó châu Á chiếm 135 triệu hecta). Lúa gạo là một trong những cây trồng cung cấp nguồn lương thực quan trọng nhất, lúa có ảnh hưởng đến đời sống của ít nhất 65% dân số thế giới. Châu Á chiếm 90% diện tích đất trồng lúa của thế giới với sản lượng 651 triệu tấn chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo thế giới (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2010), trong đó khoảng 75% diện tích lúa được trồng trong điều kiện ruộng ngập nước, 19% diện tích lúa trồng trong điều kiện ruộng thấp nhờ nước trời và khoảng 4% diện tích lúa trồng trong điều kiện ruộng cạn, không chủ động nước. Việt Nam có 4,36 triệu hecta trồng lúa, sản lượng đạt 34,4 triệu tấn, năng suất bình quân 4,67tấn/hecta, xuất khẩu 44 triệu tấn gạo.Ở Việt Nam lúa gạo là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực của nền nông nghiệp và cũng là nguồn lương thực chính của hơn 86 triệu dân trong nước. Do quá trình đô thị hóa, công nghiêp hóa diễn ra nhanh chóng, diện tích đất dành cho việc trồng lúa ngày càng bị thu hẹp, và chịu những ảnh hưởng tiêu cực từ biến đổi khí hậu làm năng suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, cùng với áp lực dân số ngày càng tăng đòi hỏi nguồn cung lương thực ngày càng lớn. Vì vậy, đáp ứng sản lượng lương thực là rất cần thiết. Việc phát triển nguồn giống đã được cải tiến cho năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng cho việc đảm bảo hệ thống sản lượng lúa. Chọn tạo giống lúa có khả năng năng suất cao là hết sức cần thiết, cấp bách và có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu nhập của nông dân.Trong công tác chọn giống cây trồng, các tính trạng được khảo nghiệm là những tính trạng liên quan đến năng suất, phẩm chất của sản phẩm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 và chủ yếu liên quan tới việc tăng cường tính chống chịu đối với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi, những đặc điểm mong muốn về hình thái luôn bị ảnh hưởng từ điều kiện môi trường hoặc không biểu hiện khi điều kiện ngoại cảnh không phù hợp. Xuất phát từ những thực tế trên tôi thực hiện đề tài: “Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) chọn lọc các dòng lúa triển vọng cho năng suất caomang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông”với mục tiêu thông qua phương pháp MAS (Marker - Assisted Selection) xác định được các dòng lúa triển vọng cho năng suất cao. 2. Mục đích nghiên cứu Chọn được cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông ở thế hệ F1, F2, F3 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25. Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử chọn lọc dòng lúa mang QTL/gen và cho năng suất triển vọng. 3. Ý nghĩa của đề tài Xác định kiểu gen ở cả quần thể F1, F2, F3, khẳng định sự có mặt của QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông trong quần thể. Đánh giá nhanh và chính xác các dòng lúa mang QTL/gen làm tăng năng suất. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử làm giảm thời gian, công sức và vật chất nhiều lần so với chon giống bằng phương pháp truyền thống. Tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về các tính trạng tăng năng suất. 4. Nội dung nghiên cứu 4.1. Xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 giữa giống Khang Dân 18 và giống KC25. 4.2. Lai tạo thế hệ F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 4.3. Xác định con lai F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25. 4.4. Xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F2 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25. 4.5. Xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F3 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25. 