Tài liệu Sinh lý thực vật ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I HÀ NỘI --------------------***--------------------- Giáo trình SINH LÝ THỰC VẬT ỨNG DỤNG PGS.TS VŨ QUANG SÁNG (chủ biên) NGUYỄN THỊ NHẪN, MAI THỊ TÂN, NGUYỄN KIM THANH A +GA3 ð/C LỜI NÓI ðẦU Trong quá trình phát triển của mình, môn khoa học Sinh lý thực vật có hai hướng nghiên cứu chính: - Hướng nghiên cứu Sinh lý – Hoá sinh: chuyên nghiên cứu bản chất các quá trình sống xảy ra trong cơ thể thực vật, từ ñó tìm ra các biện pháp ñiều khiển một phần hay toàn bộ quá trình Sinh lý - Hoá sinh theo hướng có lợi cho con người trong ñiều kiện tự nhiên và nhân tạo như nghiên cứu các quá trình quang hợp, cố ñịnh nitơ phân tử (N2) và quá trình sinh trưởng, phát triển của cây v.v… - Hướng nghiên cứu Sinh lý – Sinh thái: chuyên nghiên cứu mối quan hệ giữa các quá trình sinh lý và các yếu tố sinh thái (nước, nhiệt ñộ, ánh sáng, O2, CO2 và dinh dưỡng, ñất…). Trên cơ sở ñó tìm ra ñược các quy luật hoạt ñộng của các quá trình sinh lý trong các ñiều kiện sinh thái xác ñịnh nhằm xây dựng mô hình sinh thái tối ưu cho các quá trình sinh lý giúp cây sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao, chất lượng tốt. Sinh lý học thực vật còn ñược chia ra các chuyên khoa: - Sinh lý thực vật ñại cương - Chuyên nghiên cứu các chức năng sinh lý chung của thực vật. - Sinh lý thực vật chuyên khoa - Nghiên cứu các quy luật sinh lý cho từng nhóm cây, từng cây như Sinh lý cây trồng, Sinh lý cây rừng, Sinh lý cây ăn quả, Sinh lý cây lúa, cây ñậu tương, Sinh lý cây ngô, cây khoai tây v.v… - Sinh lý thực vật ứng dụng . + Cơ sở biên soạn giáo trình Những năm gần ñây, Sinh lý học thực vật ngày càng tiếp cận với nhiệm vụ của thực tiễn sản xuất nông nghiệp, lâm nghiệp, bảo quản và chế biến nông sản v.v… và nó có vai trò rất quan trọng cho các ngành sản xuất này. Do khuôn khổ giáo trình Sinh lý thực vật cơ bản có thời lượng giới hạn, không thể trình bày hết ñược những ứng dụng và khả năng ứng dụng của môn khoa học này vào sản xuất, trong khi những vấn ñề ứng dụng vào thực tiễn sản xuất người kỹ sư nông học rất cần ñược trang bị.Trước bối cảnh ñó môn học Sinh lý thực vật ứng dụng ra ñời. + ðối tượng và nhiệm vụ của môn học Sinh lý thực vật ứng dụng. Hiểu rõ nguyên lý và ứng dụng vào ñối tượng cây trồng. Vì vậy, nhiệm vụ chính của Sinh lý thực vật ứng dụng là nghiên cứu, ứng dụng những quy luật sinh lý của cây trồng ñã biết vào thực tiễn sản xuất như : • Các kiến thức về Sinh lý tế bào ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi, hiệu quả trong công nghệ nhân giống vô tính cây trồng bằng con ñường nuôi cấy mô (in vitro), giâm chiết cành (in vivo) ñể cung cấp cho sản xuất cây giống có chất lượng cao. • Các kiến thức về trao ñổi nước và dinh dưỡng khoáng ñược ứng dụng vào việc chuẩn ñoán nhu cầu nước, dinh dưỡng ñối với cây.Từ ñó có các biện pháp tưới nước, bón phân hợp lý cũng như ứng dụng trong công nghệ trồng cây không dùng ñất, góp phần tạo nên một nền nông nghiệp sạch và bền vững. • Các kiến thức về quang hợp giúp chúng ta ñưa ra các biện pháp kỹ thuật ñiều khiển hệ quang hợp trong quần thể cây trồng ñể “kinh doanh” năng lượng ánh sáng mặt trời hiệu quả nhất. • Những kiến thức về hô hấp ñưa ñến các biện pháp kỹ thuật bảo quản nông sản phẩm và ngâm ủ hạt giống, làm ñất gieo hạt... • Sự hiểu biết về sinh trưởng, phát triển của thực vật cũng như các chất ñiều hoà sinh trưởng thực vật ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp ñể ñiều khiển cây sinh trưởng, phát triển theo hướng có lợi cho con người. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….1 Ngoài ra những kiến thức hiểu biết về Sinh lý học thực vật còn ñược ứng dụng trong ñiều khiển và khai thác các hệ sinh thái tối ưu, liên quan ñến việc bảo vệ môi trường bền vững . + Kết cấu của giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng: gồm 7 chương Chương I : Nhân giống vô tính cây trồng . Chương II: ðiều khiển trao ñổi nước và dinh dưỡng khoáng ñối với cây trồng . Chương III: Trồng cây không dùng ñất . Chương IV: Quang hợp của quần thể cây trồng . Chương V: ðiều khiển hô hấp trong trồng trọt và bảo quản nông sản phẩm. Chương VI: Ứng dụng chất ñiều hoà sinh trưởng trong trồng trọt. Chương VII: ðiều chỉnh phát sinh hình thái của cây. Trong quá trình biên soạn giáo trình này chúng tôi ñã kết hợp những kiến thức của Sinh lý học thực vật với sự hiểu biết về các ứng dụng và khả năng ứng dụng của môn học này trong sản xuất . Do ñó cuốn giáo trình này không chỉ là tài liệu học tập cần thiết cho sinh viên ngành nông học mà còn là tài liệu tham khảo cho tất cả những ai quan tâm ñến lĩnh vực này. Tuy nhiên, vì ñây là giáo trình biên soạn lần ñầu và thời gian có hạn, lượng thông tin có thể còn hạn chế nên trong biên soạn không tránh khỏi những khiếm khuyết. Chúng tôi rất mong nhận ñược sự góp ý của các chuyên gia và bạn ñọc ñể cuốn sách này ñược hoàn thiện hơn. ðể học tốt hơn môn học này, nên tham khảo thêm một số tài liệu sau: 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. NXB nông nghiệp, Hà Nội, 1997. 2. Trần Minh Tâm. Bảo quản và chế biến nông sản sau thu hoạch. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2002. 3. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn. Chất ñiều hoà sinh trưởng với cây trồng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1993. 4. Vũ Văn Vụ. Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999. Các tác giả. