Tài liệu Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α amylase tái tổ hợp trong bacillus subtilis

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ ĐÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG BACILLUS SUBTILIS Hà Nội, 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ ĐÀ SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Đình Mấn Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2017 i Lời cảm ơn Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Trần Đình Mấn, Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Kim Thoa cùng toàn thể các anh chị và các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ vật liệu sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện công nghệ sinh học, các anh chị phòng Vi sinh vật đất, phòng Công nghệ lên men, Trung tâm bảo tàng giống, phòng Vi sinh phân tử và ThS. Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ, hợp tác và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Đây là công trình đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của đề tài “Nghiên cứu sản xuất enzyme -amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp dệt” thuộc Đề án Phát triển và Ứng dụng CNSH trong công nghiệp chế biến, Mã số: CNSHCB/2010-5 và đề tài cán bộ trẻ của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam:“Nghiên cứu ảnh hưởng của trình tự peptide tín hiệu lên khả năng tiết  amylaza ngoại bào ở Bacillus”. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn bên tôi, quan tâm, động viên, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành nhiệm vụ đƣợc giao. Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2018 NCS. Nguyễn Thị Đà ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2018 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Đà iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. vii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... ix DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... xi MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3 1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT ................................. 3 1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes .......................................................... 3 1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli ............................................................................ 3 1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus ................................................................... 4 1.1.4. Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P..................................................... 16 1.2. HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT .............................. 18 1.2.1. Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme ................................. 18 1.2.2. Hệ thống biểu hiện ở Bacillus ........................................................................... 20 1.2.3. Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis ........................................................... 20 1.2.4. Hệ biểu hiện ở E. coli và vi sinh vật khác......................................................... 21 1.3. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis ......... 22 1.3.1. Lựa chọn promoter ............................................................................................ 23 1.3.2. Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis ............................................................ 24 1.3.3. Chọn trình tự peptide tín hiệu. .......................................................................... 25 1.3.4. Đột biến peptide tín hiệu ................................................................................... 25 1.3.5. Sử dụng chủng chủ đã đƣợc cải biến di truyền ................................................. 28 1.4. α - AMYLASE ..................................................................................................... 29 1.4.1. Cấu trúc của α – amylase .................................................................................. 29 1.4.2. α-Amylase từ Bacillus ....................................................................................... 30 1.4.3. α-Amylase từ các vi sinh vật khác .................................................................... 32 1.4.4. α-Amylase tái tổ hợp trong vi sinh vật .............................................................. 35 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 38 iv 2.1. CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID ............................................................. 38 2.1.1. Các chủng dại .................................................................................................... 38 2.1.2. Chủng chủ dùng trong nghiên cứu .................................................................... 38 2.1.3. Plasmid .............................................................................................................. 39 2.2. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG ................................. 40 2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy.......................................................................................... 40 2.2.2. Chất bổ sung ...................................................................................................... 40 2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ................................................................................. 41 2.3.1. Thiết bị .............................................................................................................. 41 2.3.2. Hóa chất và Kit.................................................................................................. 41 2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 42 2.4.1. Phân lập chủng .................................................................................................. 42 2.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính α – amylase ................................................... 42 2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo Lowry ........................ 43 2.4.4. Phƣơng pháp thu amylase trong tế bào ............................................................. 43 2.4.5. Phƣơng pháp phân loại chủng chọn lọc ............................................................ 44 2.4.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA ........................................................................... 44 2.4.7. Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ ............................................................. 46 2.4.8. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 46 2.4.9. Cắt enzyme giới hạn và ligation DNA .............................................................. 49 2.4.10. Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation) ................................... 