Tài liệu Phân tách sắc tố cà chua chín, cà rốt và đu đủ chín bằng sắc kí bản mỏng

1 MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA ....................................................................................................... LỜI NÓI ðẦU ............................................................................................................. LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. MỤC LỤC ................................................................................................................. 1 PHẦN MỞ ðẦU ....................................................................................................... 5 PHẦN NỘI DUNG .................................................................................................... 7 Chương 1 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về cà chua ............................................................................................... 7 1.1.1 Thành phần hóa học......................................................................................... 7 1.1.2 Dược tính quả cà chua chín.............................................................................. 8 1.2. Sơ lược về cà rốt................................................................................................... 8 1.2.1. Thành phần hóa học........................................................................................ 9 1.2.2. Dược tính của cà rốt........................................................................................ 9 1.3. Sơ lược về ñu ñủ chín ..........................................................................................10 1.3.1.Thành phần hóa học........................................................................................11 1.3.2.Dược tính của ñu ñủ chín ................................................................................11 1.4. Sơ lược về licopen và β – Caroten ......................................................................11 1.4.1. β – Caroten ..................................................................................................12 1.4.2. Licopen.........................................................................................................13 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 2 1.5. Sơ lược về sắc kí 1.5.1 Sơ lược về lịch sử phát triển sắc kí..................................................................14 1.5.2. Sắc kí bản mỏng ............................................................................................15 1.5.2.1 Nguyên tắc sắc kí bản mỏng.....................................................................15 1.5.2.2 Các chất hấp phụ dùng trong sắc kí bản mỏng..........................................16 1.5.2.3 Dung môi khai triển .................................................................................17 1.5.3.Sắc kí cột ........................................................................................................18 1.5.3.1 Nguyên tắc sắc kí cột ...............................................................................19 1.5.3.2 Các chất hấp phụ và dung môi trong sắc kí cột........................................19 Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Thu mẫu cà chua, cà rốt, ñu ñủ chín......................................................................21 2.2.Tiến hành tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín 2.2.1 Hóa chất và dụng