Tài liệu Phát hiện gen mã hóa carbapenemase trên chủng acinetobacter baumannii bằng kỹ thuật lamp

ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP. HHCM 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA /Æ07581*75ѬӢNG PHÁT HIӊN GEN MÃ HÓA CARBAPENEMASE TRÊN CHӪNG ACINETOBACTER BAUMANNII BҴNG KӺ THUҰT LAMP Chuyên ngành: Công NghӋ Sinh Hӑc Mã sӕ: 60420201 LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ TP. HӖ CHÍ MINHWKiQJQăP 2021 &{QJWUuQKÿѭӧc hoàn thành tҥi: 7UѭӡQJĈҥi hӑc Bách Khoa ± Ĉ+4*-HCM Cán bӝ Kѭӟng dүn khoa hӑc: TS. NguyӉQ6ƭ7Xҩn PGS.TS. NguyӉQ7K~\+ѭѫQJ Cán bӝ chҩm nhұn xét 1: TS. NguyӉQ+RjQJ&KѭѫQJ Cán bӝ chҩm nhұn xét 2: TS. Hoàng Anh Hoàng LuұQYăQWKҥFVƭÿѭӧc bҧo vӋ tҥL7UѭӡQJĈҥi hӑF%iFK.KRDĈ+4*7S+&0 QJj\WKiQJQăP. (Online trên Google Meet) Thành phҫn HӝLÿӗQJÿiQKJLiOXұQYăQWKҥFVƭJӗm: 1. PGS.TS.NguyӉn TiӃn Thҳng Chӫ tӏch 2. TS. HuǤnh Ngӑc Oanh Thѭký 3. TS. NguyӉQ+RjQJ&KѭѫQJ Phҧn biӋn 1 4. TS. Hoàng Anh Hoàng Phҧn biӋn 2 5. PGS.TS.NguyӉQ7K~\+ѭѫQJ Ӫy viên Xác nhұn cӫa Chӫ tӏch HӝLÿӗQJÿiQKJLi/9Yj7Uѭӣng Khoa quҧn lý chuyên ngành sau khi luұQYăQÿmÿѭӧc sӱa chӳa (nӃu có) CHӪ TӎCH HӜ,ĈӖNG PGS.TS. NguyӉn TiӃn Thҳng 75ѬӢNG KHOA *6763KDQ7KDQK6ѫQ1DP ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP.HCM 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA CӜNG HÒA XÃ HӜI CHӪ 1*+Ƭ$9,ӊT NAM Ĉӝc lұp - Tӵ do - Hҥnh phúc NHIӊM VӨ LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ Hӑ tên hӑFYLrQ/kP7UXQJ7Uѭӣng MSHV: 1770181 1Jj\WKiQJQăPVLQK 1ѫLVLQK.LrQ*LDQJ Chuyên ngành: Công NghӋ Sinh Hӑc Mã sӕ: 60420201 7Ç1Ĉӄ TÀI: Phát hiӋn gen mã hóa carbapenemase trên chӫng Acinetobacter baumannii bҵng kӻ thuұt LAMP. NHIӊM VӨ VÀ NӜI DUNG: ÿӅ WjL³3KiWKLӋn gen mã hóa carbapenemase trên chӫng Acinetobacter baumannii bҵng kӻ thuұW/$03´Yӟi hai mөc tiêu. 1. Áp dөQJTX\WUuQK/$03ÿmÿѭӧc công bӕ bӣi Norihisa Yamamoto và cӝng sӵ ÿӇ phát hiӋn tӹ lӋ gen mã hóa carbapenemase blaOXA-23 trên khuҭn lҥc Acinetobacter baumannii phân lұp tӯ mүu bӋnh phҭm lâm sàng. 2. ĈiQKJLiÿӝ nhҥ\ÿӝ ÿһc hiӋu cӫa kӻ thuұt LAMP trong viӋc phát hiӋn gen mã hóa carbapenemase blaOXA-23 trên Acinetobacter baumannii trong các mүu bӋnh phҭm lâm sàng. NGÀY GIAO NHIӊM VӨ: 22/02/2021 NGÀY HOÀN THÀNH NHIӊM VӨ: 13/06/2021 CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN: TS. NguyӉQ6ƭ7Xҩn ; PGS.TS. NguyӉQ7K~\+ѭѫQJ Tp. HCM, ngày « tháng « QăP21 CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN TS. NguyӉQ6ƭ7Xҩn PGS.TS. NguyӉQ7K~\+ѭѫQJ CHӪ NHIӊM BӜ 0Ð1Ĉ¬27Ҥ275ѬӢNG KHOA PGS.TS. Lê Thӏ Thӫ\7LrQ*6763KDQ7KDQK6ѫQ1DP LӠI CҦ0Ѫ1 Tôi xin trân trӑng cҧPѫQ3*6761JX\ӉQ7K~\+ѭѫQJF{ÿmOX{Qӫng hӝ, tҥRÿLӅu kiӋQJL~Sÿӥ ÿӇ tôi hoàn thành luұQYăQWҥL7Uѭӡng. Tôi xin trân trӑng cҧPѫQ TS. NguyӉQ6ƭ7Xҩn ± 7Uѭӣng khoa Vi Sinh , BӋnh viӋn Thӕng NhҩWĈӗQJ1DLÿmWҥRÿLӅu kiӋQKѭӟng dүn tôi thӵc nghiӋm nghiên cӭu tҥi BӋnh viӋn. Tôi xin trân trӑng cҧPѫQ3*676/r7Kӏ Thӫy Tiên ± Chӫ nhiӋm bӝ môn Công NghӋ Sinh Hӑc và các Thҫy Cô công tác tҥi bӝ P{QÿmKӛ trӧ, giҧng dҥy giúp tôi hoàn thành luұQYăQ Tôi xin trân trӑng cҧPѫQ%DQ*LiPÿӕc bӋnh viӋn Gia An 115, Ban Giám ÿӕc bӋnh viӋn Thӕng NhҩWĈӗQJ1DL%DQ*LiPÿӕFF{QJW\1DP.KRDÿmKӛ trӧ, cung cҩSFiFÿLӅu kiӋn thӵc nghiӋPÿӇ giúp tôi hoàn thành tӕWÿӅ tài. Cuӕi cùng, tôi xin gӱi lӡi cҧPѫQÿӃn nhӳQJQJѭӡLWKkQWURQJJLDÿuQKQKӳng QJѭӡi bҥn và nhӳQJQJѭӡLÿӗng nghiӋSÿmOX{QJҳn bó cùng tôi, là nguӗQÿӝng lӵc cho tôi tiӃp tөc phҩQÿҩu trong hӑc tұp và công tác. 7S+&0WKiQJQăP2021 Hӑc viên /kP7UXQJ7Uѭӣng TÓM TҲT LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ 3KѭѫQJSKiSÿһt vҩQÿӅ và chӑQKѭӟng nghiên cӭu