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….2 A. PHẦN LÝ THUYẾT CHƯƠNG I NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG - Nắm ñược các khái niệm và những ưu nhược ñiểm của các hình thức nhân giống thực vật nói chung và nhân giống cây trồng nói riêng. Dựa vào khả năng nhân giống vô tính thực vật trong tự nhiên ñể con người vận dụng vào thực tiễn sản xuất trong công tác nhân giống vô tính cây trồng. Nắm ñược cơ sở khoa học và những ưu nhược ñiểm của các phương pháp nhân giống vô tính cây trồng nhân tạo - Kỹ thuật nhân giống vô tính cây trồng in vivo (phương pháp giâm, chiết cành; ghép cành): những ưu nhược ñiểm, cơ sở khoa học của phương pháp, các thao tác cụ thể. Ứng dụng của từng phương pháp trong sản xuất. - Kỹ thuật nhân giống vô tính cây trồng in vitro (phương pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào): cơ sở khoa học, ưu nhược ñiểm, các ñiều kiện cần thiết trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật của từng giai ñoạn nuôi cấy mô tế bào. Ứng dụng vào thực tiễn sản xuất 1. Một số khái niệm liên quan ñến nhân giống * Sinh sản (Reproduction) : là khả năng sinh vật tái tạo các thế hệ. Phương thức sinh sản rất ña dạng nhưng ñều thuộc hai hình thức chính là sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Sinh sản hữu tính (Secxual reproduction) là hình thức sinh sản có sự kết hợp của giao tử ñực và cái ñể tạo thành phôi, sau ñó phát triển thành cơ thể mới hoàn chỉnh. Sinh sản hữu tính có thể là tự phối hoặc tạp giao. Sinh sản vô tính (Asecxual reproduction) là hình thức sinh sản không có sự kết hợp của giao tử ñực và cái. Sinh sản vô tính ở cây trồng có các hình thức sau : Sinh sản vô phối (Agamic reproduction): phôi ñược tạo ra không do thụ tinh giữa tế bào trứng và tinh trùng, ñây là hiện tượng tự nhiên ñể tạo ra dòng vô tính thông qua hạt giống. Sinh sản sinh dưỡng (Vegetative reproduction): là khả năng tái tạo một cơ thể mới hoàn chỉnh từ một bộ phận nào ñó ñược tách rời khỏi cơ thể mẹ như thân, rễ, lá, củ, chồi.... Trong tự nhiên, nhiều loại cây trồng có thể sinh sản vừa bằng hình thức hữu tính, vừa bằng hình thức vô tính, nhưng cũng có nhiều loại cây trồng chỉ sinh sản bằng hình thức hữu tính hoặc vô tính * Nhân giống (Propagation): là biện pháp kỹ thuật mà con người dùng ñể tái tạo các cá thể cần thiết thông qua hệ thống sinh sản. Vì vậy, có thể sử dụng hình thức nhân giống bằng phương pháp hữu tính hoặc phương pháp vô tính tuỳ vào mục ñích cũng như các loại cây trồng. 2. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp hữu tính + Khái niệm : nhân giống bằng phương pháp hữu tính là hình thức cây con ñược hình thành từ hạt. Ðây là hình thức nhân giống cổ truyền mà con người sử dụng từ khi biết trồng trọt. Hạt là ñược hình thành do kết quả thụ tinh giữa giao tử ñực (hạt phấn) với giao tử cái (noãn). Từ hạt sẽ hình thành một cây mới mang ñặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo) hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối). Hạt ñược hình thành do quá trình tự thụ phấn của hoa hoặc do thụ phấn nhân tạo. + Những ưu ñiểm Ưu ñiểm của phương pháp nhân giống hữu tính ñã ñược Edwin .F. George (1993) tổng kết thành bốn ñiểm chính sau: - Phương pháp tiến hành ñơn giản trong tự nhiên hoặc nhân tạo mà không cần sử dụng dụng cụ thiết bị phức tạp. Ðồng thời, phương pháp nhân giống hữu tính tạo nên ñược một số lượng lớn cây giống nên giá thành cây giống thường rẻ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….3 - Hạt giống có thể bảo quản ñược trong thời gian dài trong các dụng cụ ñơn giản như bao bì, chum, vại, chai, lọ... tuỳ thuộc từng loại hạt và sự rủi ro trong quá trình bảo quản thấp, hạt giống ñảm bảo tỷ lệ sống cao. - Dễ dàng vận chuyển và phân phối khối lượng lớn hạt giống từ nơi sản xuất ñến nơi tiêu thụ. - Các loại sâu bệnh và virut phần lớn là không lây truyền qua hạt nên cây giống mọc từ hạt là cây sạch bệnh. + Những nhược ñiểm Nhược ñiểm lớn nhất của phương pháp nhân giống hữu tính là ña số cây con ñược sinh ra từ hạt sẽ có những tính trạng thay ñổi so với cây mẹ, mỗi một sự thay ñổi ñó là ñại diện của một tổ hợp gen mới ñược hình thành trong quá trình phân bào giảm nhiễm. Vì vậy cây nhân giống bằng phương pháp hữu tính thường không ñồng ñều và không hoàn toàn mang các tính trạng như cây mẹ. Ðối với loại cây ăn quả, cây công nghiệp dài ngày thì nhân giống bằng phương pháp hữu tính ngày càng giảm, người ta chỉ áp dụng hình thức này trong các trường hợp khó thành công trong phương pháp nhân giống vô tính, các loại cây có hạt ña phôi, sử dụng cho công tác lai tạo và chọn lọc giống. 3. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô tính Khái niệm : nhân giống vô tính cây trồng là phương pháp tạo cây con từ các cơ quan, bộ phận dinh dưỡng của cây như cành, thân, rễ, lá, củ..... Ðây là hình thức nhân giống phổ biến ở nhiều loại cây trồng. Quá trình nhân giống vô tính có thể diễn ra trong tự nhiên và nhân tạo. 3.1 Nhân giống vô tính tự nhiên Là hình thức nhân giống mà con người lợi dụng khả năng sinh sản dinh dưỡng của cây trồng, lợi dụng khả năng phân chia các cơ quan dinh dưỡng của cây trồng ñể hình thành một cá thể mới có khả năng sống ñộc lập với cây mẹ và mang các tính trạng của cây mẹ. Hình thức này bao gồm : * Dùng thân bò lan : Ở phần mắt giữa hai lóng, nếu ñược tiếp xúc với ñất sẽ mọc rễ, phía trên mọc chồi ñể tạo thành một cây con hoàn chỉnh, tách rời khỏi cơ thể mẹ ñem trồng thành một cây mới. Biện pháp này thường áp dụng ñối với một số loại cây có tia thân như cây dâu tây. Biện pháp này rất ñơn giản vì loại cây này khi tia thân bò ñến ñâu thì mỗi ñốt sẽ hình thành một cây mới, ta chỉ việc tách các cây mới ñem trồng (hình 1.1). Hình 1.1: Thân bò lan * Tách chồi : Chồi ñược hình thành từ gốc thân chính có ñầy ñủ thân, lá, rễ. Tuỳ từng loại cây trồng mà có các loại chồi khác nhau như chồi thân (chuối), chồi ngầm (khoai nước, sen), chồi cuống quả, chồi chóp quả (dứa). Các chồi nay sau khi tách khỏi cơ thể mẹ có thể ñem trồng ngay hoặc qua giai ñoạn vườn ươm. * Nhân giống bằng thân củ, thân rễ (thân sinh ñịa) : Trên thân của loại cây sinh ñịa có mang các chồi hoặc nhiều mắt chồi, mỗi mắt có thể phát triển thành chồi và thành cây hoàn chỉnh, do vậy có thể dùng cây sinh ñịa ñể nhân giống như hành, khoai tây, gừng, hoàng tinh... 3.2. Nhân giống vố tính nhân tạo Là hình thức nhân giống vô tính có sự tác ñộng của các biện pháp cơ học, hoá học, công nghệ sinh học... ñể ñiều khiển sự phát sinh các cơ quan bộ phận của cây như rễ, chồi, lá... hình thành một cây hoàn chỉnh hoàn toàn có khả năng sống ñộc lập với cây mẹ. Cây ñược tạo nên từ phương thức nhân giống này mang hoàn toàn ñặc tính di truyền như cây mẹ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….4 Người ta phân chia làm hai loại : -Nhân giống vô tính ñược thực hiện trong ñiều kiện tự nhiên (in vivo), với hình thức này, cây giống tạo ra có kích thước lớn (Macro propagation) -Nhân giống vô tính ñược thực hiện trong phòng thí nghiệm (in vitro), với hình thức này cây giống có kích thước nhỏ (Micro propagation). 