Tài liệu Sàng lọc khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của một số thực vật và tối ưu quy trình chiết đối với thực vật có hoạt tính tốt nhất

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -------------------- NGUYỄN PHẠM ĐỨC CHÍNH SÀNG LỌC KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE CỦA MỘT SỐ THỰC VẬT VÀ TỐI ƯU QUY TRÌNH CHIẾT ĐỐI VỚI THỰC VẬT CÓ HOẠT TÍNH TỐT NHẤT Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số:8520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN PHẠM ĐỨC CHÍNH MSHV: 1970448 Ngày, tháng, năm sinh: 12/12/1997 Nơi sinh: Khánh Hòa Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số : 8520301 I. TÊN ĐỀ TÀI : SÀNG LỌC KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE CỦA MỘT SỐ THỰC VẬT VÀ TỐI ƯU QUY TRÌNH CHIẾT CỦA THỰC VẬT CÓ HOẠT TÍNH TỐT NHẤT. Tên tiếng anh : Xanthine oxidase inhibitory activity of some Vietnamese plants and optimization of extraction conditions of total flavonoid contents and anti-gout activity. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG : - Sơ bộ hóa cấu trúc hóa học của 11 loại thực vật bao gồm: lá sen, đại bi, actiso, diệp hạ châu, lá ổi, mãng cầu ta, ngải cứu, ngũ trảo, lá lốt, lá dứa và cải bẹ xanh. - Xác định hàm lượng polyphenol và flavonoid của 11 loại thực vật. - Xác định thực vật có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase tốt nhất. - Tối ưu hóa điều kiện chiết của thực vật có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase tốt nhất. - Xác định các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm và phân tích phổ FT-IR của các mẫu cao sau khi tối ưu. II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/09/2021 III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/12/2021 IV. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Hà Cẩm Anh Tp. HCM, ngày 25 tháng 12 năm 2021. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. Hà Cẩm Anh CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS. TS. Lê Thị Hồng Nhan TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC GS. TS. Phan Thanh Sơn Nam i LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa-ĐHQG TP.HCM đã tận tình dạy dỗ tôi trong suốt thời gian theo học tại trường. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS. Hà Cẩm Anh – người đã hướng dẫn tôi rất tận tình về nội dung nghiên cứu, hỗ trợ thao tác thí nghiệm và động viên tinh thần tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. TS. Lê Xuân Tiến đã cho tôi nhiều ý kiến hay trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Bạn Lê Minh Tấn đã hỗ trợ và góp ý trong suốt quá trình thực hiện luận văn, Em Huỳnh Mai Như và Nguyễn Dương Hữu Chí đã đồng hành cùng tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Các thầy cô khoa Kỹ thuật Hóa học nói chung và bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ nói riêng đã truyền đạt kiến thức chuyên ngành. Đây là nền tảng vững chắc để tôi hoàn thành luận văn cũng là hành trang kiến thức cho nghề nghiệp của tôi sau này. Các bạn cùng làm thí nghiệm luận văn với tôi tại phòng 401B2 đã chia sẻ những kinh nghiệm và hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cha mẹ và mọi người trong gia đình luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc, giúp tôi có thêm nghị lực vượt qua khó khăn trong suốt quãng thời gian học tập xa nhà. Mặc dù tôi đã cố gắng rất nhiều để hoàn thiện luận văn nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý giá của thầy cô và các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Xin kính chúc tất cả các thầy cô và các bạn những lời chúc tốt đẹp nhất! Người thực hiện luận văn Nguyễn Phạm Đức Chính ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong nghiên cứu này đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế xanthine oxidase của 11 đối tượng thực vật bao gồm sen, đại bi, actiso, diệp hạ châu, ổi, mãng cầu ta, ngải cứu, ngũ trảo, lá lốt, dứa và cải bẹ xanh. Kết luận được rằng lá ổi là đối tượng có hoạt tính tốt nhất trong số các đối tượng nghiên cứu với giá trị TPC, TFC cao nhất và IC50 của hoạt tính ức chế xanthine oxidase lần lượt là 150.32 mgGAE/g cao khô, 190.61 mgQUE/g cao khô và 76.90 µg/mL. Đối tượng lá ổi được chọn là mục tiêu nghiên cứu tiếp để tối ưu điều kiện chiết với mục tiêu là hàm lượng polyphenol tổng cũng như hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase. Thực hiên tối ưu hóa điều kiện chiết bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM với sự hỗ trợ của phần mềm Design Expert cho kết quả dự đoán của điều kiện tối ưu TFC tại nồng độ EtOH 48%, nhiệt độ chiết 40oC, tỉ lệ rắn – lỏng 1:7.2 g/mL, thời gian chiết 65 phút và điều kiện tối ưu hoạt tính ức chế enzyme XO tại nồng độ EtOH là 46%, nhiệt độ chiết 43 oC, tỉ lệ rắn/lỏng 1:08 (g/mL) và thời gian chiết 64 phút. Hai mẫu cao tối ưu TFC và XOI có hàm lượng lần lượt là 336.7 mgQUE/g cao khô, 332.86 mgQUE/g cao khô và giá trị IC50 của hoạt tính ức chế XO lần lượt là 12.48 µg/mL, 11.27 µg/mL tương ứng với giá trị IC50 của allopurinol là 1.57 µg/mL. Ngoài ra, các mẫu cao tối ưu còn được thực hiện phân tích phổ FT-IR thể hiện sự hiện diên của các nhóm flavonoid trong các mẫu cao chiết. Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH của các mẫu cao tối ưu TFC và XOI có giá trị IC50 lần lượt là 12.48 ± 0.14 μg/mL và 11.27 ± 0.85 μg/mL. Đồng thời khả năng kháng viêm theo phương pháp ức chế enzyme hyaluronidase của mẫu cao tối ưu TFC và XOI cũng được ghi nhận với các giá trị lần lượt là 5.34 ± 0.3 μg/mL và 6.31 ± 0.44 μg/mL. iii ABSTRACT This study was aimed to screening xanthine oxidase inhibitory activity of eleven plants including Nelumbo nucifera Gaertn., Blumea balsamifera (L.) DC., Cynara cardunculus L., Phyllanthus urinaria L., Psidium guajava L., Annona squamosa L., Artemisia vulgaris L., Vitex negundo L., Piper lolot C.DC., Pandanus amaryllifolius Roxb. and Brassica juncea L. The leaf extract of Psidium guajava L., which has the highest TPC and TFC; and show the best xanthine oxidase inhibitory activity. The TFC, TPC, and IC50 values were 150.32 mgGAE/g, 190.61 mgQUE/g and 76.90 µg/mL, respectively. The leaf extract of Psidium guajava L. was optimized ethanol extraction of flavonoid compounds (TFCO) as well as xanthine oxidase inhibitory activity (XOIO) by response surface methodology (RSM). Four parameters, including ethanol concentration, the solid-to-liquid ratio, extraction temperature, and extraction time were discussed. The best extraction conditions observed for total flavonoid content were at 48% EtOH and temperature of 40°C for 65 min with solidto-liquid ratio of 1: 7.2 g/mL that for xanthine oxidase inhibitory activity at 46% EtOH with a temperature of 43°C for 63 min with solid-to-liquid ratio of 1: 08 g/mL. The research showed that the TFC values of TFCO and XOIO were 336.7 mgQUE/g. d.w and 332.86 mgQUE/g. d.w. Also, the TFCO showed strong inhibitory activity on xanthine oxidase with IC50 value of 12.48 µg/mL, which was similar to XOIO sample with IC50 value of 11.27 µg/mL. The FT-IR research showed that both optimal extraction condition observer the flavonoid appearance. Additionally, both of these optimal extracts showed almost equivalent antioxidant when the IC50 were 12.48 μg/mL, and 11.27 μg/mL, respectively; and both of them were also better than the anti-inflammatory activity of positive control with IC50 value of 5.34 μg/mL and 6.31 µg/mL, respectively. iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện nghiên cứu này đã được cảm ơn và các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc và trích đẫn rõ ràng theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 12 năm 2021 Tác giả Nguyễn Phạm Đức Chính v MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................... iii ABSTRACT .............................................................................................................. iv LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................v MỤC LỤC ................................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. xi DANH MỤC PHỤ LỤC .......................................................................................... xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. xiii LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 1. TỔNG QUAN .....................................................................................................3 1.1. Dịch tễ học bệnh gout ......................................................................................3 1.2. Tổng quan về bệnh gout ...................................................................................4 1.2.1. Lịch sử sơ lược và định nghĩa ...................................................................4 1.2.2. Giai đoạn lâm sàng của bệnh gout ............................................................6 1.2.3. Biến chứng của bệnh gout .........................................................................7 1.2.4. Mối liên hệ giữa bệnh gout và các dạng oxy hoạt động ...........................8 1.2.5. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh gout .....................................................9 1.2.6. Các phương pháp điều trị gout ................................................................13 1.3. Các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase ...........15 1.4. Các đối tượng thực vật nghiên cứu ................................................................18 1.4.1. Lá ổi (Psidium guajava L.) .....................................................................19 1.4.2. Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) .............................................................20 1.4.3. Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC.) ....................................................20 1.4.4. Actiso (Cynara cardunculus L.) .............................................................21 vi 1.4.5. Dứa (Pandanus amaryllifolius Roxb.) ....................................................22 1.4.6. Cải bẹ xanh (Brassica juncea L.) ............................................................22 1.4.7. Ngũ trảo (Vitex negundo L.) ...................................................................23 1.4.8. Mãng cầu ta (Annona squamosa L.) .......................................................24 1.4.9. Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) ..................................................24 1.4.10. Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) ..........................................................25 1.4.11. Lá lốt (Piper lolot C. DC.) ....................................................................26 2. NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM HOẶC LÝ THUYẾT .................27 2.1. Mục tiêu nghiên cứu: .....................................................................................27 2.2. Nội dung nghiên cứu: .....................................................................................27 2.3. Hóa chất và thiết bị: .......................................................................................28 2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................28 2.4.1. Xác định độ tro toàn phần .......................................................................28 2.4.2. Xác định độ ẩm .......................................................................................29 2.4.3. Phương pháp chiết ...................................................................................29 2.4.4. Phương pháp khảo sát sơ bộ thành phần hóa học thực vật .....................30 2.4.5. Định lượng polyphenol tổng ...................................................................31 2.4.6. Định lượng flavonoids bằng phản ứng tạo phức với AlCl3 ....................33 2.4.7. Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase ..............................35 2.4.8. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng DPPH ......................................37 2.4.9. Khảo sát hoạt tính kháng viêm theo cơ chế Hyaluronic acid (HA) ........38 2.4.10. Phương pháp tối ưu hóa bằng bề mặt đáp ứng (RSM) ..........................42 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................................45 3.1. Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu ..................................................................45 3.2. Hiệu suất thu cao tổng ....................................................................................46 3.3. Sơ bộ hóa thực vật ..........................................................................................48 vii 3.4. Định lượng polyphenol và flavonoid .............................................................50 3.5. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme XO của các đối tượng .............................52 3.6. Xác định điều kiện tối ưu bằng phương pháp luân phiên từng biến ..............54 3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng ức chế XO và TFC ..........54 3.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến khả năng ức chế XO và TFC ..........55 3.6.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng ức chế XO và TFC ...........57 3.6.