xuҩt phát tӯ thӵc tiӉn vӅ hiӋn trҥng nhiӉm khuҭn bӋnh viӋQ ÿӅ tài áp dөng lҥi quy trình kӻ thuұt cӫa Yamamoto, nhҵm phát hiӋn gen blaOXA-23 mã hóa carbapenemase trên A. baumannii. Các sӕ liӋu công bӕ WURQJÿӅ WjLÿѭӧc hӑc viӋn cùng nhóm nghiên cӭu thӵc hiӋn trӵc tiӃp trên các mүu bӋnh phҭm cӫDQJѭӡi bӋnh tҥi BӋnh viӋn Gia An 115 và BӋnh viӋn Thӕng NhҩWĈӗQJ1DLÿk\OjFiFVӕ liӋu có tính thӵc tӃ và bám sát vào thӵc trҥng nhiӉm khuҭn tҥi bӋnh viӋQĈӅ WjLÿm khҷQJÿӏQKÿѭӧFSKѭѫQJSKiS/$03OjPӝt SKѭѫQJSKiSFKҭQÿRiQSKkQWӱ Fyÿӝ chính xác cao vӟLÿӝ ÿһc hiӋu là 100% và giӟi hҥn phát hiӋn là 10 CFU/mL cho viӋc phát hiӋn gen blaOXA-23. KӃt quҧ cӫDÿӅ WjLÿѭD ra mӭFÿӝ kháng Carbapemem trên A. baumannii là 7ÿk\OjPӝt tӹ lӋ khá cao, vì vұy cҫn có mӝt giҧi pháp nhanh chóng nhҵm kӏp thӡi phát hiӋQYjQJăQFKһn các nhóm vi sinh vұWÿDNKiQJWKXӕFĈk\FNJQJFKtQKOjPөFWLrXYjêQJKƭDFӫa viӋc thӵc hiӋn luұQYăQ ABSTRACT The method of questioning and choosing a research direction comes from the reality of hospital infections, the subject is applying Yamamoto's technical process to detect the gene blaOXA-23 encoding carbapenemase on A. baumannii. The data published in the topic, performed by the institute and the research team directly on patient samples at Gia An 115 Hospital and Thong Nhat Dong Nai Hospital, these are real data, and closely follow the infection situation at the hospital. The study confirmed that the LAMP method is a molecular diagnostic method with high accuracy with a specificity of 100% and a detection limit of 10 CFU/mL for the detection of the blaOXA-23 gene. The results of the study show that the level of resistance to Carbapemem on A. baumannii is 77.41%, this is a rather high rate, so a quick solution is needed to promptly detect and prevent groups of microorganisms drug resistance. This is also the aim and meaning of the thesis. LӠ,&$0Ĉ2$1 7{L[LQFDPÿRDQOXұQYăQlà công trình nghiên cӭu cӫa hӑc viên cùng nhóm nghiên cӭu, không sao chép cӫa ai do tôi tӵ nghiên cӭXÿӑc, dӏch tài liӋu, tәng hӧp và thӵc hiӋn. Nӝi dung lý thuyӃt trong luұQYăQKӑc viên có sӱ dөng mӝt sӕ tài liӋu tham khҧo và các công trình nghiên cӭu ÿmÿѭӧc công bӕ WUѭӟFÿk\&iFVӕ liӋu, FKѭѫQJWUuQKSKҫn mӅm và nhӳng kӃt quҧ trong luұQYăQOjWUXQJWKӵFYjÿѭӧc thӵc hiӋQÿӝc lұp bӣi hӑc viên và nhóm nghiên cӭu. Tác giҧ luұQYăQ /kP7UXQJ7Uѭӣng MӨC LӨC TӮ VIӂT TҲT DANH MӨC HÌNH VÀ BҦNG ĈҺT VҨ1Ĉӄ ........................................................................................................... 1 &+ѬѪ1*,7ӘNG QUAN .................................................................................... 4 1.1. Vi khuҭn Acinetobacter baumannii .................................................................. 4 1.1.1. Ĉ̿FÿL͋m sinh lý ................................................................................... 4 1.1.2. &˯FK͇ Jk\ÿ͡c...................................................................................... 5 Protein màng ngoài (Porin) ................................................................. 6 Y͇u t͙ phong t͗a t͇ bào (LPS, Capsule) .............................................. 7 Enzym ................................................................................................... 7 S̫n xṷt màng sinh h͕c ....................................................................... 7 1.1.3. &˯FK͇ kháng kháng sinh .................................................................... 8 Aminoglycoside .................................................................................... 