Tài liệu Phân tích cấu trúc của một số hợp chất giữa betulin với 1,2 diaminobenzene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯƠNG PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT GIỮA BETULIN VỚI 1,2-DIAMINOBENZENE LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Thái Nguyên – 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƯƠNG PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT GIỮA BETULIN VỚI 1,2-DIAMINOBENZENE Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH Thái Nguyên - 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và TS. Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Hóa Dược và các em sinh viên phòng Hóa Dược đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K10B1 – lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè đồng nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hương a MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................a MỤC LỤC ..................................................................................................................... b DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. d DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................e DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ f DANH MỤC SƠ ĐỒ ..................................................................................................... g PHỤ LỤC ....................................................................................................................... h MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................2 1.1. Giới thiệu về Betulin .......................................................................................... 2 1.2. Một số chuyển hóa của betulin............................................................................. 3 1.3. Histon deacetylase và dẫn chất benzamide .......................................................... 7 1.4. Phương pháp phân tách và phân lập các hợp chất ............................................... 8 1.4.1. Phương pháp chiết hai pha lỏng...................................................................... 9 1.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .................................................................................. 9 1.4.3. Sắc ký cột thường.......................................................................................... 10 1.4.4. Phương pháp kết tinh lại ............................................................................... 11 1.5. Phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất.................................................... 11 Chương 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 12 2.1. Hóa chất và thiết bị............................................................................................. 12 2.1.1. Hóa chất và dung môi ................................................................................... 12 2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc.............................................................................. 12 2.1.3. Xác định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được..................................... 13 2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc một số sản phẩm chuyển hóa của betulin .. 13 2.2.1. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 25a-b ............................................. 13 2.2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 26a-b ............................................. 15 b Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 17 3.1. Phân tích và xác định cấu trúc các hợp chất 25a-b ............................................ 18 3.2. Phân tích và xác định cấu trúc các hợp chất 26a-b ............................................ 22 KẾT LUẬN .................................................................................................................. 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 29 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1-PL c DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C Nuclear Magnetic Resonance) 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic Resonance) IR Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy) MS Phổ khối lượng va chạm điện từ (Electron Impact-Mass Spectrometry) δH, δC Ppm s Độ dịch chuyển hóa học của proton và cacbon Phần triệu (parts per million) Singlet dd Double doulet m Multiplet t Triplet DMF Dimetyl formamide TMS Tetrametyl Silan (chất chuẩn) EtOAc h DMAP BOP Etylaxetat Giờ 4-dimetylaminopyridine Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimetylamino)phosphoniumhexafluorophosphat Et3N Trietylamin DCM Diclometan d DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào ......................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất CI-994, MS-275 và MGCD-103 ........................... 