4. Nhân giống vô tính in vivo (Macro propagation) Nhân giống vô tính in vivo tức là quá trình nhân giống ñược thực hiện trong ñiều kiện tự nhiên gồm các hình thức như tách cây, giâm cành, chiết cành, ghép mắt ñể tạo cây con có ñặc tính giống hệt cây mẹ. * Cơ sở khoa học Tất cả các loại thực vật ñều có ñặc tính tái sinh, tức là, khi tách rời một cơ quan bộ phận nào ñó của cây ra khỏi cây mẹ thì lúc ñó trạng thái nguyên vẹn của cây bị vi phạm, nhờ có ñặc tính tái sinh mà cây có khả năng khôi phục lại trạng thái nguyên vẹn của mình. Ðặc tính tái sinh ở thực vật lớn hơn ñộng vật rất nhiều. Vận dụng ñặc tính tái sinh của thực vật mà con người ñiều khiển cây trồng theo hướng có lợi như biện pháp cắt tỉa tạo tán cho cây cảnh, cây lấy búp ; nhân giống vô tính cây trồng.... Trong biện pháp nhân giống vô tính cây trồng thì khả năng ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm hoặc liền vết ghép ñều dựa vào ñặc tính tái sinh ñể ñảm bảo tính nguyên vẹn của cây. Khi tách một cành ra khỏi cây mẹ thì cây ñó ñã bị mất tính nguyên vẹn của mình, ñể khôi phục lại tính nguyên vẹn của mình, cây có khả năng sinh ra một chồi mới ñể bù ñắp cành vừa mất ñi. Ðồng thời cành ñược tách ra khỏi cây mẹ lúc ñó cũng bị mất tính nguyên vẹn của một cây, tức là, cành bị thiếu phần rễ ñể trở thành cây hoàn chỉnh, nên nó sẽ tự khôi phục tính nguyên vẹn của mình bằng khả năng hình thành rễ bất ñịnh ñể trở thành cây hoàn chỉnh. Hoặc khi ghép mắt thì nhờ khả năng tái sinh của các tế bào xung quanh phần bị cắt ñã làm liền vết thương và tiếp nhận mắt ghép. * Ưu ñiểm của phương pháp nhân giống vô tính in vivo Nhân giống vô tính in vivo bằng các biện pháp giâm cành, chiết cành và ghép mắt có một số ưu ñiểm chính sau : - Tỷ lệ thành công trong nhân giống cao. Các biện pháp giâm, chiết cành hoặc ghép mắt tỷ lệ tạo cây giống thường ñạt ñược từ 50% ñến 100% tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và các biện pháp áp dụng. Hiện nay, người ta thường sử dụng các chất ñiều tiết sinh trưởng ñể khích thích sự ra rễ bất ñịnh cho cành chiết cành giâm thì tỷ lệ ra rễ ñạt tới 100%. - Thời gian tạo cây giống nhanh. Thông thường thời gian tạo cây giống trong kỹ thuật giâm, chiết cành hoặc ghép mắt chỉ từ vài ngày ñến vài tháng tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và biện pháp áp dụng. Bộ môn Sinh lý thực vật- Trường ñại học Nông Nghiệp I rất thành công trong kỹ thuật giâm cành của nhiều loại ñối tượng cây trồng như cây khoai tây, cẩm chướng, cây roi, bưởi, chanh... chỉ sau từ 3 ñến 7 ngày thì cành giâm ra rễ bất ñịnh và sau khoảng 1- 4 tuần thì cây giống ñủ tiêu chuẩn xuất vườn. - Tạo cây giống có kích thước lớn. Cây giống ñược tạo bằng biện pháp giâm, chiết cành hoặc ghép mắt có kích thước lớn hơn nhiều so với phương pháp nhân giống in vitro. Kích thước của cây giống khoảng từ một ñốt ñến nhiều ñốt cây tuỳ thuộc vào ñối tượng cây trồng và nhu cầu của hệ số nhân giống. - Cây giống mang ñặc tính của cây mẹ. Biện pháp giâm chiết cành và ghép mắt cũng như các biện pháp nhân giống vô tính nói chung, cây giống tạo thành từ các cơ quan dinh dưỡng của cây mẹ nên có tuổi sinh học của cây mẹ và mang ñặc tính di truyền của cây mẹ. - Thao tác và trang thiết bị ñơn giản. Kỹ thuật nhân giống vô tính bằng biện pháp giâm, chiết cành hoặc ghép mắt rất dễ dàng áp dụng cho mọi ñối tượng lao ñộng trong nghề làm vườn. Mọi thao tác trong quy trình giâm chiết cành hoặc ghép mắt rất ñơn giản và hoàn toàn không yêu cầu các thiết bị hiện ñại. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….5 4.1. Nhân giống vô tính bằng tách cây Mỗi cây thường chỉ có một gốc và một bộ rễ, tuy nhiên, con người có thể sử dụng các biện pháp kỹ thuật tác ñộng ñể cây phát sinh nhiều gốc, mỗi gốc có bộ rễ riêng biệt, rồi tách riêng từng gốc ñem trồng thành cây mới. Ví dụ biện pháp cưa gốc cho nảy chồi rồi vun ñất vào gốc cho ra rễ, tách ra trồng. Phương pháp này chậm, hiệu quả thấp, tốn công nên ít ñược áp dụng. 4.2. Nhân giống vô tính bằng giâm, chiết cành Phương pháp giâm, chiết cành dựa trên khả năng hình thành rễ bất ñịnh của cành giâm hoặc chiết khi ñược cắt rời khỏi cây mẹ. Phương pháp này thường ñược áp dụng cho cả hai nhóm cây thân gỗ và thân thảo như cây vải, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, dứa, hoa cúc, cẩm chướng.... * Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất ñịnh Khi có tác ñộng vào cây mẹ như cắt cành giâm ra khỏi cơ thể cây mẹ hoặc khoanh vỏ cành chiết thì lúc ñó trong cơ thể cây mẹ sẽ bắt ñầu hoạt hoá sự hình thành rễ bất ñịnh. Yếu tố gây hoạt hoá sự hình rễ bất ñịnh là auxin. Khi có tác ñộng cắt cành hoặc khoanh vỏ thì auxin sẽ ñược hình thành một cách nhanh chóng tại ñỉnh sinh trưởng và các cơ quan non, sau ñó qua hệ thống mạch libe auxin ñược vận chuyển về phần vết cắt của cành chiết, cành giâm ñể kích thích tạo rễ bất ñịnh. Vì vậy, sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm nhanh hay chậm là hoàn toàn phụ thuộc vào khả năng tổng hợp auxin nội sinh của từng loại cây trồng. Người ta có thể xử lý bổ sung auxin ngoại sinh ñể thúc ñẩy nhanh chóng sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm. Sự hình thành rễ bất ñịnh là một quá trình, ñó là quá trình phản phân hoá của tế bào tiền tượng tầng, tiếp ñó là tái phân hoá ñể hình thành mầm rễ (hình 2.1) Quá trình hình thành rễ bất ñịnh chia làm ba giai ñoạn : - Phản phân hoá của tế bào tiền tượng tầng ñể trở lại chức năng phân chia tế bào của mô phân sinh tượng tầng ñể tạo khối tế bào bất ñịnh (callus) - Tái phân hoá tế bào rễ từ các tế bào bất ñịnh ñể hình thành mầm rễ bất ñịnh - Mầm rễ sinh trưởng ñể hình thành rễ bất ñịnh. Thông thường, giai ñoạn ñầu của sự hình thành rễ bất ñịnh cần lượng auxin lớn nhất cho sự phản phân hoá tế bào (10-4 - 10-5 g/cm3), giai ñoạn thứ hai cần lượng auxin thấp hơn cho sự tái phân hoá mầm rễ (10 -7 g/cm3), còn giai ñoạn sinh trưởng rễ lượng auxin cần rất thấp (10-11 - 10-12 g/cm3) hoặc không cần auxin trong giai ñoạn này. a b Hình 2.1: Sự phản phân hoá tế bào tượng tầng ñể hình thành rễ bất ñịnh a, b. Lát cắt dọc và cắt ngang mầm rễ bất ñịnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….6 Trong kỹ thuật giâm, chiết cành, người ta thường xử lý bổ sung các chất thuộc nhóm auxin ngoại sinh ñể kích thích sự tạo rễ bất ñịnh nhanh và hiệu quả hơn như IBA, α-NAA, 2,4D.... Tuỳ theo chất sử dụng và loại cây trồng, cũng như tuỳ theo phương pháp xử lý mà nồng ñộ sử dụng là khác nhau. Có ba phương pháp chính ñể xử lý auxin cho sự ra rễ bất ñịnh: - Phương pháp xử lý nồng ñộ loãng: nồng ñộ xử lý vào khoảng vài chục ppm. Với