cụ......................................................................................21 2.2.2 Tóm tắt qúa trình tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín........................21 2.2.3 Chuẩn bị dịch các chất màu............................................................................22 2.2.4 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chưa tinh khiết ....................................................................................23 2.2.4.1 Chạy sắc kí bản mỏng với mẫu cà chua chín ........................................23 2.2.4.2 Chạy sắc kí bản mỏng với mẫu cà rốt .....................................................25 2.2.4.3 Chạy sắc kí bản mỏng với mẫu ñu ñủ chín ..............................................26 2.2.5 Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten.......................................26 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 3 2.2.5.1 Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch cà chua chín ......................................................................................................26 2.2.5.2 Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch cà rốt ........27 2.2.5.3 Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch ñu ñủ chín...........................................................................................................27 2.2.6 Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà chua cà rốt, ñu ñủ chín bằng sắc kí bản mỏng ................................................................28 2.2.6.1 Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà chua chín bằng sắc kí bản mỏng ................................................................................28 2.2.6.2 Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà rốt bằng sắc kí bản mỏng ..............................................................................29 2.2.6.3 Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch ñu ñủ chín bằng sắc kí bản mỏng.......................................................................29 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chạy sắc ký bản mỏng dịch chưa tinh khiết ..........................................................30 3.1.1 Chạy sắc ký bản mỏng dịch cà chua chín .......................................................30 3.1.2 Chạy sắc ký bản mỏng dịch cà rốt .................................................................31 3.1.3 Chạy sắc ký bản mỏng dịch ñu ñủ chín ..........................................................32 3.2 Kết quả chạy sắc ký cột ....................................................................................... 33 3.3 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn tách ra từ sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ..................................................................................34 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 4 3.3.1 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng phân ñoạn 1
phân ñoạn 8 tách ra từ sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ..........................................35 3.3.2 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn 9
phân ñoạn 10 tách ra từ sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ..........................................36 3.3.3 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn 11
phân ñoạn 15 tách ra từ sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ..........................................37 3.4 Hướng phát triển...................................................................................................38 PHẦN KẾT LUẬN ...................................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................42 PHỤ LỤC...................................................................................................................... PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 5 PHẦN MỞ ðẦU 1. Lí do chọn ñề tài Cà chua, cà rốt, ñu ñủ là những loại cây rất gần gũi và quen thuộc ñối với chúng ta, là loại thực phẩm không thể thiếu trong thực ñơn hằng ngày, là những loại cây ngắn ngày sinh trưởng và phát triển tốt ở vùng khí hậu cận nhiệt ñới, nước ta có nhiều ñiều kiện thích hợp cho chúng sinh trưởng và phát triển. Chúng là loại rau quả có màu sắc ñặc trưng và hấp dẫn ñó là màu ñỏ hoặc cam. Vậy màu ñỏ hoặc cam ñó chứa những chất gì và có công dụng như thế nào? Theo các nhà khoa học nghiên cứu thì sắc ñỏ hoặc cam ñó chứa hai hợp chất hữu cơ chủ yếu là β – Caroten và licopen. Hai hợp chất này có cùng công thức phân tử khác nhau về màu sắc và công thức cấu tạo, β – Caroten có màu vàng da cam còn licopen có màu ñỏ. Chúng là hai hợp chất có giá trị dinh dưỡng, giá trị y học rất cao: chống lão hóa, ngừa tim mạch, ngăn ngừa ung thư phổi, giúp sáng mắt, phương thuốc kỳ diệu chữa bệnh cao huyết áp…ñặc biệt cung cấp các nguyên tố vi lượng canxi, sắt, natri,… và các vitamin A, C, E, chất xơ, prôtêin, chất béo,… Vì vậy vấn ñề ñặt ra là làm sao có thể biết ñược có licopen và β – Caroten trong sắc tố cà chua, cà rốt, ñu ñủ chín là một ñề tài thu hút nhiều sự quan tâm của mọi người. Vì vậy chúng tôi chọn ñề tài “phân tách sắc tố cà chua chín, cà rốt và ñu ñủ chín bằng sắc kí bản mỏng” với mục ñích rèn luyện kĩ năng thực nghiệm, mặt khác có thể hiểu thêm về phương pháp sắc kí ñặc biệt là sắc kí cột và sắc kí bản mỏng, giúp nâng cao sự hiểu biết về vai trò của thí nghiệm hóa học ñối với công nghệ sinh học. 2. Mục tiêu của ñề tài: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp và phân tách ñược sắc tố β – caroten và licopen có trong cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín bằng sắc kí cột ñồng thời kiểm tra lại bằng sắc kí bản mỏng. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu: − Tiến hành thực nghiệm tách chất màu của cà chua chín PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 6 − Tiến hành thực nghiệm tách chất màu của cà rốt − Tiến hành thực nghiệm tách chất màu của ñu ñủ chín 4. Phương pháp nghiên cứu: − Phương pháp nghiên cứu tổng hợp tài liệu − Phương pháp thực nghiệm − Phương pháp ñối chiếu, so sánh 5. ðối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu: − Tách sắc tố của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín − Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín bằng sắc kí cột và kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 7 PHẦN NỘI DUNG Chương 1 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về quả cà chua [ 7] Cà chua tên khoa học là Lycopersicon esculentum Mill, thuộc họ cà cây thảo hàng năm, gồm hai loại sinh trưởng có hạn và sinh trưởng vô hạn, cao 1m hay hơn. Thân mọng nước, có lông mềm dính. Lá có cuống, mọc so le, xếp lông chim không ñều hay xếp lông chim 2 lần, dài 10 – 40 cm, lá chét thay ñổi, hình trứng hay hình trứng mũi mác, mép có răng. Hoa thành chùm xim ở nách lá, ñài 5 – 8 thùy dài khoảng 12mm, tràng hoa màu vàng cam, dài 10 – 15mm. Quả mọng màu ñỏ hay vàng, có kích thước và hình dạng thay ñổi, trong chứa chất dịch chua ngọt và nhiều hạt dẹt. Bộ phận dùng: quả Nơi sống và thu hái: cà chua gốc ở Peru, ñược nhập trồng vào nhiều xứ nhiệt ñới. Cà chua ñược ñưa vào trồng ở nước ta cuối thế kỷ 19 ở các tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ và một số tỉnh vùng cao. Cây ưa nóng (22 – 240C), thích hợp cho thời kỳ ra quả là ban ngày 250C, ban ñêm 15 – 200C. 1.1.1. Thành phần hóa học của cà chua: Thành phần Hàm lượng (%) Nước 90 % Gluxít 4% Protit 0.3 % Lipit 0.3 % Chất xơ 5.4 % Cacbonhydrat 1.9 % Protein 2.1 % Licopen và β- caroten Canxi 0.6 % PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 8 Sắt 3.1 % Vitamin C 39.2 % Vitamin E 1.6 % Các amino axit và các axit hữu cơ Hàm lượng ít 1.1.2. Dược tính của quả cà chua: Cà chua vị ngọt chua, tính mát, có công dụng thanh nhiệt, giải khát, dưỡng âm và làm mát máu thường ñược dùng ñể chữa những bệnh phiền khát, môi khô họng khát do vị, hoa mắt chóng mặt, chảy máu cam, chảy máu chân răng tiêu hóa kém, loét dạ dày, huyết áp cao. Nghiên cứu hiện ñại cho thấy cà chua giàu nguyên tố vi lượng. Chất tomatin trong cà chua có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn, vi nấm, vitamin P rất có ích cho việc phòng chống cao huyết áp. Y học hiện ñại nghiên cứu và cho rằng sắc tố licopen trong quả cà chua có tính chống oxy hóa cao, lycopen và caroten khi vào cơ thể người sẽ chuyển hóa thành vitamin A. Do ñó dùng cà chua sẽ tránh bệnh khô mắt, quáng gà… 1.2. Sơ lược về cà rốt [8] − Cà rốt thuộc họ hoa tán − Cà rốt là loại cây thảo sống 2 năm. Lá cắt thành bản hẹp. Hoa tập hợp thành tán hẹp, trong mỗi tán, hoa ở chính giữa thì không sinh sản và màu tía, còn các hoa sinh sản ở chung quanh thì màu trắng hay hồng. Hạt cà rốt có vỏ gỗ và lớp lông cứng che phủ − Bộ phận dùng: củ − Cà rốt là một trong những loại rau trồng rộng rãi nhất và lâu ñời nhất trên thế giới. người La Mã gọi cà rốt là nữ hoàng của các loại rau. Cà rốt ñược trồng nhiều ở nước ta. Hiện nay các vùng rau của nước ta ñang trồng phổ biến 2 loại có củ to nhỏ không ñều, lõi to, nhiều xơ, hay phân nhánh, kém ngọt. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 9 1.2.1. Thành phần hóa học: Thành phần Hàm lượng(%) Nước 88.5 Protit 1.5 Gluxít 8.8 Xenlulo 1.2 Chất tro 0.8 ðường (fructozơ, glucozơ) 50 Vitamin (C, D, E, B) Axit amin Hàm lượng ít Muối khoáng (K, Na, Ma, Cu.....) 1.2.2. Dược tính của cà rốt: − Củ cà rốt có vị ngọt cay, tính hơi ấm có tác dụng hạ khí bổ trung, yên ngũ tạng, tăng tiêu hóa, kèm khoan khoái trong bụng. − Hạt có vị ñắng cay, tính bình có tác dụng sát trùng, tiêu ích − Củ cà rốt ñược dùng làm thuốc uống trị suy nhược (rối loạn sinh trưởng, thiếu chất khoáng, còi xương, sâu răng, …) trị thiếu máu, bệnh trực tràng coli, viêm ruột non kết, bệnh ñường ruột, dự phòng các bệnh nhiễm trùng, ñề phòng sự lão hóa và các vết nhăn… − Thành phần quan trọng nhất trong cà rốt là caroten. Các caroten khi vào cơ thể người mới chuyển thành vitamin A nên ñược coi là tiền sinh tố A, nó có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học tương tự vitamin A nhưng ở người nó dự trữ ở khắp các mô còn vitamin ñược dự trữ ở gan. Một số nhà khoa học khuyến cáo nên dùng caroten. 1.3. Sơ lược về ñu ñủ chín [9] − ðu ñủ còn có tên Phan Qua Thụ, Mắc Hung (Lào), Cà Lào, Phiên Lộc − Tên khoa học Carica papaya L, họ ñu ñủ. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 10 − Là loại cây cao 6 – 7 m, thân ñứng thẳng có phân nhánh hoặc không phân nhánh, vỏ mang nhiều sẹo của cuống lá. Lá chỉ có nhiều ở ngọn, lá chia 6 – 7 thùy, hình trứng, mép có răng cưa không ñều. Lá to, cuống rỗng dài 30 – 50 cm, gân lá hình chân vịt. − Hoa màu trắng nhạt hay xanh, mọc ở kẻ lá. Hoa cái có tràng nhiều hơn tràng của hoa ñực mọc thành chùm ở kẻ lá. Cụm hoa ñực phân nhánh nhiều, cụm hoa cái chỉ có 2 ñến 3 hoa. Sau 1 tháng hoa thụ phấn. Lá mang hoa rụng sẽ ñể lại sẹo trên cây. Quả thịt dầy mọng, ở giữa rỗng có nhiều hạt hình trứng. − ðu ñủ không chịu ñược xứ lạnh, thích hợp với ñất khô xốp, nhiều mùn, phát triển rất tốt ở vùng nhiệt ñới. 1.3.1. Thành phần hóa học: − Trong ñu ñủ chín có 19 loại carotenoit chủ yếu cryptoxanthin (48%), beta caroten (30%), cryptoflavine (13%). − Có thể tóm tắt thành phần hóa học của 100g ñu ñủ chín: Thành phần Nước Vitamin A Hàm lượng (g; mg; mcg; calo) 90 (g) 125 (mcg) Canxi 40 ( mg) Năng lượng 36 (calo) Vitamin B1 20 (mcg) Photpho 32 (mg) Protein 1,0 (g) Vitamin B2 20 (mcg) Kali 221 (mg) Lipit 0,1 (g) PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 11 Niacin Sắt 400 (mcg) 2,6 (mg) Cacbonhydrat 7,7 (g) Vitamin C 64 (mg) Kẽm 6,4 (mg) 1.3.2. Dược tính của ñu ñủ chín: − Hoa ñu ñủ ñực tươi hoặc phơi khô hấp với ñường phèn dùng chữa ho, mất tiếng. − Nước sắc lá ñu ñủ dùng ñể rửa vết thương, vết loét. Lá ñu ñủ thái nhỏ với thóc dùng chữa bệnh biếng ăn cho bò, ngựa. − Rễ ñu ñủ ñược dân gian sắc làm thuốc cầm máu − ðu ñủ chín làm món ăn có tác dụng bồi bổ cơ thể và giúp tiêu hóa tốt các chất thịt, chất lòng trắng trứng. − Trong ñu ñủ có chứa nhiều β-caroten (tiền vitamin A) từ 1000 – 2100 mcg | 100g ñược ñưa vào cơ thể sẽ ñược chuyển thành vitamin A. Cơ thể con người là một bộ máy tuyệt vời, β-caroten chỉ chuyển hóa thành vitamin A ñúng nhu cầu, β-caroten không chuyển hóa khi cơ thể có ñủ vitamin A. 1.4. Sơ lược về licopen và β-caroten [6],[7],[8],[9],[10] − Licopen và β-caroten gọi chung là carotenoit là những hợp chất có màu phân bố rộng rãi trong giới ñộng vật và thực vật. − Licopen và β-caroten thuộc hợp chất xanthophylle − Có nhiều phương pháp ñể làm sáng tỏ cấu trúc carotenoit là : + Hydro hóa + Cộng hợp halogen, clorua iot hoặc cộng oxy ñể xác ñịnh các nối ñôi. + Oxi hóa với axit cromic các nhóm metyl mạch nhánh thành các nhóm cacbonyl . PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 12 1.4.1 β – caroten: − Có công thức phân tử C40H56 − Công thức cấu tạo − β-caroten thuộc loại hợp chất không no − Tan trong các dung môi không phân cực hoặc kém phân cực như ete dầu hỏa, n- hexan, heptan. − ðiểm nóng chảy: 181 – 1830C − ðược phát hiện từ những năm 1830 và ñược biết như nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể. − β-caroten ngăn chặn các gốc tự do có tác hại ñến cơ thể và do ñó ngăn ngừa ñược các bệnh mãn tính liên quan ñến các gốc tự do như bệnh ung thư, bệnh tim mạch. − Từ xưa người ta cho rằng ăn rau quả sống sẽ cung cấp nhiều vitamin hơn là nấu chín, thực ra ñiều này chỉ ñúng với các vitamin tan trong nước, còn ñối với β-caroten là chất tan trong dầu và ñược bao bọc bởi các bao sợi cơ của tế bào rau quả nên việc nấu chín sẽ giúp giải phóng nhiều β-caroten hơn. Kể từ năm 1980 các nhà dinh dưỡng nhận thấy β-caroten không chỉ ñơn thuần là tiền vitamin A mà β-caroten còn ñược biết là một chất chống oxi hóa tế bào và chức năng này hoàn toàn ñộc lập với cơ thể cung cấp vitamin A. 1.4.2. Licopen: − Công thức phân tử C40H56 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 13 − Công thức cấu tạo: − Cũng giống như β- caroten, licopen tan trong các dung môi không phân cực hoặc kém phân cực như ete dầu hỏa, heptan, n – hexan. − Về công thức của licopen là một chuỗi