8 Hình 3.1. Cấu trúc của một số dẫn xuất este của betulin ................................................ 17 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 25a-b ........... 20 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 26a-b ........... 23 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 26a ........................................................................ 24 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất 26b ........................................................................ 24 Hình 3.6. Phổ 13C-NMR của hợp chất 26a ....................................................................... 26 Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của hợp chất 26b ....................................................................... 26 e DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Một số tín hiệu đặc trưng khung lupan trong các hợp chất 25a-b .............. 21 Bảng 3.2. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 1H-NMR của hợp chất 26a-b ..................... 23 Bảng 3.3. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 13C-NMR của các hợp chất 26a-b .............. 25 f DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. 1. Phản ứng betulin và anhydrit 2,2-dimethylsuccinic ..................................... 4 Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp một số este của betulin và axit nicotinic ......................................... 5 Sơ đồ 1. 3. Tổng hợp một số este của betulin với các axit cacboxylic thơm ................... 6 Sơ đồ 1. 4. Tổng hợp một số dẫn xuất amit-este-C-28 của betulin ................................... 7 Sơ đồ 3.1. Chuyển hóa nhóm OH của C-28 của betulin thành chức este ....................... 18 Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các hợp chất lai của betulin với 1,2-diaminobenzene ................... 18 Sơ đồ 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của betulin với các anhydride axit ......................... ...19 Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các dẫn xuất của của betulin với 1,2-diaminobenzene ................ 22 g PHỤ LỤC PHỔ PHỤ LỤC PHỔ ......................................................................................................... 1-PL PL1: Phổ IR của Betulin.......................................................................................... 1-PL PL2: Phổ 1H-NMR của Betulin ............................................................................... 2-PL PL3: Phổ 1H-NMR của chất 26a ............................................................................. 3-PL PL4: Phổ 13 C-NMR của chất 26a .......................................................................... 4-PL PL5: Phổ MS của chất 26a ..................................................................................... 5-PL PL6: Phổ 1H-NMR của chất 26b ............................................................................. 6-PL PL7: Phổ giãn 1H-NMR của chất 26b ..................................................................... 7-PL PL8: Phổ 13 C-NMR của chất 26b ........................................................................... 8-PL PL9: Phổ MS của chất 26b ...................................................................................... 9-PL PL10: Phổ IR của chất 26a .................................................................................... 10-PL PL11: Phổ IR của chất 26b .................................................................................... 11-PL h MỞ ĐẦU Chúng ta đều biết ung thư là căn bệnh nguy hiểm, gây tỉ lệ tử vong cao. Các thuốc điều trị ung thư thường hướng tới đích là các protein như các protein kinase phụ thuộc cyclin, protein gây ung thư Bcl-2, P53, histon deacetylase (HDAC), STAT.....[1]. Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là các histon deacetylase (HDAC). Nghiên cứu về HDAC đã xác định hoạt động bất thường của HDAC liên quan đến nhiều bệnh unh thư. Vì vậy các chất ức chế HDAC đang là các tác nhân đầy triển vọng. Dẫn chất benzamide là chất ức chế HDAC tốt được các nhà nghiên cứu trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều do cấu trúc phức tạp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh. Phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ. Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng. Mỗi phương pháp cho phép xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Hợp chất betulin và các sản phẩm chuyển hóa của chúng có cấu trúc phức tạp trong không gian do chứa nhiều nhóm chức và các đồng phân khác nhau. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc của một số hợp chất giữa betulin với 1,2-diaminobenzene”. Đây là đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. 