phương thức giâm cành thì ngâm phần gốc vào dung dịch trong thời gian 12 ñến 24 giờ rồi cắm cành giâm vào giá thể. Với phương thức chiết cành thì trộn dung dịch xử lý với ñất bó bầu trước khi bó bầu xung quanh vết khoanh vỏ. - Phương pháp xử lý nồng ñộ ñặc: nồng ñộ xử lý khoảng vài nghìn ppm. Với phương thức giâm cành thì nhúng rất nhanh phần gốc vào dung dịch trong khoảng 1-2 giây rồi cắm ngay vào giá thể Với phương thức chiết cành thì dùng bông tẩm dung dịch xử lý và chỉ cần bôi lên trên vết khoanh vỏ trên (nơi sẽ xuất hiện rễ) trước khi bó bầu... - Sử dụng dạng bột: có nhiều chế phẩm giâm chiết cành dạng bột, trong thành phần có chứa auxin với một tỷ lệ nhất ñịnh ñược phối trộn với một loại bột nào ñó. Khi giâm cành chỉ cần chấm vết cắt của cành giâm vào chế phẩm bột rồi cắm vào giá thể. a. Nhân giống vô tính bằng chiết cành * Ưu ñiểm : - Cây con dễ sống, sinh trưởng nhanh, mọc khoẻ - Cây con mang ñầy ñủ ñặc tính di truyền của cây mẹ - Cây thấp, tán gọn nên thuận tiện cho chăm sóc và thu hoạch * Nhược ñiểm : - Hệ số nhân giống không cao, chỉ sử dụng trong sản xuất nhỏ - Cây nhanh già cỗi, tuổi thọ vườn cây thấp, khả năng chống chịu với ñiều kiện bất lợi của môi trường không cao - Cây mẹ bị khai thác nhiều sẽ làm giảm tuổi thọ và sức sống * Các hình thức chiết cành + Chiết cành bằng biện pháp uốn vít cành Biện pháp uốn cành thường áp dụng cho ñối tượng cây thân bụi, thân thảo như cây ñỗ quyên, kim ngân, ráy thơm... Cách tiến hành : uốn vít cành xuống rồi phủ ñất lên, sau một thời gian phần ñược phủ ñất sẽ ra rễ (hình 3.1). Ðể kích thích ra rễ nhanh có thể gây vết thương nhẹ lên cành uốn tại phần phủ ñất. Cắt rời từng phần ñã ra rễ ñể tạo cây giống mới. Hình 3.1: Biện pháp uốn vít cành + Chiết cành trên cây Ðây là biện pháp áp dụng phổ biến cho nhóm cây thân gỗ như loại cây ăn quả nhãn, vải hồng xiêm, chanh, roi, cam, quýt, bưởi... ; nhóm cây công nghiệp như chè, cà phê...; nhóm cây rừng như bạch ñàn, quế, hương... cành vẫn ở trên cây từ khi ñược chiết ñến khi ra rễ bất ñịnh tạo cây hoàn chỉnh mới cắt xuống ñem trồng. Theo học thuyết chu kỳ tuổi của Trailakhyan thì mỗi cành ở trên cây có tuổi sinh học khác nhau. Nếu cành có tuổi sinh học trung bình sẽ có khả năng tạo rễ bất ñịnh tốt hơn những cành có tuổi sinh học quá lớn hoặc quá nhỏ. Vì vậy, với mục ñích nhân giống vô tính bằng kỹ thuật chiết cành người ta thường lựa chọn những cành trên cây có tuổi sinh học trung bình hay còn gọi là cành bánh tẻ ñể chiết. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….7 Cách tiến hành: dùng dao sắc cắt hai khoanh vỏ cách nhau khoảng 2-3 cm (hình 4.1. a,b) sau ñó loại bỏ lớp vỏ ngoài, dùng dao sắc cạo sạch lớp vỏ trắng tiếp theo ñến tận phần gỗ (hình 4.1.c). Thường ñể phơi cành khoảng một buổi hoặc một ngày sau mới bó bầu. Ðối với những cây khó ra rễ như cây hồng xiêm, mận, mơ, mít... trước khi bó bầu ta nên xử lý cho vết khoanh vỏ (vết khoanh trên) dung dich auxin (α-NAA) 4000 -8000 ppm hoặc trộn dung dich auxin vào hỗn hợp bó bầu với nồng ñộ thấp hơn (40 - 100 ppm). Nguyên liệu dùng ñể bó bầu thường sử dụng là hỗn hợp giữa ñất vườn hoặc ñất bùn ao Hình 4.1: Cách khoanh vỏ cành chiết phơi khô, ñập nhỏ trộn với một trong số a,b. khoanh vỏ c. Bóc và cạo sạch lớp vỏ nguyên liệu hữu cơ như trấu bổi, mùn cưa, rơm rác mục , rễ bèo tây... với tỷ lệ 2/3 ñất với 1/3 nguyên liệu hữu cơ. Ðảm bảo 70% ñộ ẩm của hỗn hợp bó bầu. Giây buộc Phía ngoài của bầu chiết bọc bằng giấy PE trong. Buộc chặt hai ñầu bầu chiết vào cành ñể Hỗn hợp bó bầu không bị xoay xung quanh cành chiết bầu chiết Bọc giấy (hình 5.1). PE trong Hình 5.1: Cách bó bầu cành chiết a b Hình 6.1: Sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết ñủ tiêu chuẩn cắt a. Ra rễ bất ñịnh b. Cắt cành chiết Sau ñó theo dõi qua lớp PE khi thấy rễ ñã mọc ra phía ngoài bầu và chuyển màu trắng nõn sang màu trắng ngà hoặc hơi ngả màu xanh thì có thể cưa cành chiết ñể trồng vào vườn ươm (hình 6.1. a,b) b. Nhân giống vô tính bằng giâm cành * Ưu ñiểm : - Cây con giữ ñựơc các tình trạng di truyền của cây mẹ, vườn cây ñồng ñều thuận tiện chăm sóc, thu hoạch - Thời gian nhân giống tương ñối nhanh, hệ số nhân giống cao - Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu quả kinh tế cao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….8 * Nhược ñiểm : - Tuổi thọ vườn cây thấp, chu kỳ kinh doanh ngắn - Ðòi hỏi người sản xuất có trình ñộ kỹ thuật nhất ñịnh - Tốn nhiều công chăm sóc * Các hình thức giâm cành Tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và mục ñích nhân giống mà người ta áp dụng các hình thức giâm cành khác nhau. Sau ñây là một số biện pháp giâm cành phổ biến cho các ñối tượng cây trồng : + Giâm cành bằng biện pháp cắt cành hoặc cắt thân. Ðây là biện pháp áp dụng phổ biến cho nhiều ñối tượng cây trồng, các loại cây thân gỗ như cây nhãn, vải, cam, chanh, bưởi, cà phê, chè... ; các loại cây rau, cây hoa thân thảo như khoai tây, hoa cúc.... Một số cây có thể thực hiện nhân giống bằng phương pháp cắt cành hoặc cắt thân quanh năm. Trong khi ñó một số cây ñặc biệt là một số cây thân gỗ chỉ có thể thực hiện vào mùa rụng lá khi mà cây ñang ở trạng thái ngủ nghỉ. Cách tiến hành : dùng dao sắc cắt vát ở vị trí phía dưới của ñốt cành hoặc ñốt thân với kích thước tuỳ thuộc vào từng ñối tượng cây trồng và mục ñích nhân giống. Có thể cắt từng ñốt ñơn hoặc ñốt kép (ñối với cây có lá ñối xứng) (hình 7.1. a,b,c,d). Loại bỏ bớt một phần của lá nếu lá quá to. Nhúng nhanh auxin (α-NAA vài nghìn ppm) vào vết cắt nếu cần thiết, sau ñó cắm vào giá thể giâm cành với chiều sâu khoảng 1cm hoặc ñặt nằm ngang lấp 1/2 thân vào giá thể (ñối với cây mía, ñay, mây...). Ðảm bảo ñộ ẩm thích hợp của giá thể và ñộ ẩm bão hoà trên bề mặt lá ñến khi xuất hiện rễ bất ñịnh của cành giâm. Chăm sóc cẩn thận ñến khi xuất vườn. (a) (b) (c) (d) Hình 7.1: Giâm cành bằng các biện pháp cắt cành, cắt thân a. Cắt cành ; b. Cắt thân nằm ngang ; c. Cắt ñốt ñơn ; d. Cắt ñốt kép Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….9 Hình 8.1: Giâm cành bằng biện pháp cắt lá a. Giâm lá nguyên vẹn b. Giâm mẩu lá + Giâm cành bằng biện pháp cắt lá Biện pháp này ñược áp dụng ñối với các loại cây cảnh, cây trồng chậu trong nhà, ñặc biệt thường sử dụng ñối với cây lá bỏng. Có hai loại kiểu cắt lá : cắt toàn bộ lá và cắt mẩu lá (hình 8.1. a,b) . Khi lá ñược cắt rời khỏi cây mẹ thì rễ bất ñịnh sẽ ñược hình thành tại phần cuống lá hoặc trực tiếp trên lá. Cách tiến hành : Biện pháp này mọi thao tác và quy trình tiến hành cũng tương tự như biện pháp cắt cành ñã nêu ở trên nhưng chỉ dùng phần lá cây ñể giâm. Dùng dao sắc cắt một mẩu lá cây hoặc cả lá cây gồm cả phần cuống hoặc không có cuống tuỳ theo từng loại cây, sau ñó xử lý auxin vào vết cắt nếu cần thiết. Ðặt mẩu lá hoặc cắm phần cuống lá vào giá thể. Sau một thời gian trên lá hoặc tại phần cuống sẽ hình thành rễ bất ñịnh. Nếu phần cuống lá có cả mắt ngủ thì mắt ngủ sẽ bật chồi hình thành cây hoặc cũng có thể tự trên phần lá hình thành chồi mới ñể thành cây mà không cần có mắt ngủ. Trong kỹ thuật giâm cành cần chú ý : - Giá thể là cát ẩm dùng ñể giâm cành là tốt nhất, có nhiều loại cát như cát thô, cát mịn, cát ñen, cát vàng...tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng mà sử dụng loại cát nào cho thích hợp. Cát có ñặc tính trơ, thoát nước và xốp sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự ra rễ. Cát dùng làm giá thể phải sạch ñể tránh nấm, khuẩn hoặc các tạp chất làm chết cành giâm. Thường sử dụng loại cát mới khai thác hoặc cát cũ thì phải ñược rửa sạch bằng cách ngâm cát trong HCl hoặc thuốc tím trong vài giờ sau ñó rửa nhiều lần dưới vòi nước - Cành mới giâm vẫn xảy ra quá trình thoát hơi nước trên bề mặt lá nhưng cành giâm chưa có rễ ñể hút nước dẫn ñến mất cân bằng nước, cành giâm bị héo và chết. Vì vậy, cần phải thường xuyên phun ẩm ñảm bảo ñộ ẩm bão hoà trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nước cho ñến khi cành giâm xuất hiện rễ bất ñịnh 4.3. Nhân giống vô tính bằng phương pháp ghép Ghép là phương pháp ñược thực hiện bằng cách lấy một bộ phận của những cây giống tốt, ñang sinh trưởng như ñoạn cành, ñoạn rễ, mầm ngủ... lắp ñặt vào vị trí thích hợp trên cây khác gọi là gốc ghép ñể tạo thành một tổ hợp ghép, cùng sinh trưởng phát triển và tạo nên một cây mới hoàn chỉnh. a. Cơ sở khoa học của phương pháp ghép Phương pháp ghép dựa vào ñặc tính tái sinh liền vết thương của cây. Tế bào tại phần bị thương trên cây có khả năng tái phân chia liên tục thành một ñám tế bào ñể liền vết thương và tiếp nhận phần ñược ghép vào cây. Khi ghép cần áp sát phần mô phân sinh tượng tầng của phần ghép với gốc ghép, tại ñó mô phân sinh của gốc ghép hoạt ñộng mạnh làm lấp ñầy chỗ trống giữa hai vết cắt, các tổ chức mô tế bào của phần ghép và gốc ghép dần dần hoà hợp, gắn với nhau. Hệ thống mạch Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….10 floem và xylem dần ñược liên kết lại với nhau và thông suốt. Lúc này, chồi ghép ñược cung cấp chất dinh dưỡng và nước nên bắt ñầu sinh trưởng, gốc ghép và chồi ghép trở thành một cơ thể mới. Cây nhân giống bằng phương pháp ghép vẫn hoàn toàn giữ ñược những tính trạng như cây mẹ. b. Mục ñích và các ưu nhựơc ñiểm của phương pháp ghép *Mục ñích - Nhân giống vô tính cây trồng trong trường hợp các phương pháp nhân giống khác khó thực hiện hoặc kém hiệu quả. - Thay ñổi một phần hoặc một bộ phận của cây này bằng một phần hoặc bộ phận của cây giống khác. - Tận dụng những ưu ñiểm của gốc ghép cho các cây trồng cần nhân giống - Cải tạo những phần bị hại (gãy, sâu bệnh) của cây - Sử dụng phương pháp ghép ñể test cây chống chịu bệnh * Ưu ñiểm : - Giữ ñược hầu hết các tính trạng của cây mẹ - Hệ số nhân giống cao, cây ghép có tuổi thọ cao - Có khả năng thay ñổi giống khi cần mà không phải trồng mới (giống cũ, năng suất thấp, sâu bệnh...) hoặc cứu chữa các bộ phận hỏng (bị hại ở gốc, rễ dẫn tới chết toàn cây thì ghép ñể thay rễ) - Khai thác các ưu ñiểm của cây làm gốc ghép như : khả năng sinh trưởng, khả năng chống chịu sâu bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn, úng, lạnh...) - Sử dụng trong công tác lai giống * Nhược ñiểm : - Cây sử dụng làm gốc ghép thường trồng bằng hạt nên sinh trưởng không ñồng ñều khó chăm sóc -Cần ñội ngũ kỹ thuật có trình ñộ am hiểu về kỹ thuật ghép, giống cây trồng - Cần ñầu tư nhiều công sức ñể chọn tổ hợp ghép thích hợp tuỳ theo từng loại cây trồng và từng vùng nhất ñịnh c. Phương pháp ghép mắt Trong kỹ thuật ghép, có một số hình thức ghép khác nhau như ghép áp, ghép cành, ghép mắt. Tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và mục ñích ghép ñể lựa chọn hình thức ghép thích hợp. Với mục ñích nhân giống vô tính cây trồng thường sử dụng hình thức ghép mắt. Ghép mắt có nhiều kiểu ñược gọi theo vết rạch phần gốc ghép : ghép nêm, ghép chữ T, U, H, I, ... * Ưu ñiểm của phương pháp : ghép mắt là hình thức ghép rất phổ biến, áp dụng ñược cho nhiều loại giống cây trồng khác nhau. Thao tác ñơn giản, thuận tiện. Hệ số nhân giống cao. Dễ dàng bảo quản và vận chuyển vật liệu ghép. * Cách tiến hành : - Lấy mắt ghép : chọn mắt ghép trên cành "bánh tẻ", không bị sâu bệnh (hình 9.1). Tách mắt ghép theo kiểu bóc vỏ (cành táo...), hoặc cắt vát phần mắt (cành chanh, bưởi, cam...) (hình 10.1 a,b,c,d) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….11 Hình 9.1: Chọn a b mắt ghép trên cành Hình 10.1 a,b : Tách mắt ghép trên "bánh tẻ cây thân gỗ c d Hình 10.1 c,d : Tách mắt ghép trên cây họ cam chanh Hình 11.1: Buộc chặt mắt ghép vào a b gốc ghép Hình 12.1. a,b: Mắt ghép sau khi tháo dây buộc (a) và nảy chồi (b) - Chuẩn bị gốc ghép : dùng dao sắc mở "cửa sổ" phần vỏ của thân cây. Bóc miếng vỏ trên vết khía. Tiến hành ñặt mắt ghép vào phía trong "của sổ" và ñậy cửa sổ bằng lớp vỏ mới tách, cuốn chặt phần ghép bằng dây nilon mỏng (tránh ñể nước mưa gấm vào bên trong) (hình 11.1). Sau khoảng 15-20 ngày có thể mở dây buộc và cắt miếng vỏ ñậy phía ngoài miếng ghép (hình 12.1 a,b). Ðể kích thích mắt ngủ mọc mầm nhanh, sau khi mở dây buộc khoảng 7 ngày tiến hành cắt ngọn gốc ghép. Thường cắt ngọn gốc ghép cách mắt ghép khoảng 2-3 cm, nên cắt nghiêng khoảng 45o về phía ngược chiều với mắt ghép ñể tránh nước nhỏ vào mắt ghép. Phương pháp ghép "cửa sổ" có tỷ lệ sống cao khoảng từ 70100% tuỳ theo từng loại cây. 5. Nhân giống vô tính in vitro (Micro propagation) Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micro propagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ðây là phương pháp nhân giống hiện ñại ñược thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm. Khác với các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn, có thể tạo ra một số lượng cây giống lớn ñồng ñều ñể phủ kín một diện tích ñất nhất ñịnh mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế ñược. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào ñiều kiện thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm. Ðây là một hướng ñang ñược ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất cây giống hàng nam ñã cung cấp một lượng ñáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp. 5.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tính in vitro Kỹ thuật nuôi cây mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro nói riêng ñều dựa vào cơ sở khoa học là có tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá. a. Tính toàn năng của tế bào Haberland (1902) lần ñầu tiên ñã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật ña bào ñều có khả năng tiềm tàng ñể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan ñiểm của sinh học hiện ñại thì mỗi một tế bào ñã chuyên hoá ñều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương ñương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….12 trưởng thành. Vì vậy, trong ñiều kiện nhất ñịnh một tế bào bất kỳ ñều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ðặc tính ñó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Như vậy, bất cứ một tế bào nào cũng có thể hình thành một cây hoàn chỉnh. ðó cũng là cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (in vitro) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính (clone-nhân bản) nói riêng. Qua ñó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi ñược nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có ñầy ñủ các ñiều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân Hình 13.1: Sử dụng nuôi cấy các loại mô bất kỳ trên cây hóa, phản phân hoá (hình 13.1) b. Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào + Tính phân hoá của tế bào là sự biến ñổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá ñảm nhiệm các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau ñảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết....) nhưng chúng ñều có cùng nguồn gốc từ tế bào phôi sinh ñã trải qua giai ñoạn phân hoá tế bào ñể hình thành các mô riêng biệt. +Tính phản phân hoá của tế bào : ñó là các tế bào khi ñã ñược phân hoá thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong ñiều kiện nhất ñịnh chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh ñể phân chia tế bào. Ðó là tính phản phân hoá của tế bào. Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng của cây như lá, thân..., thì giai ñoạn tạo mô sẹo (callus), ñây chính là những tế bào ñã quay trờ về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân ...trước ñó. Sự phân hóa và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào ñã chuyên hoá ñược biểu diễn theo sơ ñồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hóa Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá gen. Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể thì một số gen ñược hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế. Ðiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi ñược tách rời và trong những ñiều kiện nhất ñịnh thì các gen ñược hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen ñể hình thành một cá thể mới. Ðó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 5.2. Mục ñích của phương pháp nhân giống vô tính in vitro Trong lĩnh vực nhân giống vô tính in vitro thì kỹ thuật nhân nhanh giống cây trồng phục vụ những mục ñích sau : Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….13 - Nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác tạo giống - Nhân nhanh và duy trì các cá thể ñầu dòng tốt ñể cung cấp cây giống của các các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực, cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu, cây lâm nghiệp... - Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virút. - Bảo quản các tập ñoàn gen, ñặc biệt ñối với loại cây dễ bị nhiễm bệnh trong ñiều kiện tự nhiên (khoai tây, khoai lang,) hoặc các cây dễ bị giao phấn. 5.3. Ưu, nhược ñiểm của phương pháp nhân giống vô tính in vitro Phương pháp nhân giống vô tính in vitro ñã ñược E.F. Gerge (1993) nêu lên một số ưu, nhược ñiểm chính sau ñây: a. Những ưu ñiểm - Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành ñược số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây với kích thước nhỏ khoảng 0,1- 10 mm. Trong khi ñó phương pháp nhân giống truyền thống (giâm chiết cành) thì ñể tạo thành một cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20 cm - Hoàn toàn tiến hành trong ñiều kiện vô trùng nên cây giống tạo ñược sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài. - Sử dụng vật liệu sạch virút và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây sạch virút. - Hoàn toàn chủ ñộng ñiều chỉnh các tác nhân ñiều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt ñộ, chất ñiều tiết sinh trưởng....theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên có khả năng sản xuất số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng từ 36 ñến 1012 / năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn - Có thể tiến hành quanh năm mà không bị chi phối bởi ñiều kiện ngoại cảnh của thời vụ. - Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản ñược trong thời gian dài trong ñiều kiện in vitro b. Những nhược ñiểm - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ và ñôi khi xuất hiện các dạng cây không mong muốn (biến dị, mọng nước). - Cây giống in vitro do ñược cung cấp nguồn hydrat carbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các vật liệu hữu cơ (tự dưỡng) của cây kém. Ðồng thời, cây giống in vitro ñược nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên ñộ ẩm không khí thường bão hoà. Do ñó, khi trồng cây ra ngoài ñiều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng cây bị héo và chết. Vì vậy, trước khi chuyển cây từ ñiều kiện in vitro ra ñiều kiện in vivo, cây cần trải qua giai ñoạn "huấn luyện " ñể quen dần với ñiều kiện môi trường bên ngoài có ñộ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh. - Cần trang thiết bị hiện ñại, kỹ thuật viên có tay nghề cao. 5.4. Ðiều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro * Ðiều kiện trước tiên là vô trùng. Tất cả các khâu nuôi cấy ñều ñược thanh trùng: dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) và các thao tác nuôi cấy... Sự thành công hay thất bại của công việc nuôi cấy mô là phụ thuộc vào việc vô trùng. Nếu có một khâu nào ñó không vô trùng thì mẫu nuôi cấy lập tức bị nhiễm vi sinh vật hoặc nấm và sẽ chết. Khử trùng ñược thực hiện bằng các phương tiện sau: - Nồi hấp : khử trùng bằng hơi nước có nhiệt ñộ và áp suất cao. Thường áp dụng tiệt trùng cho môi trường nuôi cấy, dụng cụ cấy (chai, lọ, panh, dao, kéo, bông...) Với áp suất 1 atm tương ñương với 121oC trong khoảng thời gian từ 20 phút ñến 30 phút là ñảm bảo khử trùng tốt. - Tủ sấy: khử trùng bằng nhiệt ñộ cao nên chỉ áp dụng khử trùng cho các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy mẫu bằng kim loại. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….14 - Phễu lọc vô trùng (Microspore): khử trùng qua phễu lọc có màng lọc kích thước nhỏ (0,2 µm), chỉ áp dụng ñối với dung dịch trong ñiều kiện nhiệt ñộ và áp suất cao sẽ bị phân huỷ như vitamin B2, gibberellin... - Hoá chất khử trùng: áp dụng ñể khử trùng bề mặt mẫu cấy hoặc ñốt dụng cụ, thường dùng: Ca-hypocloride, Na-hypocloride, clorua thuỷ ngân (HgCl2), nước brôm, oxy già (H2O2), cồn * Phòng nuôi cấy mô là phòng thí nghiệm chuyên hoá cao với các thiết bị chuyên dụng. Bao gồm một phòng chuẩn bị mẫu, phòng cấy mẫu, phòng nuôi cây và nhà lưới ñể ñưa cây ra ñất. Tuỳ theo quy mô và mục ñích mà diện tích các bộ phận khác nhau. Các thiết bị quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm có nồi hấp ñể vô trùng dụng cụ và mẫu nuôi cấy, máy cấy vô trùng ñể thao tác cấy mẫu, phòng nuôi có ñủ ánh sáng nhân tạo và ñiều hoà nhiệt ñộ... ñể nuôi cây... Hình 14.1 ñến hình 17.1. Trang thiết bị và phòng nuôi cấy mô tại Bộ môn Sinh lý thực vật - khoa Nông học- ðHNNI . a . Tủ sấy (khử trùng khô) b. Nồi hấp (khử trùng ướt) c. Cân phân tích , cân kỹ thuật d. Máy ño pH Hình 14.1 (a,b,c,d): Các thiết bị trong phòng chuẩn bị môi trường Hình 15.1: Tủ cấy mẫu vô trùng (a.Tủ cấy ñơn ; b.Tủ cấy ñôi) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….15 Hình 16.1: Buồng nuôi cấy Hình 17.1: Vườn ươm cây - Môi trường nuôi cấy là giá thể có ñầy ñủ chất dinh dưỡng, các hoạt chất như các nguyên tố vi lượng, vitamin, chất ñiều hoà sinh trưởng. Tuỳ theo từng loại cây và cơ quan nuôi cấy mà người ta ñã có các môi trường riêng cho chúng. Ví dụ: Môi trường cơ bản nhất là môi trường MS (Murashige Skoog) cho nhiều ñối tượng cây trồng, môi trường Adnerson cho cây thân gỗ, môi trường Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần, môi trường CHU cho nuôi cấy bao phấn... 5.5. Thành phần môi trường dinh dưỡng Năm 1898, Haberland ñề xướng ra tính toàn năng của tế bào và ông tiến hành những thí nghiệm ñầu tiên về nuôi cấy mô nhưng các thí nghiệm ñều không thành công. Khi ñó do những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất hạn chế, ñặc biệt là vai trò của các chất ñiều tiết sinh trưởng hầu như chưa ñược khám phá. Ðến nay ñã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo ñã ñược xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường ñều bao gồm những nhóm chất chính sau ñây: + Các loại muối khoáng + Nguồn carbon hữu cơ + Vitamin + Chất ñiều tiết sinh trưởng + Nhóm chất tự nhiên + Chất làm ñông môi trường a. Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật ñược phân chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng : nhóm nguyên tố ña lượng và nhóm nguyên tố vi lượng. * Các nguyên tố khoáng ña lượng Bao gồm các nguyên tố khoáng có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường với nồng ñộ trên 30 ppm (part per million) . Gồm những nguyên tố : N, P, K, S, Mg, Ca - Nitơ (N) : ñược sử dụng ở dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp cả hai loại - Lưu huỳnh (S): thường sử dụng dạng SO42- . các loại SO3 hoặc SO2 thường kém tác dụng, thậm trí còn ñộc. - Phospho (P) : mô và tế bào nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao. Phospho là một trong thành phần cấu trúc phân tử axit nucleic và phân tử năng lượng ATP. Ngoài ra phospho ở dạng H2PO4 và HPO4 còn có tác dụng như hệ thống ñệm (buffer) làm ổn ñịnh pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy. - Kali và can xi (K và Ca): ở dạng ion K+ , Ca2+ tế bào và mô dễ dàng hấp thu và ñồng hoá * Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm các nguyên tố có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy với nồng ñộ thấp hơn 30 ppm. Ðó là các nguyên tố : Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….16 - Sắt (Fe) : sắt thường tạo phức với các thành phần khác làm mất khả năng giải phóng ion sắt cho nhu cầu của cây. Vì vậy, thường sử dụng sắt ở dạng phức chelat với citrat hoặc với EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid). Từ phức sắt này ion Fe ñược giải phóng trong phạm vi pH khá rộng. Sắt quyết ñịnh khả năng phân chia của tế bào. Thí nghiệm với sắt ñánh dấu bằng ñồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy sắt ñược dự trữ trong nhân tế bào rất nhiều. Thiếu sắt sẽ làm giảm lượng ARN và giảm khả năng sinh tổng hợp protein, nhưng làm tăng lượng AND. - Bo (B) : ñóng vai trò quan trọng trong sự hình thành nên thành tế bào và màng tế bào thực vật. Nếu thiếu Bo sẽ ức chế sự phát sinh rễ thứ cấp và ức chế sinh trưởng chiều dài của rễ. Bởi vì, khi thiếu Bo sẽ kích thích hoạt tính của enzym IAA oxidaza nên hàm lượng của IAA bị giảm. Thiếu Bo thì mô nuôi cấy sẽ chuyển hoá thành mô sẹo, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, khả năng tái sinh chồi kém. - Ðồng (Cu): cây hấp thu dạng ion Cu2+. Khoảng 50% Cu2+ có mặt trong lục lạp. Ðồng là thành phần của một số enzyme, là thành viên của chuỗi vận chuyển ñiện tử của hệ thống quang hoá I và II trong quang hợp. Vì vậy, thiếu ñồng sẽ làm giảm nhanh chóng hoạt ñộng quang hợp. - Mangan (Mn) : thiếu Mn làm cho hàm lượng các amino axit tự do và ADN tăng lên, nhưng lượng ARN và khả năng sinh tổng hợp protein bị giảm dẫn ñến khả năng phân bào kém. Mangane xúc tác cho phản ứng quang phân ly nước trong quang hợp. - Molypden (Mo) : là ion ñóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat reductaza, vì vậy, Mo ñóng vai trò quan trọng trong quá trình trao ñổi ñạm trong tế bào. - Kẽm (Zn) : là ion tham gia vào en zyme tổng hợp ARN, trong ARN-polimeraza chứa hai ion Zn. Nồng ñộ Zn thấp sẽ làm tăng hoạt ñộng của en zyme phân giải ARN (RNAse). Xúc tác cho phản ứng tổng hợp IAA. - Coban (Co): có vai trò quan trọng trong quá trình có ñịnh nitơ, tổng hợp ARN và methionine. b. Nguồn carbon hữu cơ: mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào khả năng quang hợp trong ñiều kiện ánh sáng nhân tạo, nhưng rất yếu nên không ñủ nguồn carbon hữu cơ cho sự sinh trưởng phát triển của cây. Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần ñược bổ sung nguồn carbon hữu cơ và thường dùng saccaroza với liều lượng 2-3%. Trong một số trường hợp ñặc biệt như nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần...có thể dùng glucoza, maltoza, galactoza... c. Vitamin Mặc dù mô và tế bào nuôi cấy in vitro ñều có khả năng tự tổng hợp ñược các loại vitamin cần thiết, nhưng thường không ñủ về lượng, do ñó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, ñặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng ñộ khoảng 1 ppm. + Vitamin B1 (Thiamin. HCl) : khi khử trùng môi trường bằng nồi hấp ở nhiệt ñộ và áp suất cao thì bị phân tách thành pyrimidin và thiazol nhưng sau ñó tế bào lại có khả năng tổng hợp chúng lại thành vitamin B1. + Vitamin B2 (Riboflavin): có thể khử trùng bằng nhiệt nhưng lại dễ bị ánh sáng làm phân giải. Ðối với nuôi cấy ngoài sáng thì chỉ dùng nồng ñộ 0,01 ppm. nhưng ñối với nuôi cấy trong tối có thể tăng lên 10-15 ppm. + Vitamin B6 (Pyridoxin): là tiền thân của pyridoxalphosphat - cofactor của các nhóm enzym như carboxylaza và transaminaza. Khi hấp ở nhiệt ñộ cao xảy ra phản ứng : pyridoxin + phosphat ----> pyridoxalphosphat + Mio Inositol : có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc ñẩy sự hình thành thành tế bào (sinh tổng hợp polygalacturonic axit và pectin). Thường sử dụng ở nồng ñộ cao 50-100 ppm. Trong nước dừa cũng có inositol. + Pantotenic axit : là thành phần của coenzym A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….17 d. Nhóm chất tự nhiên Các nhà sáng lập ngành nuôi cấy mô trước ñây thường sử dụng môi trường dinh dưỡng rất ñơn giản chỉ bào gồm muối khoáng và ñường. Ngày nay người ta ñã khẳng ñịnh rằng loại môi trường ñơn giản như vậy chưa ñủ cho tế bào sinh trưởng tốt. Vì vậy, thành phần môi trường ngày càng phong phú, ñầy ñủ và phức tạp hơn. Người ta ñã bổ sung vào môi trường một số nhóm chất tự nhiên nhằm làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và cũng có cả các chất có hoạt tính sinh lý nên kích thích sự sinh trưởng phát triển của cây in vitro. Thường bao gồm : + Nước dừa: theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và ctv (1961) cho thấy trong nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào như : Axit amin, axit béo, axit hữu cơ, ñường, ARN, ADN, myo inositol, các chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin + Dịch chiết nấm men: White (1934) lần ñầu tiên ñã nuôi cấy thành công rễ cây cà chua trong môi trường có dịch chiết nấm men. Thành phần của dịch chiết nấm men gồm có : ñường, nucleic axit, amino axit, vitamin, axin, khoáng. Tác dụng của dịch chiết nấm men cho sự sinh trưởng của rễ rất tốt nhưng với mô sẹo thì không tốt. + Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha) : chứa chủ yếu một số ñường, vitamin và một số chất có hoạt tính ñiều tiết sinh trưởng. + Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt...) thành phần có ñường, axitnucleic, axit amin, vitamin, khoáng... e. Chất làm ñông môi trường (Agar) Agar - là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng- Rodophyta). Agar khi ngâm nước ở 80oC sẽ chuyển sang dạng sol và 40oC thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao (6-12 g/ 1lit nước). Tuy ở trạng thái gel nhưng agar vẫn ñảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng. Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây tronng nuôi cấy mô. g. Chất ñiều tiết sinh trưởng Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết ñịnh ñến kết quả của nuôi cấy in vitro ñó là các chất ñiều tiết sinh trưởng. Nhóm các nhà khoa học ở Netherandl do giáo sư F.T.M. Kors chủ biên trong cuốn "Catalo 20002001" ñã tóm tắt vai trò của các chất ñiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô theo bảng dưới ñây: CHẤT ÐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VAI TRÒ TRONG NUÔI CẤY MÔ NHÓM AUXIN Indol-3acetic axit (IAA) - Phát sinh rễ bất ñịnh (ở nồng ñộ cao) Indol-3butyric axit (IBA) -Phát sinh chồi bất ñịnh (ở nồng ñộ thấp) Naphthaleneacetic axit (NAA) - Tạo phôi vô tính(2,4D) Phenylacetic axit (PAA) - Phân chia tế bào 2,4 dichlorophenoxyacetic axit (2,4D) - Phát sinh và sinh trưởng callus 2,4,5 trichlorophenoxyacetic axit (2,4,5T - ức chế bật chồi bên P-chlorophe noxyacetic axit (CPA) - Ức chế sinh trưởng của rễ CYTOKININ Zeatin (Z) -Phát sinh chồi bất ñịnh (ở nồng ñộ cao) Zeatinriboside (ZR) - ức chế sự phát sinh rễ Isopentenyladenin (iP) - Thúc ñẩy sự phân chia tế bào Isopentenyladenosin (iPA) - Kích thích sự bật chồi bên 6- benzylaminoburin (BAP) - Ức chế sự kéo dài của chồi Kinetin - Ức chế sự hoá già Thidiazuron (TDZ) N(2-chloro-4pyridil)N'phenylurea (CPPU) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….18 Gibberellic Axit (GA3) Gibberellin 1 (GA1) Gibberellin 4 (GA4) Gibberellin 7 (GA7) GIBBERELLIN - Vươn dài chồi, phá ngủ của hạt, củ - Phá ngủ của hạt, phôi vô tính, chồi bên - ức chế phát sinh rễ bất ñịnh - Kích thích sự hình thành chất ức chế của quá trình trình tạo rễ, ra củ, rẻ hành ABSCISIC AXIT - Làm chín phôi vô tính - Kích thích phát sinh chồi, củ - Ðiều khiển sự ngủ nghỉ ETHYLEN - Hoá già lá - Làm chín quả POLYAMIN - Thúc ñẩy sự phát sinh rễ bất ñịnh - Thúc ñẩy sự phát sinh chồi - Thúc ñẩy sự hình thành phôi vôi tính JASMONIC AXIT - Thúc ñẩy sự phát sinh củ, dẻ hành - Làm tăng sự hình thành meristem h. ðộ pH của môi trường. pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho ña số các loại cây trồng dao ñộng từ 5,5 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không ñông sau khi hấp khử trùng. Khi pH <4 hoặc pH >7 thì sẽ làm kết tủ một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây. 5.6. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro Có hai hình thức nhân giống vô tính in vitro : + Nhân giống vô tính bằng cách tạo cây từ chồi nách, chồi ñỉnh hoặc mô phân sinh. Tuỳ theo từng mục ñích mà chúng ta sử dụng nguồn ñể nuôi cấy là chồi nách, chồi ñỉnh hoặc mô phân sinh. Hình 18.1. Nuôi cấy chồi nách, chồi ñỉnh Hình 19.1: Mô phân sinh ñỉnh (meristem) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….19