4.6. Xác định dòng lúa triển vọng mang QTL/gen Yd7 cho năng suất cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân loại, ý nghĩa của cây lúa Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae, trước đây là họ Gramineae) thân bụi, lá mềm. Lúa trồng thuộc chi Oryza với nhiều loài khác nhau. Hai loài được quan tâm nhiều hơn cả là Oryza sativa L. và Oryza glaberrima L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực đông nam châu Á và châu Phi. Hai loài này cung cấp hơn 1/5 toàn bộ lương thực mà con người sử dụng. Loài Oryza sativa L. có ba loài phụ là Indica, Japonica, và Javanica. Trong đó, Indica là loại lúa được trồng nhiều ở các vùng nhiệt đới, Japonica được trồng ở vùng ôn đới. Loài Oryza sativa L. có số nhiễm sắc thể đơn bội n = 12. Tám trong số 23 loài lúa dại có bộ gen tứ bội, đại đa số các loài lúa dại và lúa trồng hiện nay có bộ gen lưỡng bội (2n). Hiện có khoảng 83.000 mẫu lúa được lưu giữ ở ngân hàng gen quốc tế tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI), ngân hàng gen quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam,..Trong đó, có khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu hạn, úng, nóng, lạnh, sâu bệnh. Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa châu Á vì nó được thuần hóa từ lúa dại từ ba trung tâm đầu tiên ở châu Á. Theo đặc điểm lúa trồng Việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica. Lúa là cây lương thực quan trọng trong đời sống của con người. Lúa cung cấp lương thực cho hơn 1/2 dân số thế giới. Trên 2/3 lượng calo cho 3 tỷ dân ở châu Á, 1/3 lượng calo cho 1,5 tỷ dân ở châu Phi và châu Mỹ La Tinh là do lúa cung cấp. Trong cơ cấu sản xuất lương thực của thế giới lúa mì chiếm 30,5%, lúa gạo 26,5%, ngô 24%, còn lại là các loại ngũ cốc khác. Cây lúa đem lại hiệu quả kinh tế cao. Ngoài việc sử dụng làm lương thực, các sản phẩm phụ, cây lúa còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 nhau như: Làm nguyên liệu sản xuất rượu, bia, sản xuất tinh bột, cồn, phấn mịn, cám gạo có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc; trong công nghệp dược dùng để sản xuất vitamin B1, dầu cám có chất lượng cao dùng chữa bệnh, chế tạo sơn cao cấp, làm mỹ phẩm, xà phòng; trấu dùng để sản xuất nấm men…; rơm rạ có thể dùng làm chất đốt, sản xuất giấy, sản xuất nấm. Châu Á vốn là vùng đông dân cư và cũng là vùng sản xuất lúa gạo chủ yếu của thế giới, trong thập kỷ qua cũng có những tiến bộ đáng kể trong việc năng cao năng suất và sản lượng lúa gạo. Châu Á sản xuất khoảng 92% tổng sản lượng lúa gạo của thế giới, châu Mỹ 4,7%, châu Phi 2,7%, châu Đại dương sản xuất khoảng 0,2% tổng sản lượng lúa gạo của thế giới. Những nước sản xuất lúa gạo lớn nhất thế giới đều tập trung ở các nước châu Á như Bangladet, Myanma, Việt Nam, Trung Quốc, Indonexia, Ấn Độ, Triều Tiên, Thái Lan và Nhật Bản, sản xuất khoảng 90% sản lượng lúa gạo của Châu Á và khoảng 88,6% sản lượng lúa gạo thế giới. Riêng hai nước Trung Quốc và Ấn Độ sản lượng chiếm 67% tổng sản lượng lúa gạo của châu Á và khoảng 57% tổng sản lượng của thế giới. Việt Nam nằm ở vùng Đông nam châu Á, khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thích hợp với sự phát triển của cây lúa. Có nhiều đồng bằng châu thổ rộng lớn được bồi đắp thường xuyên như đồng bằng châu thổ sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long cùng hàng loạt các châu thổ nhỏ hẹp ở ven các dòng sông, và ven biển miền trung khác. Các đồng bằng châu thổ đều được sử dụng trong sản xuất nông nghiệp, chủ yếu là nghề trồng lúa. Sản xuất lúa gắn liền với sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta. Đến nay, nghề trồng lúa của Việt Nam không ngừng phát triển. Năm 2006, tổng diện tích trồng lúa là 7,32 triệu hécta với sản lượng đạt 35,83 triệu tấn, trong đó đồng bằng sông Cửu Long và đồng bằng sông Hồng chiếm khoảng 66,8% diện tích gieo trồng và 69% tổng sản lượng cả nước. Từ một nước thiếu đói triền miên, Việt Nam đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 vươn lên cung cấp đủ gạo cho người dân và trở thành nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới. Để nâng cao hiệu quả sản xuất lúa gạo thì việc tạo ra các giống lúa có năng suất cao có vai trò quan trọng 1.2. Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống 1.2.1. Chỉ thị phân tử Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, quá trình chọn lọc được dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính trạng cần quan tâm. Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống đã trở nên hữu hiệu không chỉ đối với các tính trạng được điều khiển bởi các gen chính mà đối với cả những tính trạng số lượng được điều khiển bởi các gen phụ hay các QTLs. Hiệu quả cải tiến cây trồng sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với chọn giống cổ điển, nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn, mà thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó. Phương pháp này cho phép thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn. Thông qua chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử, người ta có thể xác định được cây mang gen ngay thế hệ phân ly đầu tiên ở F2, F3. Như vậy các nhà chọn giống có thể rút ngắn thời gian đánh giá kiểu hình, tập trung chọn lọc những mục tiêu quan trọng khác có giá trị về mặt kinh tế. Nếu so sánh với chọn lọc kiểu hình, MAS có thể giúp các nhà chọn giống tiết kiệm từ 1 đến 16,7 lần trong chọn lọc quần thể [35]. Một chỉ thị phân tử ADN đạt tiêu chuẩn cần có những yêu cầu như: bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội (cho phép phân biệt cá thể đồng hợp tử - dị hợp tử), phân biệt rõ ràng giữa các alen, xuất hiện nhiều trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 genôm (tần suất xuất hiện trong hệ genôm cao), phân bố đều trên hệ genôm, dễ dàng tiếp cận đánh giá, trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gen), phân tích nhanh và dễ dàng, khả năng tái lập cao, kết quả trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu, chi phí thấp [33], [55]. Trong thực tế, không có một chỉ thị phân tử ADN nào lý tưởng, đạt được đầy đủ những yêu cầu này; tùy từng mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phân tử DNA thỏa mãn một số điều kiện chính [1]. Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử còn là phương tiện hữu ích trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ chọn lọc loại bỏ được các tác nhân gây nhiễu do các tương tác trong cùng aloen hay giữa các alen gây ra những này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình. Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt. Các chỉ thị phân tử DNA bao gồm: Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sởphép lai DNA hay chỉ thị RFLP Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như AFLP, RAPD, STS, SSR.. a. Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn ). Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người [20]. Trong chỉ thị RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt DNAgenome thành nhiều mảnh DNA có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong DNA bộ gen như đảo đoạn, thêm hoặc mất đoạn DNA tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 thể. Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tửDNA của hệ gen, các đoạn cắt ra của DNA với kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu nhiễm sắc thể. Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các DNA mẫu dò. Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP. Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi có phòng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình b. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên). Đây là loại chỉ thị di truyền được tạo ra trên cơ sở của phản ứng PCR, sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit và quá trinh nhân bội ngẫu nhiên. Sản phẩm nhân bội có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể được quan sát sau khi nhuộm gel với các hoá chất đặc trưng. Nó là loại chỉ thị di truyền trội. Sự khác biệt giữa hai cá thể có thẻ nhận biết bằng sự có mặt hay vắng mặt của những băng RAPD đặc trưng. Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng. c. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc). Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR [54]. Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết cắt các mẫu nghiên cứu bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn DNA sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 9 nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn DNA thích ứng vào hai đầu DNA đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR. Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn DNA có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.