9 Carbapenem ......................................................................................... 9 Fluoroquinolone ................................................................................ 10 Cephalosporin .................................................................................... 11 Sulbactam ........................................................................................... 11 Rifampicin .......................................................................................... 11 Tetracycline ........................................................................................ 11 Polymyxin ........................................................................................... 12 Gen kháng thu͙c ................................................................................ 12 1.1.4. Nhi͍m khu̱QOLrQTXDQYjWiFÿ͡ng lâm sàng cͯa A. baumannii .. 13 Nhi͍m khu̱Qÿ˱ͥng hô h̭p ............................................................... 13 Nhi͍m khu̱n máu .............................................................................. 13 Nhi͍m khu̱Qÿ˱ͥng ti͇t ni͏u ............................................................. 14 Viêm màng não .................................................................................. 14 1.2. Kháng sinh Carbapenem ................................................................................ 15 C̭u t̩o hóa h͕c ............................................................................................ 15 &˯FK͇ tác dͭng ............................................................................................ 16 Ph͝ tác dͭng ................................................................................................. 16 1.2.1. S͹ ÿ͉ kháng Carbapenem ͧ Acinetobacter baumannii ................... 16 &˯FK͇ phi enzym ............................................................................... 17 &˯FK͇ enzym ..................................................................................... 17 1.2.2. Các gen mã hóa carbapenemase ....................................................... 19 Insertion sequences ............................................................................ 19 Intergon .............................................................................................. 19 Resistance island ................................................................................ 19 Plasmid............................................................................................... 20 1.2.3. &iFSK˱˯QJSKiSSKiWKL͏n gen mã hóa carbapenemase ............... 20 3K˱˯QJSKiSNL͋u hình ...................................................................... 20 3K˱˯QJSKiSVLQKKyD ....................................................................... 21 3K˱˯QJSKiSVLQKK͕c phân t͵ .......................................................... 21 1.3. Kӻ thuұt LAMP ............................................................................................... 23 1.3.1. Khái ni͏m ........................................................................................... 23 1.3.2. &˯FK͇ cͯa LAMP .............................................................................. 23 1.3.3. Phát hi͏n s̫n pẖm cͯa LAMP ........................................................ 27 1.3.4. ˰XÿL͋m cͯa LAMP ........................................................................... 28 1.4. Các nghiên cӭu liên quan ............................................................................... 