1 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về Betulin Betulin hay 20(29)-lupene-3β,28-diol (1), lần đầu tiên được phân lập vào năm 1788 từ loài Betula alba (Betulaceae), là một trong các hợp chất thiên nhiên phổ biến thuộc nhóm tritecpenoit khung lupan. Trong tự nhiên, betulin được tìm thấy ở nhiều loài thực vật, nhiều nhất là trong thành phần vỏ cây bạch dương (chiếm tới 30% trọng lượng khô của dịch chiết từ vỏ của loài B. verrucosa). Một lượng betulin cũng được tìm thấy ở nhựa của loài cây này [2] và được phát hiện có nhiều hoạt tính như hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào ung thư da, ung thư não và nhiều dòng tế bào ung thư ở người [6-8] và hoạt tính chống HIV [911]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng betulin có khả năng ức chế sự trưởng thành của các Protein điều tiết sterol (SREBPs) [3]. Sự ức chế SREBPs của betulin làm giảm sinh tổng hợp cholesterol và axit béo. Trong thử nghiệm lâm sàng, betulin cải thiện tình trạng béo phì do chế độ ăn uống gây ra, làm giảm lượng lipid trong huyết thanh và các mô, và làm tăng độ nhạy của insulin [24-27]. Hơn nữa, betulin giảm kích thước và cải thiện sự ổn định của mảng xơ vữa động mạch. Do tính sẵn có và là một tritecpenoit thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt nên betulin được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu các dẫn xuất của betulin trong đó có nhiều dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học cao, nhiều hợp chất được nghiên cứu lâm sàng [6-8,23]. 2 Hình 1.1. Một số dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào Rất nhiều dẫn xuất của betulin được tổng hợp và kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng cho thấy nhiều dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào rất tốt (hợp chất 1, 2). Nghiên cứu trên nhiều dẫn xuất este của betulin, Kommera và các cộng sự nhận thấy nếu giữ nhóm OH tự do ở C-3 và este hóa nhóm OH ở C-28 (1 và 2) thì hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất có xu hướng tăng mạnh. Bên cạnh đó, các dẫn xuất este hóa nhóm OH ở C-3 và giữ nhóm OH tự do ở C-28 có hoạt tính tốt hơn betulin nhưng giảm mạnh so với các dẫn xuất C-28 (hợp chất 3 và 4) [5]. Việc nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất có hoạt tính gây độc tế bào của betulin vẫn đang là mối quan tâm của các nhà khoa học. 1.2. Một số chuyển hóa của betulin Phân tử betulin có hai nhóm chức OH liên kết với C-3 và C-28 và một nối đôi ∆ 20(29) của nhánh isopropylenyl tại C-19. Đây là các trung tâm hoạt động rất dễ bị chuyển hóa hoặc thay thế trong các phản ứng hóa học mà vẫn giữ được 3 khung tritecpen, do vậy khả năng chuyển hóa của betulin rất phong phú. Việc chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 hoặc C-28 của hợp chất betulin đem lại các dẫn xuất có hoạt tính sinh học. Sơ đồ 1. 1. Phản ứng betulin và anhydrit 2,2-dimethylsuccinic Các chuyển hóa chính của betulin thu được dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt như chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 hoặc OH ở C-28. Điển hình là các chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 thành các este với một số diaxit cacboxylic như hợp chất 6-9. Bốn đồng phân của 3,28-di-O-(dimethylsuccinyl)-betulin đã được tổng hợp và thử hoạt tính chống HIV với dòng HIV-1 trong các tế bào lympho H9. Trong đó đồng phân 3-O-(3',3'-dimethylsuccinyl)-28-O-(2",2"- dimethylsuccinyl)-betulin (hợp chất 6) là hợp chất có hoạt tính chống HIV mạnh nhất với giá trị EC50 là 0,00087 μM và giá trË TI là 42.400 (sơ đồ 1.1) [11]. Năm 2010, nhà khoa học người Nga Oxana B. Kazakova và các cộng sự đã nghiên cứu chuyển hóa hai nhóm OH ở vị trí C-3 và C-28 của betulin qua 4 một loạt các phản ứng để tạo thành các dẫn xuất este, trong đó các dẫn xuất este với axit nicotinic 12 và 13 có hoạt tính kháng lại chủng virut ung thư cổ tử cung HPV-11. Riêng hợp chất 12 còn thể hiện hoạt tính bảo vệ gan, chống loét, chống viêm, hoạt tính điều hòa miễn dịch và hoạt tính kháng HIV (sơ đồ 1.2) [15]. Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp một số este của betulin và axit nicotinic Một số dẫn xuất este của betulin và các axit cacboxylic thơm tương ứng được tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn. Trong đó hợp chất 17 và 20 thể 5 hiện hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều dòng vi khuẩn với đường kính vô khuẩn từ 10 – 13 mm (sơ đồ 1.3) [16]. Sơ đồ 1. 3. Tổng hợp một số este của betulin với các axit cacboxylic thơm Nhiều dẫn xuất amit-este-C-28 của betulin được tổng hợp và nghiên cứu thử hoạt tính chống ung thư trên các dòng tế bào ung thư ở người như MGC-803 (ung thư dạ dày), PC3 (ung thư tiền liệt tuyến), Bcap-37 (ung thư biểu mô cổ tử cung), A375 (ung thư da), và MCF-7 (ung thư vú). Kết quả cho thấy, một số dẫn xuất (hợp chất 22 và 24a-d) thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC50 từ 4-18 μM. Hợp chất 24c chứa nhóm piperidin trong nhóm chức amit thể hiện hoạt tính tốt nhất tương ứng các giá trị IC50 đối với 5 dòng tế bào kể trên lần lượt là 4,3 μM; 4,5 μM; 5,2 μM; 7,5 μM, và 5,2 μM (sơ đồ 1.4) [6]. 