dài cấu trúc phân tử gồm có 13 nối ñôi, lycopen ñược kiểm nghiệm là rất hữu hiệu trong việc ngăn chặn các oxygen ñơn trong cơ thể của con người một cách rất hiệu quả. − Là một trong 600 hợp chất carotenoit nhưng lại là chất có hiệu quả trong chống ung thư phổi, dạ dày, trực tràng. − Trong quả cà chua màu ñỏ licopen thường ñược tập trung ở vỏ, khi nấu chín cà chua mới giải phóng ñược licopen. Vì vậy khi ăn cà chua chín không nên ăn sống mà phải nấu chín và ăn cả vỏ. − Ngoài ra nó là carotenoit duy nhất có khả năng ngừa ñược chứng nhồi máu cơ tim và bảo vệ gan khỏi bị tổn thương. Licopen là một carotenoit cơ thể con người không thể tự tổng hợp ñược mà phải lấy từ thức ăn. 1.5. Sơ lược về sắc kí 1.5.1. Sơ lược về lịch sử phát triển sắc kí [3] − Năm 1903 nhà khoa học Nga Mikhail TsVet ñã dùng cột nhôm oxit tách thành công các picmen của lá cây xanh thành các vùng màu riêng biệt. Ông ñã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp thụ khác nhau của sắc tố và ñặt tên phương pháp này là phương pháp sắc kí vì ñã tách ñược những chất có màu. Tuy nhiên phát minh của TsVet gần như lãng quên trong một thời gian dài. Mãi ñến năm 1931 sau khi Vinterstin và PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 14 Lederer dùng phương pháp của TsVet tách caroten thô thành β-caroten và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương diện ñiều chế, phương pháp sắc kí mới bắt ñầu ñược chú ý ñúng mức và phát triển nhanh chóng. − Năm 1938, Izmailov và Shraiber ñặt nền móng ñầu tiên cho sắc kí lớp mỏng và sau ñó những công trình của Stahl ñã làm cho sắc kí lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi. − Năm 1941 sắc kí phân bố ra ñời khi Martin và Synge ñề xuất tách không phải theo ái lực của các cấu tử ñối với chất hấp thụ mà do sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn. Các tác giả trên ñã phát triển một dạng mới của sắc kí phân bố: sắc kí giấy.Vào những năm 1941 – 1942 Martin ñã làm một bước ngoặc lớn trong sắc kí do dùng sắc kí giấy tách thành công các ancaloit chiết ñược từ các cây thuốc. − Năm 1952 Martin công bố công trình ñầu tiên về sắc kí khi dựa trên sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha ñộng là chất khí. Chỉ trong vài ba chục năm, sắc kí khí ñã ñạt ñược nhiều thành tựu tuyệt vời và hiện nay là một trong những phương pháp hiệu nghiệm nhất về phân tích hỗn hợp các chất ñặc biệt là các chất hữu cơ. 1.5.2. Sắc kí bản mỏng [2].[3],[4]. − Sắc kí bản mỏng hay còn gọi là sắc kí phẳng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng. Trong ñó pha ñộng là chất lỏng ñược ñi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này ñược tráng thành một lớp mỏng, ñều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Do chất hấp thụ ñược tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này ñược gọi là phương pháp sắc kí lớp mỏng (hay sắc kí bản mỏng) − Trước ñây sắc kí bản mỏng chủ yếu dùng trong phân tích ñịnh tính, nhưng từ năm 1966 ñã áp dụng sang phân tích ñịnh lượng do những tiến bộ của kĩ thuật làm tăng tính lặp lại và ñộ chính xác. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 15 − Trong thời gian gần ñây, nhờ sử dụng tổ hợp sắc kí bản mỏng với các phương pháp phân tích có ñộ nhạy cao như cực phổ, ñộng học xúc tác, huỳnh quang… sắc kí bản mỏng ñược phát triển thêm một bước. 1.5.2.1. Nguyên tắc [1],[4]. − Bản mỏng ñược chuẩn bị sẵn là loại bản có thể tự tráng hoặc mua loại có sẵn trên thị trường, sau ñó chấm mẫu phân tích (mẫu ñã ñược hòa tan trong một dung môi dễ bay hơi sau ñó dùng vi quản ñể chấm) lên bản mỏng, chấm thành một vết nhỏ gọn, sấy nhẹ ñể ñuổi phần dung môi hòa tan mẫu, khi ñó mẫu chất chỉ còn lại bột khô trên tấm lớp mỏng. ðặt tấm bản mỏng theo chiều thẳng ñứng trong bình có chứa sẵn dung môi phù hợp. Do tác dụng của lực mao quản dung môi thấm theo bản mỏng qua ñiểm xuất phát. Sau ñó các vết sẽ ñược xác ñịnh bằng phương pháp vật lý (nhìn bằng mắt, soi dưới ñèn tử ngoại…) bằng phương pháp hóa học (phun lên tấm bảng các loại dung môi thuốc thử). − Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn có giá trị Rf không ñổi trong một dung môi xác ñịnh. − Các yếu tố ảnh hưởng ñến Rf + Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ + Bề dày của lớp mỏng + Chất lượng và ñộ tinh khiết của pha ñộng + ðộ bão hòa của dung môi trong bình sắc kí + Lượng mẫu ñưa lên bản mỏng 1.5.2.2. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký bản mỏng [2] Trong sắc kí bản mỏng thông thường người ta dùng các chất hấp thụ sau: silicagen, nhôm oxit, xenlulo, tinh bột, nhựa trao ñổi ion…ngoài ra còn dùng các chất hấp thụ biến tính khác. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 16 Bảng 1.1: Các chất hấp thụ dùng trong sắc kí lớp mỏng (SKLM) (sắp xếp theo Stahl ) Chất hấp thụ Silicagen ðộ axit Hoạt năng Cơ chế Hấp thụ và Công dụng Axit Có Kiềm Có Phân bố Steorid Magie photphat Yếu Hấp thụ Carotenoit, tocopherol Caxihydroxit Yếu Hấp thụ Tocopherol Yếu Hấp thụ Tocopherol Fe(OH)3 Có Hấp thụ Chất phân cực Than Có Hấp thụ Chất không phân cực Oxit nhôm Canxi sunfat Kiềm phân bố Cho tất cả các hợp chất 1.5.2.3. Dung môi khai triển: Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi và thuốc thử khác nhau. Bảng1.2: Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất tự nhiên Hợp chất Chất hấp thụ Hệ dung môi Thuốc thử màu CHCl3 − MeOH (9 :1) CHCl3 − axeton − MeOH − NH 3 Ankaloic SiO2G (20 : 20 : 3 :1) CHCl3 − ETOAC − MeOH (20 : 20 :1) Hơi I2 Benzen − ETOAC − Dietyla min (7 : 2 :1) PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com hiện 17 n − Butanol − ACOH − H 2O (4 :1: 5) n − Butanol − EtOH − NH 4 OH Saponin SiO2G (7 : 2 : 5) CHCl3 − MeOH − H 2 O(61: 32 : 7) EtOAC − MeOH − H 2O (100 :17 :13) Vanillin | H3PO4 SbCl3 | CHCl3 H2SO4 CHCl3 − MeOH (9 :1)Genin Caroten Ete dầu hỏa – toluen – axeton SiO2G Hơi I2 (45: 1: 5) Tinh dầu SiO2G Benzen − EtOAC (95 : 5) Benzen − MeOH (95 : 5) I 2 , H 2 SO4 H 3 PO4 EtOAC − MeOH − H 2 O Tanin SiO2G Flavonit SiO2G (100 :17 :13) Toluen − EtOAC − MeOH (4 : 3:1) Toluen – Etyl fomiat – axit formol (5:4:1) FeCl3 MeOH 10%(H2O) 1.5.3. Sắc kí cột [2],[3],[4]. − Sắc kí cột là một phương pháp hiện ñại, tinh vi ñể tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp của chúng. Nếu lựa chọn ñúng các ñiều kiện người ta có thể tách hầu hết các chất bất kì một hỗn hợp nào. Nhưng phương pháp mất nhiều thời gian nên chỉ sử dụng khi tách các chất trong hỗn hợp mà các phương pháp khác không làm ñược − Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng tách ra gồm: + Lựa chọn chất hấp thụ + Sự lựa chọn dung môi giải li PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 18 + Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp thụ, lượng mẫu ñược dùng + Vận tốc giải li − Trong sắc kí cột sự tách xảy ra ở ranh giới rắn – lỏng, trong ñó pha ñộng là chất lỏng, pha tĩnh là các chất rắn ở trạng thái xốp, mịn. Thông thường các hợp chất phân cực bị hấp phụ mạnh hơn các chất không phân cực bởi các chất hấp phụ phân cực. Sự hấp phụ các chất phân cực trong môi trường