29 &+ѬѪ1*,,ĈӔ,7ѬӦ1*3+ѬѪ1*3+È31*+,Ç1&ӬU ....................... 31 2.1. ĈӕLWѭӧng nghiên cӭu...................................................................................... 31 2.2. 6ѫÿӗ tóm tҳWFiFEѭӟc thӵc hiӋn mөc tiêu nghiên cӭu............................... 32 2.2.1. 6˯ÿ͛ tóm t̷t mͭc tiêu 1 .................................................................... 32 2.2.2. 6˯ÿ͛ tóm t̷t mͭc tiêu 2 .................................................................... 33 2.3. ThӡLJLDQÿӏDÿLӇm nghiên cӭu ..................................................................... 34 2.4. Vұt liӋu nghiên cӭu ......................................................................................... 34 2.5. &iFSKѭѫQJSKiSQJKLrQFӭu ........................................................................ 35 2.5.1. M̳u b͏nh pẖm lâm sàng ................................................................. 35 2.5.2. 3K˱˯QJSKiSYLVLQK .......................................................................... 35 3K˱˯QJSKiSF̭y b͏nh pẖm trên th̩ch ........................................... 35 3K˱˯QJSKiSÿ͓QKGDQKYjNKiQJVLQKÿ͛ ........................................ 35 2.5.3. 3K˱˯QJSKiS[͵ lý m̳u .................................................................... 36 2.5.4. 3K˱˯QJSKiSWiFKFKL͇t DNA ........................................................... 37 2.5.5. 3K˱˯QJSKiSÿL͏n di trên gel ............................................................ 37 2.5.6. Thi͇t l̵p ph̫n ͱng và phát hi͏n s̫n pẖm cͯa LAMP ................... 38 2.5.7. Thi͇t l̵p ph̫n ͱng và phát hi͏n s̫n pẖm PCR ............................. 39 &+ѬѪ1*.ӂT QUҦ NGHIÊN CӬU............................................................. 41 3.1. KӃt quҧ khҧo sát mүu bӋnh phҭm lâm sàng ................................................. 41 3.2. KӃt quҧ ÿӏQKGDQKYLVLQKYjNKiQJVLQKÿӗ ................................................ 42 3.3. KӃt quҧ phát hiӋn gen mã hóa blaOXA-23 cӫa LAMP trên khuҭn lҥc .......... 44 3.4. ;iFÿӏnh giӟi hҥn phát hiӋn cӫa phҧn ӭng LAMP ...................................... 47 3.5. KӃt quҧ LAMP phát hiӋn gen blaOXA-23 trên mүu bӋnh phҭm lâm sàng .... 49 3.6. ĈiQKJLiWtQKKLӋu quҧ cӫa LAMP ................................................................ 50 3.7. Bàn luұn ........................................................................................................... 52 &+ѬѪ1*.ӂT LUҰN, KIӂN NGHӎ ............................................................. 56 4.1. KӃt luұn ............................................................................................................ 56 4.2. KiӃn nghӏKѭӟng phát triӇn cӫDÿӅ tài ......................................................... 57 TÀI LIӊU THAM KHҦO ..................................................................................... 59 TӮ VIӂT TҲT A.Baumannii Acinetobacter baumannii ABC Acinetobacter baumannii - calcoaceticus BIP Backward inner primer CHDL Carbapenem-K\GURO\]LQJFODVV'ȕ-lactamases CRAB Carbapenem resistance Acintobacter baumannii CRAB Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii FIP Forward inner primer ICU Intensive Care Unit LAMP Loop mediated isothermal amplification LB Loop primer backward LF Loop primer forward PBP Penicillin-binding proteins PCR Polymerase chain reaction VAP ventilator associated pneumonia WHO World Health Organization DANH MЌC HÌNH VÀ BϪNG Hình 1.1 Hình ҧnh A. baumannii Gѭӟi kính hiӇn vi Hình 1.2 Minh hӑa các yӃu tӕ quyӃWÿӏQKÿӝc lӵc cӫa A. baumannii Hình 1.3 Minh hӑDFѫFKӃ kháng kháng sinh cӫa