6 Sơ đồ 1. 4. Tổng hợp một số dẫn xuất amit-este-C-28 của betulin 1.3. Histon deacetylase và dẫn chất benzamide Trong cơ thể, histon deaxetylase (HDAC) là nhóm các enzym xúc tác cho quá trình deaxetyl hoá nhóm ε-N axetyl lysine amino axit ở phần đuôi của histon. Người ta đã chứng minh được trong nhiều tế bào ung thư có sự huy động quá mức các enzym HDAC, gây nên hiện tượng giảm sự axetyl hoá của histon. Kết quả của quá trình này là ngăn cản quá trình phiên mã 7 thông qua việc đóng xoắn nhiễm sắc thể. Những năm gần đây, các chất ức chế enzym HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Dẫn chất benzamide có tác dụng ức chế HDAC in vitro và vivo được công bố năm 1999 bởi suzuki và cộng sự thuộc công ty dược Mitsui [35]. Nhóm này bao gồm một số chất MS-275, CI-994, MGCD-103 (hình 1.2). MS-275 và CI-994 [37-40] đang được thử nghiệm lâm sàng ở pha 2. MS275 làm giảm sự acetyl hóa quá mức của histon trong nhiều loại ung thư, giảm sự biểu thị quá múc của p21WAFI/CIPI và gelsolin. CI-994 là 4acetylamino-N-(2’–aminophenyl ) benzamide, đã được chứng minh có tác dụng trên tế bào ung thư ở người và chuột. Nghiên cứu in vitro cho thấy CI994 có tác dụng thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình trên các tế bào lympho chuột. Ưu điểm lớn của CI-994 là thuốc chống phân bào đường uống [18-20, 36] Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất CI-994, MS-275 và MGCD-103 1.4. Phương pháp phân tách và phân lập các hợp chất Để phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các phương pháp chiết, các phương pháp chiết hai pha rắn – lỏng, chiết hai pha lỏng – lỏng, các phương pháp sắc ký phân tích như sắc ký lớp mỏng (TLC), các phương pháp sắc ký điều chế như sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C), sắc ký cột pha đảo (RP-CC) và các phương pháp kết tinh chọn lọc. 8 1.4.1. Phương pháp chiết hai pha lỏng Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ). Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước. Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ,… 1.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng trên silicagel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ. Vì sự phân tích TLC trên silicagel là một quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột. Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả. Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel tráng sẵn DCAlufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silicagel là 0,2 mm. Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng. Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp (1 mg/ml), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 μl). Dung môi triển khai: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và chưng cất lại trước khi sử dụng. Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích. Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều nhau rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy bằng, có nút nhám kín đến chiều cao 0,5 cm. Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng. Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với tuyến xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm. Dùng kẹp sắt đưa 9 nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc ký, đậy kín nắp, để yên và quan sát. Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản mỏng. Phát hiện vệt chất trên bản mỏng: Bản mỏng được phun các thuốc hiện FeCl3/EtOH 5% và vanillin/H2SO4 đặc 1%, sau đó được hơ nóng ở 1200C, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất. 1.4.3. Sắc ký cột thường Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Cột sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách. Chấp hấp phụ dùng cho CC là silicagel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 63-200 m và 40-63 m. Dung môi hữu cơ dùng cho sắc ký cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng. Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt: Một lượng silicagel ứng với cột sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là 30 cm được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexan khan. Bột nhão này được đuổi hết bọt khí và được nhồi vào cột sắc ký. Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silicagel hoàn toàn ổn định. Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silicagel: Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp. Trộn dung dịch thu được với silicagel (cỡ hạt 40-63 m) với tỷ lệ là 1 g chất /1,2 g đến 1,5 g silicagel. Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silicagel. Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silicagel. Triển khai sắc ký cột: Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silicagel khoảng 2 mm. Cho từ từ mẫu tẩm trên silicagel lên cột. Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú 10