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn-lỏng đến khả năng ức chế XO và TFC ............58 3.7. Tối ưu điều kiện chiết bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) ................59 3.7.1. Mã hóa vùng khảo sát và kế hoạch thí nghiệm .......................................59 3.7.2. Kết quả các thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm .....................................59 3.7.3. Phân tích sự tương tác giữa mô hình và thực nghiệm .............................63 3.7.4. Xác định mức độ tối ưu thông qua đáp ứng bề mặt ................................66 3.7.5. Xác định điểm tối ưu ...............................................................................68 3.7.6. Đánh giá hàm lượng flavonoid tổng và hoạt tính ức chế XO .................69 3.7.7. Phân tích FT-IR các mẫu cao tối ưu ........................................................70 3.7.8. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các mẫu cao tối ưu .....................72 3.7.9. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các mẫu cao tối ưu .........................73 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................74 4.1. Kết luận ..........................................................................................................74 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................75 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ....................................................76 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................77 PHỤ LỤC ..................................................................................................................86 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG .....................................................................................133 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tỉ lệ mắc bệnh gout chuẩn hóa theo độ tuổi tính trên 100,000 dân số năm 2017 .............................................................................................................................4 Hình 1.2. Tinh thể urate lắng đọng trong các khớp ....................................................5 Hình 1.3. Hạt tophi hình thành trong khớp ngón tay ..................................................7 Hình 1.4. Gốc tự do được tạo ra do hoạt động của enzyme xanthine oxidase ............9 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của acid uric ..................................................................10 Hình 1.6. Quy trình tạo thành acid uric trong cơ thể ................................................11 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của allopurinol và febuxostat ........................................14 Hình 1.8. Cấu trúc của các hợp chất thuốc nhóm flavonoid .....................................15 Hình 1.9. Cấu trúc của các hợp chất flavonoid có khả năng ức chế XO ..................16 Hình 1.10. Các hợp chất acid hydrocinnamic có khả năng ức chế XO ....................16 Hình 1.11. Các tannins có khả năng ức chế xanthine oxidase ..................................17 Hình 1.12. Các alkaloids có khả năng ức chế xanthine oxidase ...............................18 Hình 2.1. Quy trình chiết...........................................................................................30 Hình 2.2. Quy trình định lượng polyphenol tổng......................................................32 Hình 2.3. Đường chuẩn acid gallic ...........................................................................33 Hình 2.4. Quy trình định lượng flavonoids ...............................................................34 Hình 2.5. Đường chuẩn quercetin .............................................................................35 Hình 2.6. Quá trình chuyển hóa xanthine thành acid uric.........................................36 Hình 2.7. Phản ứng giữa DPPH và chất kháng oxy hóa ...........................................37 Hình 2.8. Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa ............................................38 Hình 2.9. Cấu trúc phân tử Hyaluronic acid .............................................................39 Hình 2.10. Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế enzyme Hyaluronidase...................41 Hình 3.1. Hiệu suất chiết của các đối tượng nghiên cứu ..........................................47 Hình 3.2. Hàm lượng polyphenol và flavonoid của các đối tượng nghiên cứu ........51 Hình 3.3. Khả năng ức chế enzyme XO của các đối tượng nghiên cứu ...................53 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến (a) TFC và (b) khả năng ức chế XO .55 ix Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến (a) TFC và (b) khả năng ức chế XO.56 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến (a) TFC và (b) khả năng ức chế XO ...........57 Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn-lỏng đến (a) TFC và (b) khả năng ức chế XO ...58 Hình 3.8. Mô hình quy hoạch thực nghiệm ..............................................................60 Hình 3.9. Khả năng ức chế xanthine oxidase của các thí nghiệm quy hoạch ...........62 Hình 3.10. Hàm lượng flavonoid tổng của các thí nghiệm quy hoạch .....................62 Hình 3.11. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của (a) nồng độ dung môi và tỉ lệ rắn/lỏng, (b) nhiệt độ chiết và tỉ lệ rắn/lỏng, (c) nhiệt độ chiết và thời gian chiết, (d) thời gian chiết và tỉ lệ rắn/lỏng đến giá trị TFC ........................................................66 Hình 3.12. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của (a) nồng độ dung môi và nhiệt độ chiết (b) nồng độ dung môi và thời gian chiết, (c) nhiệt độ chiết và tỉ lệ rắn/lỏng, (d) nhiệt độ chiết và thời gian chiết, (e) thời gian chiết và tỉ lệ rắn/lỏng đến giá trị ức chế xanthine oxidase (XOI) .............................................................................................67 Hình 3.13. Kết quả giá trị TFC của các mẫu cao tối ưu............................................70 Hình 3.14. Kết quả hoạt tính ức chế xanthine oxidase của các mẫu cao tối ưu ........70 x DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các đối tượng thực vật khảo sát ...............................................................27 Bảng 2.2. Đánh giá mối tương quan giữa mô hình và thực nghiệm .........................43 Bảng 3.1. Độ ẩm và độ tro của các đối tượng nghiên cứu ........................................45 Bảng 3.2. Kết quả định tính của các đối tượng khảo sát ...........................................50 Bảng 3.3. TPC, TFC và khả năng ức chế enzyme XO của các đối tượng ................52 Bảng 3.4. Liên hệ giữa biến mã hóa và biến thực .....................................................59 Bảng 3.5. Bảng quy hoạch thực nghiệm ...................................................................60 Bảng 3.6. Bảng phân tích hệ số của phương trình hồi quy hàm lượng flavonoid ....64 Bảng 3.7. Bảng phân tích hệ số của phương trình hồi quy hoạt tính ức chế XO......65 Bảng 3.8. Kết quả điểm tối ưu từ mô hình ................................................................68 Bảng 3.9. Kết quả thực nghiệm .................................................................................69 xi DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Độ ẩm của các đối tượng nghiên cứu.......................................................86 Phụ lục 2. Độ tro của các đối tượng nghiên cứu .......................................................86 Phụ lục 3: Hiệu suất chiết của các đối tượng nghiên cứu .........................................87 Phụ lục 4: Kết quả sơ bộ hóa thực vật của các đối tượng nghiên cứu ......................89 Phụ lục 5: Kết quả định lượng tổng hàm lượng polyphenols và flavonoids của các đối tượng nghiên cứu.....................................................................................................102 Phụ lục 6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của các đối tượng nghiên cứu và chứng dương allopurinol .......................................................104 Phụ lục 7. Kết quả khảo sát hàm lượng TFC ở thời gian khác nhau ......................106 Phụ lục 8. Kết quả khảo sát hàm lượng TFC theo các nồng độ cồn .......................108 Phụ lục 9. Kết quả khảo sát hàm lượng TFC ở các nhiệt độ ...................................108 Phụ lục 10. Kết quả khảo sát hàm lượng TFC ở các tỉ lệ rắn lỏng .........................109 Phụ lục 11. Kết quả khảo sát khả năng ức chế XO ở các thời gian khác nhau .......109 Phụ lục 12. Kết quả khảo sát khả năng ức chế XO ở các nồng độ cồn ...................110 Phụ lục 13. Kết quả khảo sát khả năng ức chế XO ở các nhiệt độ .........................111 Phụ lục 14. Kết quả khảo sát khả năng ức chế XO ở các tỉ lệ rắn:lỏng ..................112 Phụ lục 15. Kết quả khảo sát hàm lượng TFC của các thí nghiệm quy hoạch .......112 Phụ lục 16. Kết quả khảo sát khả năng ức chế XO của các thí nghiệm quy hoạch .................................................................................................................................116 