A. baumannii Hình 1.4 Các nhóm kháng sinh Carbapenem Hình 1.5 &iFFѫFKӃ kháng Carbapenem ӣ A. baumannii Hình 1.6 &iFFDUEDSHQHPDVHÿѭӧc phát hiӋn ӣ A. baumannii Hình 1.7 Tәng hӧp chuӛi bә sung tӯ mӗi FIP trong LAMP Hình 1.8 Thay thӃ chuӛi bә sung tӯ mӗi F3 trong LAMP Hình 1.9 Tәng hӧp sӧLÿѫQWӯ mӗi FIP trong LAMP Hình 1.10 Tәng hӧp chuӛi DNA tӯ mӗi B3 và BIP trong LAMP Hình 1.11 &ѫFKӃ tҥo cҩu trúc dҥng vòng trong LAMP Hình 1.12 Phҧn ӭng LAMP khi sӱ dөng thêm Loop primer Hình 3.1 KӃt quҧ ÿLӇn hình nhuӝm Gram trên mүXÿjP Hình 3.2 KӃt quҧ ÿLӇn hình khuҭn lҥc mӑFWUrQP{LWUѭӡng BA, MC, CAHI Hình 3.3 KӃt quҧ ÿLӇQKuQKÿӏnh danh A. baumannii Hình 3.4 KӃt quҧ ÿLӇQKuQKNKiQJVLQKÿӗ cӫa A. baumanni Hình 3.5 Sӵ WKD\ÿәi màu sҳc trong tube phҧn ӭng LAMP Hình 3.6 Hình ҧQKÿLӋn di LAMP trên gel agarose 2% Hình 3.7 Giӟi hҥn phát hiӋn cӫa LAMP Hình 3.8 KӃt quҧ WUrQJHOÿLӋn di sҧn phҭm phҧn ӭng LAMP Hình 3.9 KӃt quҧ WUrQJHOÿLӋn di sҧn phҭm phҧn ӭng PCR Bҧng 2.1 Trình tӵ mӗi cho phҧn ӭng LAMP Bҧng 2.2 Trình tӵ mӗi cho phҧn ӭng PCR Bҧng 3.1 Tóm tҳt kӃt quҧ giӳa LAMP và PCR Bҧng 3.2 6RViQKÿһc tính cӫa LAMP và PCR 1 ĈҺT VҨ1Ĉӄ .KiQJNKiQJVLQKOjFѫFKӃ tiӃQKyDEuQKWKѭӡng cӫa vi sinh vұt (vi khuҭn, nҩPYLUXVYjNêVLQKWUQJÿѭӧFWK~Fÿҭy bҵng áp lӵc chӑn lӑc gây ra bӣi viӋc sӱ dөng và lҥm dөng kháng sinh. Sӵ liên quan giӳa viӋc sӱ dөQJNKiQJVLQKYjFѫFKӃ ÿӅ kháng cӫa vi khuҭQÿmÿѭӧc ghi nhұn tҥLFiFFѫVӣ FKăPVyFVӭc khӓe và trong cӝQJÿӗQJ&iFFѫFKӃ kháng kháng sinh mӟi nәi lên trên toàn cҫXOjPÿHGӑDÿӃn viӋFÿLӅu trӏ các bӋnh nhiӉm khuҭn, dүQÿӃQOjPWăQJWKӡi gian nҵm viӋQWăQJWӹ lӋ tӱ YRQJYjWăQJFKtSKtÿLӅu trӏ cӫDQJѭӡi bӋnh [1]+ѫQQӳa, vi khuҭn sinh sӕng ӣ WUrQQJѭӡLÿӝng vұt và hӋ sinh thái xung quanh, vì vұy chúng có thӇ WUDRÿәi gen NKiQJNKiQJVLQKFKRQKDXĈLӅu cҫn thiӃt là phҧi hiӇXÿѭӧFFѫFKӃ kháng kháng sinh cӫa vi khuҭQWURQJFiFP{LWUѭӡQJNKiFQKDXÿӇ giҧm thiӇXWiFÿӝng cӫa chúng ÿӃn sӭc khӓHFRQQJѭӡLYjÿѭDUDELӋQSKiSQKDQKFKyQJÿӇ kiӇm soát sӵ lây lan cӫa chúng. Tӯ nhӳQJ QăP  Wҫm quan trӑng vӅ mһt lâm sàng cӫa vi khuҭn Acinetobacter baumannii ÿm ÿѭӧc báo cáo, A. baumannii NKiQJ NKiQJ VLQK FNJQJ ÿѭӧc nhҳFÿӃn lҫQÿҫXYjRQăP[2]. A. baumannii là mӝt tác nhân gây bӋQKFѫ hӝLÿDVӕ các chӫng A. baumanni ÿӅu là chӫng kháng thuӕc, gây trӣ ngҥLYjWăQJFKL phí cho viӋFÿLӅu trӏ, HiӋp hӝi bӋnh truyӅn nhiӉm Hoa KǤ ÿm[Ӄp A. baumannii là mӝt trong nhӳQJQJX\rQQKkQKjQJÿҫu gây nhiӉm khuҭn bӋnh viӋn [3]. Các chi Acinetobacter thuӝc hӑ Moraxellaceae và bao gӗm ít nhҩWORjLÿѭӧc mô tҧ, vӟi A. baumannii là có liên quan nhiӅu nhҩW ÿӃn lâm sàng [4]. A. baumannii gây nhiӉm khuҭn trên các bӋnh lý: nhiӉm khuҭQÿѭӡng hô hҩp, nhiӉm khuҭn huyӃt, nhiӉm khuҭn niӋu, nhiӉm khuҭQÿѭӡng tiêu hóa, nhiӉm khuҭn da và các mô mӅP«FKLӃm tӹ lӋ 2% - 10% cӫa nhóm vi khuҭn Gram âm gây nhiӉm khuҭn bӋnh viӋn, chӫ yӃu xuҩt hiӋn trên nhóm QJѭӡi bӋnh có tình trҥng bӋnh nһQJÿһc biӋWOjWURQJFiFÿѫQYӏ hӗi sӭFÿһc biӋt (ICU) [2]+ѫQQӳa, nhiӉm A. baumannii WURQJFiFFѫVӣ y tӃ có thӇ làm WăQJWӹ lӋ tӱ vong tӯ 8% - 40% (theo WHO, 2017). 2 &DUEDSHQHPÿѭӧF[HPOjÿyQJYDLWUzWKLӃt yӃu trong liӋu pháp kháng khuҭn trên toàn thӃ giӟi, chúng có phә kháng khuҭn rӝng nhҩt cӫa nhóm kháng sinh betaODFWDP&DUEDSHQHPWKѭӡQJÿѭӧc xem là kháng sinh cuӕLFQJGjQKFKRQKyPQJѭӡi bӋnh bӏ các vҩQÿӅ vӅ nhiӉm khuҭn nһng. GҫQÿk\WKӵc trҥng vi khuҭn kháng lҥi &DUEDSHQHPÿm[Xҩt hiӋQYjJLDWăQJQKDQKFKyQJ7ә chӭc y tӃ thӃ giӟi :+2ÿm ÿѭD UD  QKyP YL NKXҭn có mӭF ÿӝ kháng Carbapenem cao nhҩt là: Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeugrinosa, Acinetobacter baumannii [5]. Acinetobacter baumannii kháng lҥi Carbapenem