50 2.4.11. Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu..................................................... 50 2.4.12. Phƣơng pháp megaprimer ............................................................................... 50 2.4.13. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose ................................................... 52 2.4.14. Phƣơng pháp điện di DNA .............................................................................. 52 2.4.15. Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp .................... 53 2.4.16. Điện di SDS – PAGE ...................................................................................... 54 2.4.17. Xác định hoạt tính α – amylase trên gel polyacrylamid ................................. 55 2.4.18. Xử lý số liệu .................................................................................................... 55 v CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................... 56 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƢỜNG ..................... 56 3.1.1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các chủng Bacillus có hoạt tính amylase ........ 56 3.1.2. Sàng lọc bộ chủng phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính amylase cao ........................................................................................................ 57 3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng ................................................. 59 3.2. PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN HIỆU CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC .................. 62 3.3. SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE ... 67 3.3.1. Tách các peptide tín hiệu và tạo tổ hợp với gen đích........................................ 70 3.3.2. Tạo vector mang tổ hợp gen đích ...................................................................... 72 3.3.3. Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ B. subtilis 168M................................................................................................................... 75 3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT BIẾN ĐƢỢC THIẾT KẾ ................................................................................... 83 3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA CHỦNG TÁI TỔ HỢP ....................................................................................... 91 3.5.1. Xác định động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng 168MpHVC1 ...................................................................................................... 91 3.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 ..................................................................................... 92 3.5.3. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng 168MpHVC1 ...................................................................................................... 93 3.5.4. Ảnh hƣởng của nguồn N, C lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 ........................................................................................... 95 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ........................................................... 97 vi 4.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN ............................................................................ 97 4.1.1. Phân lập và thu các chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase ...................... 97 4.1.2. Protein ngoại bào và hoạt tính α – amylase của các chủng tuyển chọn ............ 98 4.1.3. Tách dòng các peptide tín hiệu ở Bacillus và đánh giá vai trò của các axit amin trong trình tự này với quá trình tiết protein ............................................. 101 4.2. KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC NHAU............................................................................................................... 105 4.3. SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN TRONG B. subtilis 168M ............................................................ 107 4.4. NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH CỦA CHÚNG .................................................................................................. 113 4.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME.................. 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 123 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN LUẬN ÁN ................................................................................................................ 125 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ....................................................... 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 132 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BLAST Basic local alignment search tool Bp Base pair – cặp bazơ BSA Bovine serum albumin CM Cell membrane Cs Cộng sự CTAB hexadecyltrimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid DTT Dithiothreitol ER Mạng lƣới nội chất/ endoplasmic reticulum G- Vi khuẩn Gram âm G+ Vi khuẩn Gram dƣơng GRAS Generally recognized as safe – đƣợc coi là an toàn HAc Axit axetic Kb kilobase mg Milligram mg/ml Milligram/millilitre mM Milli (10-3) Molar NCBI National Centre for Biotechnology Information PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride rDNA Ribosomal deoxynucleic acid SDS Sodiumdodecylsulfat Sec/P Sec pathway/ Secretion pathway – con đƣờng tiết SP Peptide tín hiệu (SP) SPase SPase viii SRP Signal recognition particle STT Số thứ tự TAE Tris-acetic acid-EDTA TAT/P Twin-arginine translocation pathway TEMED Tetramethylethylenediamine TIM Triose phosphate Isomerase Tm Melting temperature U Unit VSV Vi sinh vật MeOH Methanol TRAM Translocating chain-associating membrane protein ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G+ và G- theo Sec/P ............................................................................................... 9 Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P .................... 10 Bảng 1.3 Một số enzyme có nguồn gốc vi khuẩn và ứng dụng của chúng ... 19 Bảng 2.1 Các mẫu đất và ký hiệu sử dụng khi nghiên cứu ........................... 38 Bảng 2.2 Các chủng chủ trong nghiên cứu .................................................... 38 Bảng 2.3 Các plasmid đặt theo hãng sử dụng trong nghiên cứu ................... 40 Bảng 2.4 Các chất bổ sung sử dụng cho môi trƣờng chọn lọc ...................... 41 Bảng 2.5 Các primer sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 47 Bảng 3.1 Số lƣợng khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng LB tinh bột ............ 56 Bảng 3.2 Hoạt tính và hàm lƣợng α- amylase của một số chủng chọn lọc ... 60 Bảng 3.3 Đặc điểm của các peptide tín hiệu chọn lọc ................................... 