Phụ lục 17. Bảng phân tích phương sai ANOVA (YTFC) ........................................123 Phụ lục 18. Bảng phân tích hệ số hồi quy (YTFC)....................................................124 Phụ lục 19. Đồ thị tương quan giữa mô hình và thực nghiệm (YTFC) .....................125 Phụ lục 20. Kết quả kiểm tra điểm tối ưu hàm lượng flavonoids tổng của mẫu TFCO .................................................................................................................................125 Phụ lục 21. Bảng phân tích phương sai ANOVA (YXOI) ........................................126 Phụ lục 22. Bảng phân tích hệ số hồi quy (YXOI) ....................................................126 Phụ lục 23. Đồ thị tương quan giữa mô hình và thực nghiệm (YXOI) .....................127 Phụ lục 24. Kết quả kiểm tra điểm tối ưu khả năng ức chế XO của mẫu XOIO ....128 xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DMSO Dimethylsulfoxide EtOH Ethanol DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl HQ Hidroquinone FDA Food and Drug Administration HA Hyaluronic acid TPC Total polyphenols content TFC Total flavonoids content ROS Reactive oxygen species BSA Bovine serum albumin XO Xanthine oxidase XOI Xanthine oxidase inhibition xiii LỜI MỞ ĐẦU Thế kỷ XXI là thế kỷ mà khoa học kỹ thuật phát triển không ngừng. Cùng với sự phát triển đó, những căn bệnh nguy hiểm và gắn liền với những thói quen có hại cho sức khỏe ngày nay như rượu bia, dùng nhiều đồ ngọt, thiếu thể dục thể thao, … cũng ngày càng ảnh hưởng đến cuộc sống của con người, làm giảm chất lượng cuộc sống và ảnh hưởng đến kinh tế xã hội. Số lượng người mắc các căn bệnh nguy hiểm ngày càng gia tăng, trong đó bệnh gout là một căn bệnh khớp với nhiều biến chứng nguy hiểm ngày càng ảnh hưởng đến cuộc sống sức khỏe của cộng đồng. Nguy hiểm hơn là qua những thống kê dịch tễ học, số lượng người mắc bệnh gout có sự gia tăng nhanh chóng và ngày càng trẻ hóa đanh lên hồi chuông báo động cho nhu cầu nghiên cứu giải pháp hạn chế sự bùng nổ của căn bệnh này. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu nâng cao chất lượng cuộc sống cũng như chăm sóc sức khỏe ngày càng được nhiều người chú trọng hơn. Các loại thuốc tây y dùng trong chữa bệnh đã rất quen thuộc với con người, ngày càng đa dạng, phong phú và mang đến hiệu quả tức thì cho người bệnh. Tuy nhiên trong những năm gần đây, người ta quan tâm đến các tác dụng phụ gây ra khi sử dụng thuốc lâu dài. Do đó, các hợp chất tự nhiên trong các thảo dược thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm vì khả năng chữa bệnh cũng như hỗ trợ chăm sóc sức khỏe con người mà không hề gây ra hoặc gây ra rất ít tác dụng phụ không mong muốn. Vì vậy, các nghiên cứu sử dụng thực vật để chữa bệnh gout ngày càng nhiều để tìm kiếm loài thực vật hỗ trợ tốt việc điều trị bệnh mà không lo ngại về vấn đề tác dụng phụ cũng như các biến chứng mà bệnh gây ra. Việt Nam là đất nước có hệ thực vật vô cùng phong phú, đa dạng, với thảm thực vật hơn 12,000 loài cùng với điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu phù hợp, một số loài thực vật còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, hơn 36% loại thực vật đã được chứng minh có đặc tính sinh dược. Từ xa xưa, dân gian Việt Nam đã biết sử dụng cây cỏ như một nguồn thảo dược tự nhiên để chữa bệnh. Tác dụng chữa bệnh của một số loại thảo dược tuy không thể so sánh được với thuốc nhưng chúng có ưu điểm là rẻ tiền, nguồn nguyên liệu dồi dào, và đặc biệt là hạn chế các tác dụng phụ 1 mà thuốc gây ra. Từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu hướng đến việc tìm hiểu, so sánh và tiến hành sàng lọc một số loại thực vật được sử dụng làm dược liệu, trong các bài thuốc dân gian hoặc trong chính bữa ăn hàng ngày nhằm tìm ra thực vật có khả năng điều trị bệnh gout bằng cách ức chế enzyme xanthine oxidase tốt nhất. Đồng thời, xác định điều kiện trích ly thực vật có hoạt tính ức chế xanthine oxidase tốt nhất và xác định các hoạt tính sinh học khác hỗ trợ cho việc điều trị bệnh gout và các biến chứng của gout. 2 1. TỔNG QUAN 1.1 Dịch tễ học bệnh gout Bệnh gout là một loại bệnh viêm khớp phổ biến nhất thế giới và liên quan đến việc gia tăng nồng độ acid uric trong máu, đặc trưng bởi hiện tượng lắng đọng tinh thể urate trong khớp và mô liên kết [1]. Theo những nghiên cứu dịch tễ học từ các quốc gia khác nhau, việc gia tăng tỉ lệ mắc bệnh gout trong cộng đồng sẽ dẫn đến tổn thất đáng kể về kinh