bҵng cách sҧn xuҩt enzym carbapenemase có khҧ QăQJWKӫy phân Carbapenem [6], các gen kháng Carbapenem WKѭӡQJÿѭӧc sinh ra trên plasmid, cho phép chúng lây lan nhanh chóng tӟi các nhóm vi khuҭn và khu vӵc khác nhau [7]. Các gen blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 thuӝc nhóm D ȕ-lactamases và gen blaNDM-1 thuӝFQKyP%ȕ-lactamases là các gen kháng &DUEDSHQHP ÿmÿѭӧc sàng lӑc tӯ A. baumannii, gen blaOXA-23 chiӃm tӹ lӋ 97.7% trong các chӫng A. baumannii kháng Carbapenem [8]. Vì vұy, cҫn xây dӵng mӝt SKѭѫQJSKiSWӕLѭXFKRYLӋc sàng lӑc nhanh gen có tӹ lӋ cao kháng Carbapenem trên QJѭӡi bӋQKYjQJѭӡLOjQKPDQJJHQÿLӅu này sӁ giúp tiӃt kiӋm chi phí và hӛ trӧ tӕt cho viӋFÿLӅu trӏ lâm sàng. Có rҩt nhiӅXSKѭѫQJSKiSFKҭQÿRiQWiFQKkQJk\EӋnh khác QKDXWURQJÿy ÿDSKҫn là các kӻ thuұt nuôi cҩ\[iFÿӏnh hình thái hӑc vүQÿѭӧc sӱ dөng nhiӅu, tuy nhiên nhӳng kӻ thuұWQj\WKѭӡng mҩt nhiӅu thӡi gian, phӭc tҥSÿӝ chính xác không cao. Kӻ thuұt LAMP khҳc phөFÿѭӧc hҫu hӃt nhӳQJQKѭӧFÿLӇm cӫDFiFSKѭѫQJ SKiSWUѭӟFÿk\WUrQWKӃ giӟLÿmFyKjQJWUăPEӝ NLWÿѭӧc xây dӵng dӵa trên kӻ thuұt Qj\Ĉӕi vӟi ViӋW1DPÿk\OjPӝWKѭӟQJÿLPӟi nhҵm xây dӵng mӝWSKѭѫQJSKiS chҭQÿRiQQKDQKYjFKtQK[iFFiFWiFQKkQJk\EӋnh, góp phҫn làm giҧm thiӇu bӋnh, nâng cao sӭc khoҿ cӝQJÿӗng. Tӯ nhӳng thӵc trҥng trên, chúng tôi thӵc hiӋQÿӅ WjL³3hát hiӋn gen mã hóa carbapenemase trên chӫng Acinetobacter baumannii bҵng kӻ thuұW/$03´Yӟi hai mөc tiêu: 3 1. Áp dөQJTX\WUuQK/$03ÿmÿѭӧc công bӕ bӣi Norihisa Yamamoto và cӝng sӵ [9] ÿӇ phát hiӋn tӹ lӋ gen mã hóa carbapenemase blaOXA-23 trên khuҭn lҥc Acinetobacter baumannii phân lұp tӯ mүu bӋnh phҭm lâm sàng. 2. ĈiQKJLiÿӝ nhҥ\ÿӝ ÿһc hiӋu cӫa kӻ thuұt LAMP trong viӋc phát hiӋn gen mã hóa carbapenemase blaOXA-23 trên Acinetobacter baumannii trong các mүu bӋnh phҭm lâm sàng. KӃt quҧ nghiên cӭu cӫDÿӅ WjLGQJOjPFѫVӣ ÿӇ xây dӵng kӻ thuұt LAMP cho viӋc phát hiӋn gen kháng kháng sinh trên nhiӅu chӫng vi khuҭn khác nhau. Tӯ ÿyFyWKӇ ӭng dөng kӻ thuұt LAMP QKѭPӝt công cө cho viӋc giám sát các chӫng vi khuҭn kháng thuӕc tҥi cáFFѫVӣ y tӃ. 4 &+ѬѪ1*,7ӘNG QUAN 1.1. Vi khuҭn Acinetobacter baumannii 1.1.1. Ĉ̿FÿL͋m sinh lý Acinetobacter baumannii là vi khuҭn Gram âm, hiӃX NKt NK{QJ GL ÿӝng, không lên men, oxidase (-FDWDODVHKjPOѭӧng Guanin - Cytosine (G-C) trong trình tӵ DNA tӯ 39% - 47% [10] và là mӝt mҫm bӋnh FѫKӝi quan trӑng vӅ nhiӉm khuҭn bӋnh viӋn. A. baumannii có thӇ tӗn tҥi trên bӅ mһt rҳQYjNK{ÿӃn 5 tháng, khҧ QăQJSKiWWULӇn trong phҥm vi rӝng cӫa nhiӋWÿӝ và pH, có mӭFÿӝ NKiQJFDRÿӕi vӟi kháng sinh và chҩt khӱ khuҭn, có khҧ QăQJWҥo màng sinh hӑc giúp bám dính tӕt trên các thiӃt bӏ y tӃ [5]. NhiӉm khuҭn A. baumannii WKѭӡng là mҳc phҧi sau khi tiӃp xúc vӟLP{LWUѭӡng y tӃ bӏ ô nhiӉm, hoһc tiӃp xúc trӵc tiӃp vӟi các dӏch vө FKăPVyFVӭc khӓHNK{QJÿҧm bҧo và nhân viên y tӃ ÿmPDQJPҫm bӋnh tӯ WUѭӟc [11]. Các nguyên QKkQNKiFOLrQTXDQÿӃn nhiӉm khuҭn lâm sàng cӫa A. baumannii là: khҧ QăQJÿӅ kháng tӵ nhiên cao, sӵ ÿLӅu chӍnh bҧn thân kháng lҥi các yӃu tӕ bҩt lӧi tӯ P{LWUѭӡng bên ngoài [12]. Hình 1.1: Hình ̫QK$EDXPDQQLLG˱ͣi kính hi͋n vi (ngu͛n Wikimedia) ViӋc sӱ dөQJFiFSKѭѫQJSKiSSKkQWӱÿһc biӋt là lai DNA-'1$ÿmÿѭӧc sӱ dөQJÿӇ thiӃt lұp danh tính cӫa ít nhҩt 33 loài khác nhau cӫa Acinetobacter [13]. Trong sӕ các loài này, Acinetobacter calcoaceticus (genospecies 1), Acinetobacter baumannii (genospecies 2), Acinetobacter genomic species 3 (genospecies 3) và Acinetobacter genospecies 13TU, chia sҿ ÿһF ÿLӇm kiӇu hình giӕng nhau, khiӃn ch~QJ NKy ÿѭӧc phân biӋt trên lâm sàng. Phӭc hӧp Acinetobacter baumannii - 5 calcoaceticus (ABC) dӉ bӏ nhҫm lүn khi nhұn dҥQJJk\NKyNKăQFKRYLӋFÿLӅu trӏ, YuFiFORjLQj\FyÿһFÿLӇm kiӇu hình gҫQWѭѫQJÿӗQJQKѭQJNKiFQKDXYӅ ÿһc tính sinh hӑc, bӋnh lý. A. baumannii JHQRVSHFLHVÿҥi diӋQFKRêQJKƭDOkPVjQJQKLӅu nhҩt cӫa phӭc hӧp, trong khi A. calcoaceticus (genospecies 1) là mӝt mҫm bӋnh tӯ P{LWUѭӡng hiӃPNKLÿѭӧc xem là nguyên nhân gây ra bӋnh nһng [14]. A. baumannii, A. pittii và A. nosocomialis vүQFzQNKy[iFÿӏnh trong hҫu hӃt các phòng thí nghiӋPFK~QJÿҥi diӋn cho 3 loài Acinetobacter FyOLrQTXDQÿӃn lâm sàng nhiӅu nhҩt [15]. Mӝt dҩu hiӋu sinh hӑFÿiQJWLQFұ\ÿӇ [iFÿӏnh A. baumannii là gen blaOXA-51 nҵm trên nhiӉm sҳc thӇ và thӇ hiӋn sӵ thӫy phân yӃX ÿӕi vӟi Carbapenem [16]. 1.1.2. &˯FK͇ Jk\ÿ͡c Trong nhӳQJQăPJҫQÿk\FiFSKѭѫQJSKiSWLӃp cұQOLrQTXDQÿӃn mô hình kiӇu gen, kiӇu hình, khҧ QăQJJk\EӋQKÿmJL~S[iFÿӏQKÿѭӧc các yӃu tӕ ÿӝc lӵc cӫa A. baumannii [2]. Vӟi khoҧQJQKyPJHQÿѭӧF[iFÿӏQKFyOLrQTXDQÿӃQÿӝc lӵc, chӭng tӓ rҵng A. baumannii ÿmGjQKPӝt phҫQÿiQJNӇ gen cӫa mình cho quá trình sinh bӋnh [17]. Các nghiên cӭu có hӋ thӕQJÿmNK{QJ[iFÿӏQKÿѭӧc mӝt yӃu tӕ ÿӝc lӵc cө thӇ cӫa A. baumannii WUrQOkPVjQJTXDQÿLӇm này làm nәi bұt lên tính thích ӭng mҥnh mӁ cӫa A. baumannii ÿӕi vӟLFѫWKӇ vұt chӫ YjWiFQKkQP{LWUѭӡng [18]. 6 Hình 1.2: Minh h͕a các y͇u t͙ quy͇W ÿ͓QK ÿ͡c l͹c cͯa A. baumannii: AceI: Acinetobacter chlorhexidine efflux protein; CpaA: glycan-specific adamalysin-like protease; Csu: chaperon/usher pilus system; LPS: lipopolysaccharide; Omp: outer membrane protein; PNAG: poly-ȕ-1,6-N-acetylglucosamine; T2SS: type II secretion system; T6SS: type VI secretion system. (ngu͛n Antibiotics 2020, 9, 119) Protein màng ngoài (Porin) Các protein màng ngoài cӫa vi khuҭn Gram âm nói chung có vai trò quan trӑQJWURQJWѭѫQJWiFYjWKtFKQJKLYӟLP{LWUѭӡng, là nhӳng nhân tӕ FKtQKJk\ÿӝc lӵc [19]. Protein màng ngoài chính OmpA cӫa A. baumannii tham gia vào quá trình xâm nhұp tӃ bào và quá trình apoptosis, protein 38 kDa này rҩt quan trӑQJÿӕi vӟi sӵ xâm nhұp cӫa chҩt tan nhӓ, nó liên kӃt vӟi bӅ mһt tӃ bào chӫ, khu trú trong cҧ ty thӇ và nhân, gây chӃt tӃ bào [20]. Mӝt loҥi protein màng ngoài khác cӫa A. baumannii là protein Omp 33 - 36 kDa hoҥWÿӝQJQKѭPӝt kênh dүQQѭӟc và biӇu hiӋn cӫDFK~QJOLrQTXDQÿӃn khҧ QăQJ NKiQJ Oҥi Carbapenem [21]. Trong mӝt nghiên cӭu cho thҩy các chӫng A. baumannii bӏ thiӃu Omp 33 - 36 kDa có tӕFÿӝ phát triӇn kém, giҧm khҧ QăQJEiP dính, xâm nhұSYjJk\ÿӝc cho tӃ EjRĈLӅu này cho thҩy Omp 33 - 36 kDa có vai trò quan trӑQJÿӕi vӟi thӇ trҥQJYjÿӝc lӵc cӫa A. baumannii [21]. 7 GiӕQJQKѭ2PS- N'D&DU2FNJQJÿyQJPӝt vai trò trong viӋc kháng Carbapenem ӣ A. baumannii. Sӵ biӇu hiӋQWăQJOrQFӫa CarO làm chұm sӵ xâm nhұp cӫa bҥch cҫu trung tính ӣ phәi thông qua sӵ suy giҧm các phҧn ӭng tiӅn viêm trong khí quҧn và phәi, cho phép vi khuҭn sinh sôi và dүQÿӃn viêm phәi nһng [22]. Y͇u t͙ phong t͗a t͇ bào (LPS, Capsule) Trong các mҫm bӋnh Gram âm ӣ QJѭӡi, polysaccharide cӫa thành tӃ bào (LPS) là mӝt trong nhӳng yӃu tӕ ÿӝc lӵc. LPS rҩt quan trӑQJÿӇ kháng huyӃt thanh QJѭӡLEuQKWKѭӡng và mang lҥi lӧi thӃ cҥQKWUDQKÿӇ sӕQJ[yWWURQJFѫWKӇ sӕng, LPS FNJQg có thӇ tҥo ra phҧn ӭng tiӅn viêm ӣ FiFP{ÿӝng vұt [23]. Mӝt yӃu tӕ quyӃWÿӏQKÿӃn cҩu trúc tӃ EjRÿӕi vӟLÿӝc lӵc cӫa A. baumannii là sӵ hiӋn diӋn cӫa Capsule bao quanh bӅ mһt vi khuҭQ&iFÿѫQYӏ glucose lһSÿL lһp lҥLÿyQJJyLFKһt chӁ cӫa Capsule tҥo ra mӝt rào cҧn chӕng lҥLFiFÿLӅu kiӋn bҩt lӧi cӫDP{LWUѭӡng, cӫa hӋ thӕng miӉn dӏch và mӝt sӕ chҩt kháng khuҭn [24], [25]. Enzym 3KRVSKROLSDVHÿѭӧc biӃWÿӃn là các yӃu tӕ ÿӝc lӵc bә sung cӫa A. baumannii, ÿk\OjQKӳng enzym thӫy phân