Ưu điểm của phương pháp này là lượng DNA sử dụng cho nghiên cứu ít, băng DNA ổn định, khả năng ứng dụng rộng rãi và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kế mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn. AFLP còn cung cấp một lượng đa hình DNA lý tưởng từ DNA của bất kỳ nguồn gốc nào từ đơn giản đến phức tạp. AFLP cũng được coi là công cụ hiệu quả nghiên cứu tính đa hình di truyền, tìm chỉ thị liên kết, xây dựng bản đồ di truyền mật độ cao. Đặc biệt được dùng trong phân tích DNA từ nhiều nguồn gốc với mức độ phức tạp khác nhau. d. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu). Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của DNA trong genome. STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này. Chỉ thị này được đưa ra từ việc xác định trình tự hai đầu của mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó người ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR. Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài [48]. e. Chỉ thị SSR (Simple sequence repeats) Chỉ thị SSR lần đầu tiên được thiết kế và ứng dụng trong nghiên cứu ở người vào năm 1989 và ứng dụng chọn tạo giống cây trồng vào cuối năm 1992. SSR là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị có chiều dài từ 1 – 6 nucleotide lặp lại được gọi là Microsatellites. SSR có trong khắp hệ gen của sinh vật. Bản chất đa hình của Microsatellites có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ sung với trình tự gần kề hai đầu đoạn lặp lại. Giá trị của SSR ở chỗ nó sinh ra đa hình từ nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chât đồng trội, nên dễ dàng phát hiện bởi các phản ứng PCR. Nguyên lý của kỹ thuật SSR dựa trên những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, hiện tượng này phổ biến với các sinh vật nhân chuẩn, tuỳ thuộc vài từng loài mà số lượng các nuleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi. Các đoạn SSR thường nằm ở vùng gần tâm động hoặc ở đầu mút của nhiễm sắc thể và có vai trò điều hoà hoạt động của gen. SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các tình tự lặp đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Các mồi SSR sau đó được sử dụng tương tự như các mồi RAPD. f. Chỉ thị ISSR ISSR là kỹ thuật dựa trên PCR, nhân bản các đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp SSR hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài khoảng 15 – 25 nucleotit) có trình tự lặp giống như chỉ thị SSR. Các mồi ISSR có thể được bổ sung thêm từ một đến bốn nucleotit “neo” ở đầu 3’ [63] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 hoặc đầu 5’ [68] nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng nhân gen. Hầu hết chỉ thị ISSR là chỉ thị trội và có tính ổn định cao hơn chỉ thị RAPD. Dựa trên các trình tự lặp và số nucleotit làm “neo” để thiết kế mồi ISSR thì số lượng chỉ thị ISSR gần như là không giới hạn [33]. Chỉ thị ISSR có tính đa hình cao và rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Bên cạnh SSR và ISSR còn có nhiều chỉ thị khác được phát triển dựa trên các trình tự lặp nhưng không được sử dụng rộng rãi như STMS và DAMD-PCR [33]. 1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ( Phƣơng pháp Marker assisted selection- MAS) Chỉ thị phân tử là các gen hoặc trình tự nucleotide đặc hiệu trong hệ gen của sinh vật, nó có khả năng định lượng và di truyền như nhân tố Menden. Có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình tự DNA trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong quần thể. Sinh vật có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác cao nhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm biến đổi cấu trúc DNA, đơn giản như các cặp bazơ hay phức tạp như đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc mất đoạn.... Do đó với sự ra đời của chị thị phân tử, phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử là một cách tiếp cận mới giúp tránh được những vấn đề gặp phải ở chọn giống truyền thống, bằng cách thay đổi hình thức chọn lọc từ kiểu hình sang chọn lọc kiểu gen một cách trực tiếp hay gián tiếp. a. Ưu điểm của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái Chỉ thị phân tử rõ ràng không bị ảnh hưởng tác động của môi trường và điêu kiện sống của cây trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng. So với chỉ thị hình thái, chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có các ưu thế sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/