66 Bảng 3.4 Các thành phần của tổ hợp Megaprimer ........................................ 68 Bảng 3.5 Hoạt tính tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp ............................. 77 Bảng 3.6 Các plasmid thiết kế ....................................................................... 80 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng của các peptide tín hiệu khác nhau lên khả năng biểu hiện và tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2 ..... 81 Bảng 3.8 Đặc điểm của các peptide tín hiệu đột biến.................................... 84 Bảng 3.9 Thành phần của plasmid mang tổ hợp gen đột biến....................... 85 Bảng 3.10 Khả năng tiết α - amylase và protein tổng số của các chủng tái tổ hợp .............................................................................................. 87 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của 94 chủng 168MpHVC1 ....................................................................... 94 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng của nguồn C lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................. 95 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn N lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................. 96 x DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn .......................................... 5 Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. subtilis ............ 6 Hình 1.3 Các yếu tố liên quan đến biểu hiện gen ở B. subtilis ........................ 22 Hình 2.1 Các vector sử dụng trong nghiên cứu…………………………….. Hình 2.2 Sơ đồ phƣơng pháp Megaprimer tạo tổ hợp gen giữa peptide tín 39 hiệu quan tâm và đoạn gen đích ....................................................... 51 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tạo tổ hợp promoter - signal – mature 3BT2 amylase gen bằng T4-lygase từ Pgrac và tổ hợp gen đích đã phân lập ..................................................................................................... 52 Hình 3.1 Hoạt tính amylase của một số chủng sàng lọc.................................. 58 Hình 3.2 Hình thái tế bào và hình ảnh một số khuẩn lạc Bacillus phân lập.... 58 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA của một số chủng nghiên cứu ........................................................................................ 60 Hình 3.4 Cây phát sinh loài của các chủng chọn lọc ....................................... 61 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm gen mang peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu ........................................................................................ 63 Hình 3.6 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng DA23 ................................................................................................ 64 Hình 3.7 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng D5-2 .................................................................................................. 64 Hình 3.8 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng CN1-5 ............................................................................................... 64 Hình 3.9 Hình ảnh logo trình tự peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu .. 65 xi Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide của ba peptide tín hiệu chọn lọc ........... 65 Hình 3.11 So sánh trình tự protein mã hóa cho SP của cả ba chủng nghiên cứu .................................................................................................... 65 Hình 3.12 Sơ đồ thí nghiệm tăng khả năng tiết α-amylase trong Bacillus subtilis............................................................................................... 68 Hình 3.13 Sơ đồ điểm cắt enzyme giới hạn của các peptide tín hiệu chọn lọc ..................................................................................................... 69 Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn mature gen α amylase của chủng 3BT2, các đoạn peptide tín hiệu quan tâm, sản phẩm megaprimer giữa peptide tín hiệu quan tâm và đoạn gen trƣởng thành của α – amylase 3BT2 ................................................................................... 71 Hình 3.15 Sản phẩm tách DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI và XbaI của các dòng mang đoạn sản phẩm megaprimer DASsub3BT2Mature trong pTZ57R/T .............................................. 71 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen quan tâm ................. 71 Hình 3.17 Sơ đồ thí nghiệm tạo vector pHVgracAmy mới từ vector pHV33 gốc .................................................................................................... 74 Hình 3.18 Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 tách dòng và xử lý EcoRI . 75 Hình 3.19 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp enzym của chủng B. subtilis 168M mang vector pHV33-promoter Pgrac - α-amylase 3BT2 .......................... 78 Hình 3.20 Ảnh hƣởng của promoter lên khả năng tiết enzym của chủng tái tổ hợp ................................................................................................ 78 Hình 3.21 So sánh biểu hiện tiết α-amylase các peptide tín hiệu khác nhau .... 82 Hình 3.22 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trƣởng và sinh tổng 82 xii hợp amylase của chủng 168MSusigD52 .......................................... Hình 3.23 Sơ đồ cấu trúc và trình tự axit amin 3 vùng trên SP gen α amylase chủng D5-2 ......................................................................... 84 Hình 3.24 So sánh trình tự axit amin của các peptide đột biến ......................... 85 Hình 3.25 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn peptide tín hiệu mang trình tự đột biến…………………………………………………... 86 Hình 3.26 Điện di đồ sản phẩm PCR các cụm tổ hợp và cắt kiểm tra plasmid ............................................................................................. 89 Hình 3.27 Sàng lọc các dòng mang vector thiết kế thu các chủng có hoạt tính amylase ...................................................................................... 89 Hình 3.28 Khả năng tiết amylase ngoại bào của các peptide tín hiệu đột biến ................................................................................................... 89 Hình 3.29 Động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................................................... 91 Hình 3.30 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 ............................................. 93 Hình 3.31 Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết α - amylase của chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHVC1 ........................................ 94 1 MỞ ĐẦU Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Tăng quá trình tiết protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu nhận. Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có 2 thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men. Hoạt tính của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase. Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis” Mục tiêu nghiên cứu: - Có đƣợc cơ sở dự liệu về trình tự peptide tín hiệu của gene α–amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus. - Tạo đƣợc hệ biểu hiện mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả năng tiết α-amylase ngoại bào ở chủng Bacillus tái tổ hợp. 1. Nội dung luận án: - Phân lập tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh α-amylase ngoại bào cao. - Tách các trình tự peptide tín hiệu của gen α-amylase từ chủng chọn lọc - Gây đột biến hoặc thay thế các peptide tín hiệu đã đƣợc đột biến định hƣớng - Tạo các chủng tái tổ hợp với các peptide tín hiệu đột biến và sàng lọc các chủng có khả năng tiết α-amylase cao. - Nghiên cứu điều kiện biểu hiện α-amylase của chủng tái tổ hợp thu đƣợc. 2. Những đóng góp mới của luận án - Đã xác định đƣợc dữ liệu khoa học về peptide tín hiệu của gen α --amylase từ 3 chủng điển hình trong số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam. - Tạo đƣợc các đột biến điểm và xác định đƣợc đột biến A31V giúp tăng cƣờng tiết α - amylase trong Bacillus subtilis. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT 1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes Các preprotein hình thành trong nấm men ít nhất có hai con đƣờng vận chuyển một đƣờng qua SRP trung gian và một con đƣờng độc lập khác. Vận chuyển protein qua SRP trung gian vẫn chƣa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyển protein của S. cerevisiae xuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63, và 2 protein phát hiện thêm gần đây. Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nƣớc liên kết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tƣơng tự nhƣ TRAM trong tế bào động vật có vú nhƣng trình tự của Sec61 không có bất kỳ điểm tƣơng đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tƣơng đồng với protein SecY ở E. coli (Simonen & Palva, 1993). Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vú và trong S. cerevisiae, các peptide tín hiệu đƣợc loại bởi SPase. Hai phức hợp chuỗi các enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) của động vật có vú và nấm men có tƣơng đồng với Sec11 (YaDeau et al., 1991). Trong khoang lƣới nội chất của ER của cả tế bào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết. BiP của S. cerevisiae (Kar2) tƣơng tác với protein trong bƣớc sớm quá trình vận chuyển protein qua màng. BiP rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993) 1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli Trong E. coli, khoảng 50% protein của tế bào đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng với hơn 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al., 2013). Các SP đƣợc cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết nhƣ: SecB, GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính. Liên kết của SecB ngăn preprotein gấp cuộn khi chƣa thể hiện chức năng. GroEL, DnaK, và 4 DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bào E. coli ngoài vai trò trong quá trình tiết protein. Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tế bào bởi ái lực của SecA với SP và SecB. SecA là protein màng ngoại vi và có ái lực đối với với phần protein trƣởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993). Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá trình chuyển vận qua màng. Một số protein trên màng SecY, SecE cùng với SecA hình thành nên hệ vận chuyển ở E. coli. Chuỗi polypeptide có thể trƣợt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E. Phần xúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trình phân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển. Chức năng của 2 protein SecD và SecF trên màng chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóng vai trò trong việc hỗ trợ quá trình gấp cuộn của protein khi mới đƣợc vận chuyển lên periplasmic tƣơng tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993). 1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus 1.1.3.1. Các con đường vận chuyển protein trong Bacillus Quá trình tiết protein ở Bacillus là hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết điển hình đƣợc biết đến là khác so với E. coli, S. cerevisiae và động vật có vú. Tế bào của Bacillus đƣợc bao quanh bởi màng tế bào chất, đƣợc bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm) bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (Chu H.H., 2001). Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đƣờng tiết protein đƣợc biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng đó là: Sec-SRP, Tat, qua nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) và con đƣờng Pseudopillin (Com pathway). Các SP của Bacillus đã có rất nhiều công trình công bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara et al., 1993). Các con đƣờng tiết protein trong Bacillus cũng nhƣ các enzym phân 5 cắt tín hiệu tham gia trong các con đƣờng này đƣợc thể hiện trên Hình 1.1, Cơ chế tiết đƣợc thể hiện trên hình 1.2. Hình 1.1. Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn (Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004) Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein. Protein Ffh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognition particle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP-precusor sẽ tƣơng tác với SecA nhờ các liên kết với SP. Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA đƣợc đƣa tới vị trí màng tế bào và tƣơng tác với các yếu tố protein vận chuyển trên màng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG. Sau đó, SP sẽ đƣợc phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusor protein đƣợc đƣa ra qua các Sec-pore bởi SecA chủ yếu nhờ vào nguồn năng lƣợng 6 ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền. Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppA và TepA, các exoprotein sẽ đƣợc vận chuyển qua màng tế bào do đó nó đƣợc điều khiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và đƣợc tăng cƣờng tạo ra nhờ xúc tác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào. BdbB và BdbC là các protein tham gia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond formation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein. Một số protease ở thành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca2+ và Fe3+ rất cần thiết cho việc ổn định hoạt tính của một số exoprotein. Hình 1.2.Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. subtilis (Nguồn: Brockmeier, 2006) 1.1.3.2. Đích vận chuyển protein trong Bacillus Cấu trúc của lớp màng tế bào của Bacilli không có lớp màng ngoài (OM Outer membrane) cho nên sau khi tổng hợp các protein có thể đƣợc giữ lại trong tế