quan trӑng và có hoҥt tính phân giҧi mӥ chӕng lҥi các phospholipid cӫa màng tӃ EjR QJѭӡi. Trong khi enzym phospholipase D giúp A. baumannii tӗn tҥi trong huyӃWWKDQKQJѭӡi, thì mӝt enzym khác là phospholipase C lҥLJk\ÿӝc cho tӃ bào biӇu mô [26]. GҫQÿk\HQ]\P&SD$Pӝt protease giӕQJDGDPDO\VLQÿһc hiӋu vӟi glycan, ÿѭӧF[iFÿӏnh là mӝt yӃu tӕ ÿӝc lӵc có tác dөng ӭc chӃ ÿ{QJPiXWK{QJTXDYLӋc bҩt hoҥt yӃu tӕ ;,,'Rÿy&SaA làm giҧm sӵ hình thành huyӃt khӕi trong các vӏ trí nӝi mҥFKWK~Fÿҭy khҧ QăQJSKә biӃn cӫa A. baumannii [27]. S̫n xṷt màng sinh h͕c Trong sӕ tҩt cҧ các yӃu tӕ quyӃWÿӏQKÿӝc lӵc, sӵ hình thành màng sinh hӑFÿm trӣ thành mӝWÿһFÿLӇm sinh bӋnh chính cӫa A. baumannii, làm cho sinh vұt này có khҧ QăQJNKiQJÿDWKXӕc. Màng sinh hӑc giúp vi sinh vұt có khҧ QăQJFKӕng lҥi các 8 WiFQKkQErQQJRjLQKѭFKҩt khӱ khuҭn, thanh thҧi hӋ thӕng miӉn dӏch và kháng sinh [28], màng sinh hӑFFzQOjPWUXQJJLDQFKRFiFWѭѫQJWiFJLӳa mҫm bӋnh và vұt chӫ. Màng sinh hӑc cӫa A. baumannii FzQÿѭӧFÿһFWUѭQJEӣi sҧn xuҩt các protein liên kӃW%DS$EWѭѫQJWӵ QKѭSURWHLQ%DSFӫa Staphylococcus aureus, và có khҧ QăQJ tұp hӧSÿӇ xây dӵng ma trұn màng sinh hӑc nhҵPÿiSӭng vӟLFiFÿLӅu kiӋn môi WUѭӡQJFăQJWKҷng [29]. Mһc dù hҫu hӃt các chӫng A. baumannii ÿѭӧc giҧi trình tӵ ÿӅu mang gen Bap, QKѭQJQKLӅu chӫQJGѭӡQJQKѭÿmOjPELӃQÿәi trình tӵ Bap. Tuy nhiên, các protein giӕQJ%DSQKѭ%/3%/3FyWKӇ ÿѭӧc mã hóa bӣi mӝt sӕ chӫng A. baumannii, và giúp hình thành màng sinh hӑFQKѭ%DS$E[30]. Mӝt yӃu tӕ ÿiQJFK~êNKiFJL~SA. baumannii tҥo ra màng sinh hӑc là sҧn xuҩt exopolysaccharide poly-ȕ-1,6-NDFHW\OJOXFRVDPLQH31$*ÿӇ duy trì tính toàn vҽn cӫa màng sinh hӑc A. baumannii Gѭӟi giӟi hҥn chҩWGLQKGѭӥQJYjP{LWUѭӡQJFăQJWKҷng [31]. 1.1.3. &˯FK͇ kháng kháng sinh A. baumannii ÿѭӧFÿһFWUѭQJEӣi tính kháng nӝi tҥi vӟi nhiӅu nhóm kháng sinh (glycopeptides, macrolides, lincosamides, streptogramins) [32], A. baumannii có thӇ phát triӇQÿӇ kháng lҥi tҩt cҧ các nhóm kháng vi khuҭQÿѭӧc sӱ dөng trong ÿLӅu trӏ4XiWUuQKQj\FyOLrQTXDQÿӃQFiFWKD\ÿәi vӅ di truyӅn, dүQÿӃn biӃQÿәi màng tӃ bào, biӇu hiӋn quá mӭc cӫDFѫFKӃ Efflux pump, biӇu hiӋn quá mӭc cӫDFѫ chӃ kháng nӝi tҥLWKD\ÿәi các vӏ WUtÿtFKFӫa tác nhân kháng khuҭn. A. baumannii WăQJFѭӡng áp lӵc chӑn lӑc bӣLP{LWUѭӡng nhiӉm khuҭn trong bӋnh viӋQÿLӅu này có thӇ WăQJWtQKNKiQJWK{QJTXDQKӳQJWKD\ÿәLÿӝt biӃQFNJQJQKѭFKX\Ӈn gen ngang vӟi các thành viên khác trong loài. 9 Hình 1.3: Minh h͕DF˯FK͇ kháng kháng sinh cͯa A. baumannii: AME: Aminoglycoside modifying enzymes; AmpC: Ambler class C cephalosporinases; ESBL: Extended VSHFWUXPȕ-la ctamases; MBL: Metallo-ȕ-lactamases; LPS: Lipopolysaccharide; PBP: Penicillin binding protein. (ngu͛n Antibiotics 2020, 9, 119) Aminoglycoside Aminoglycoside liên kӃt vӟi RNA 16S cӫa tiӇXÿѫQYӏ 30S trong ribosome, FѫFKӃ ÿӅ kháng vӟi loҥLNKiQJVLQKQj\ÿѭӧc nghiên cӭu nhiӅu nhҩt ӣ các chӫng A. baumannii là sҧn xuҩWFiFHQ]\PÿLӅu chӍnh aminoglycoside. Ba nhóm chӭFQăQJ khác nhau cӫD FiF HQ]\P ÿLӅu chӍQK ÿm ÿѭӧc biӃW ÿӃn: aminoglycoside acetyltransferase [33], aminoglycoside phosphotransferase [34] và aminoglycoside adenililtransferase [35]. ViӋc sҧn xuҩt RNA 16S ribosome methyltransIHUDVH ÿһc biӋt là ArmA, loҥL51$ÿҫXWLrQÿѭӧc phát hiӋn trong mӝt chӫng phân lұp lâm sàng, là mӝWFѫFKӃ ÿӅ kháng vӟi các aminoglycoside mӟi xuҩt hiӋn [36]. Các chӫng A. baumannii tҥo ra ArmA có khҧ QăQJ ÿӅ kháng cao vӟi Gentamicin, Amikacin và Tobramycin [37]. Carbapenem Carbapenem có phә rӝng nhҩt trong sӕ tҩt cҧ FiFȕ-lactam và chӫ yӃXÿѭӧc sӱ dөQJÿӇ ÿLӅu trӏ các bӋnh nhiӉm khuҭn do vi khuҭn Gram âm gây ra [38]. Sӵ biӇu