tế đối với một quốc gia [2]. Theo dữ liệu trong nghiên cứu về Gánh nặng Bệnh tật Toàn cầu năm 2017 (Global Burden of Disease Study) có gần 41.2 triệu người trưởng thành mắc bệnh gout, con số này đã tăng gần gấp đôi so với số liệu năm 1990 là 20,2 triệu người [3]. Tỉ lệ mắc bệnh gout trung bình trên toàn cầu từ 1% đến 4%, tỉ lệ mắc mới hằng năm trong khoảng từ 0,3 đến 6 ca mắc mới tính trong 1000 người [4-6]. Ở một số quốc gia, tỉ lệ mắc bệnh gout có thể lên tới 10% tổng dân số [8]. Hầu hết các quốc gia phát triển có tỉ lệ gia tăng số lượng bệnh nhân mắc bệnh gout cao hơn nhiều so với các nước đang phát triển [7, 8]. Khu vực châu Á-Thái Bình Dương có tỉ lệ mắc bệnh gout cao nhất toàn thế giới, với một số nước có tỉ lệ mắc hơn 10% [6]. Ngoài ra, khu vực châu Âu, Bắc Mỹ và các quốc gia phát triển ở châu Á đều được ghi nhận với tỉ lệ mắc bệnh gout cao và tăng lên theo từng năm [5, 6]. Tỉ lệ mắc bệnh gout cũng thay đổi dựa trên độ tuổi và giới tính. Tỉ lệ mắc bệnh gout đối với nam giới cao hơn ở nữ giới, đặc biệt tỉ lệ mắc bệnh gout tăng cao ở những đối tượng trung niên và người cao tuổi [5, 6, 9]. Tại Việt Nam, theo thống kê của Khoa Xương khớp bệnh viện Bạch Mai, trong vòng 20 năm (1978-2000) tốc độ gia tăng của bệnh nhân gout rất đáng báo động, cụ thể là tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh gout tăng từ 10% đến 15%. Theo thống kê của chương trình định hướng cộng đồng về kiểm soát bệnh thấp khớp (COPCORD) năm 2013 tại Hà Nội, tỉ lệ mắc bệnh gút khoảng 0,14% [10]. Sự gia tăng của tỉ lệ mắc bệnh gout và số ca mắc mới hàng năm liên quan mật thiết đến lối sống không lành mạnh hiện nay bao gồm chế độ ăn nhiều purine đặc biệt là thịt và hải sản, đồ uống có cồn nhất là bia và rượu mạnh cùng với các thức uống 3 nhiều đường fructose dẫn đến hội chứng chuyển hóa với bệnh béo phì, mỡ trong máu, lão hóa nhanh [11, 12]. Những nghiên cứu trên đã chỉ ra mối nguy hại và sự bùng nổ nhanh chóng của bệnh gout, điều này đặt ra nhu cầu cấp bách cho những nghiên cứu về phương pháp điều trị bệnh gout để làm chậm xu hướng phát triển của căn bệnh này. Hình 1.1. Tỉ lệ mắc bệnh gout chuẩn hóa theo độ tuổi tính trên 100,000 dân số năm 2017 1.2 Tổng quan về bệnh gout 1.2.1. Lịch sử sơ lược và định nghĩa Bệnh gout được xem như một trong những căn bệnh lâu đời nhất trên thế giới với lần đầu tiên được ghi nhận bởi người Ai Cập cổ đại vào năm 2640 trước Công nguyên. Sau đó, ca bệnh gout cấp tính đầu tiên được Hippocrates phát hiện vào thế kỷ XV trước Công nguyên và đặt tên là “unwalkable disease”, có nghĩa là căn bệnh không thể đi lại được. Thuật ngữ bệnh gout bắt nguồn từ tiếng Latinh “gutta” có nghĩa là “rơi”, xuất phát từ một quan niệm y học thời trung cổ cho rằng trong cơ thể có 4 loại “chất dịch” quan trọng giúp duy trì cơ thể khỏe mạnh, khi một trong bốn loại 4 “chất dịch” này dư thừa sẽ “rơi” vào khớp gây đau và viêm. Trong những tài liệu lịch sử, bệnh gout đều gắn liền với việc sử dụng nhiều những thức ăn bổ dưỡng và uống nhiều bia rượu, gắn liền với lối sống của những nhà giàu, quý tộc thời xưa. Chính vì điều này, bệnh gout còn được ví như “căn bệnh của vua chúa” [13]. Về lịch sử phát triển của các thuốc điều trị bệnh gout, colchicine là một loại alkaloid có nguồn gốc từ cây nghệ tây (Colchicum autumnale) đã được dùng như một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh gout bởi một thầy thuốc cơ đốc giáo tên là Alexander vào thế kỷ VI sau Công nguyên [14]. Vào cuối thế kỷ XIX, lần đầu tiên thuốc tăng đào thải acid uric ở niệu đạo được sử dụng trong điều trị bệnh gout [13]. Hiện nay, thuốc kháng viêm không steroid thường dùng để điều trị bệnh gout cấp tính [15]. Có lẽ tiến bộ quan trọng nhất trong việc điều trị bệnh gout là sự phát hiện và ứng dụng của các hợp chất ức chế enzyme xanthine oxidase nhằm hạn chế tăng acid uric máu, điển hình là hiệu quả trong việc làm giảm nồng độ urate trong huyết tương và nước tiểu. Các hợp chất ức chế enzyme xanthine oxidase đã được chứng minh là có thể ngăn cản sự phát triển của các tinh thể urate lắng đọng tạo thành hạt tophi [16]. Hình 1.2. Tinh thể urate lắng đọng trong các khớp Gout được định nghĩa là bệnh được gây ra bởi sự lắng đọng tinh thể mononatri urate (MSU) tại dịch khớp và các mô liên kết (Hình 1.2) [17]. Việc hình thành các tinh thể urate tiền đề là do việc tăng acid uric huyết thanh (SUA) trên một ngưỡng cụ thể. Việc chuẩn đoán bệnh gout phụ thuộc vào việc xác định các vi tinh thể trong dịch khớp và các mô. 5