không phân cực mạnh hơn trong môi trường phân cực do sự cạnh tranh giữa chất tan và các phân tử của dung môi. − Lực hấp thụ bao gồm các loại sau ñây: + Lực Vande Van + Lực cảm ứng + Hấp phụ hóa học + Liên kết hiñro 1.5.3.1. Nguyên tắc [1] − Cột ñược rửa sạch sấy khô. Cột là một ống thủy tinh dưới ñáy có một robinet khóa, cột ñược bắt vào giá ở vị trí thẳng ñứng dưới có một bình hứng, dưới ñáy cột ñược lót một lớp bông gòn dày 2 – 3 mm. Sau ñó tiến hành nhồi cột, có hai cách nhồi, nhồi sệt hoặc nhồi khô. Khi ñã cho chất hấp phụ hết vào cột theo một trong hai phương pháp trên tiếp tục cho dung môi chảy ngang qua chất hấp phụ liên tục trong một thời gian ñể giúp cho việc nạp cột ñược chặt chẽ, trong quá trình này không ñược ñể cột khô. ðể ổn ñịnh sau khoảng 5 – 10 giờ mới sử dụng. − Sau khi cột ñã ổn ñịnh cho mẫu chất cần phân tích vào cột, nếu mẫu chất là chất lỏng cần làm bay hơi ñến khô rồi hòa tan trở lại trong dung môi, nếu mẫu là chất rắn hòa tan mẫu vào dung môi lượng dung môi là tối thiểu. Mở khóa cột hạ mực dung môi ñến sát mực chất hấp phụ ñang có trong cột, dùng một ống nhỏ giọt cho mẫu vào ñầu PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 19 cột mở khóa cho dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp thụ tiến hành như vậy ñến khi cho hết mẫu vào cột. Tiến hành thêm dung môi vào rửa cột sau khi cho một lớp bông gòn ñặt nhẹ lên mặt thoáng của chất hấp phụ. Tiến hành quá trình giải li. 1.5.3.2. Các chất hấp phụ và dung môi trong sắc kí cột[2] Bảng 1.3: Các dung môi và chất hấp phụ dùng trong sắc kí cột Hợp chất phân tích Gluxit Dung môi Chất hấp phụ Nước, ancol Isopropylic, Than hoạt tính, nhôm oxit, ancol butylic, ñioxan, ete dầu silicagen hỏa, benzen, clorofom Vitamin Ete dầu hỏa, benzen, nước… Nhôm oxit, Ca(OH)2, MgO Cacbon tetraclorua, ete dầu Tecpen hỏa,n-hexan, benzen, ete Nhôm oxit etylic, axeton, ancol metylic, etyl axetat, clorofom Ancaloit Nước, benzen, clorofom.. Nhôm oxit, silicagen PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com 20 CHƯƠNG 2: TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 2.1. Thu mẫu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín: Cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ñược thu mua tại chợ Tân Tịch vào lúc sáng sớm. Cà chua lựa loại quả chín ñỏ, ñặc ruột, ít hạt. Cà rốt lựa củ căng bóng, tươi màu da cam. ðu ñủ loại quả chín to trái. 2.2. Tiến hành tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín 2.2.1. Hóa chất và dụng cụ: Hóa chất Dụng cụ − Etanol 960 − Phễu thủy tinh − Tinh thể iot − Ống ñong; Cốc; Ống nghiệm − Toluen − Phễu chiết; Giấy lọc; bông gòn − Axeton − Bình hút ẩm; Bình lọc chân không − Ete dầu hỏa − Mao quản ñường kính 1,5-1,6 mm − Al2O3 − Lọ penicilin − Cột sắc kí kích thước 50cm, ñường kính15cm 2.2.2. Tóm tắt quá trình tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín: Công việc Thời gian 28/10 29/10 30/10 31/10 1/11 3/11 Thu mẫu và xử lý mẫu cà chua chín bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể bay hơi 12 giờ Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu cà chua thu ñược Thu mẫu và xử lý mẫu cà rốt bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể bay hơi 12 giờ Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu cà rốt thu ñược Thu mẫu và xử lý mẫu ñu ñủ chín bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể bay hơi 12 giờ Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu ñu ñủ chín thu ñược PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: http://www.docudesk.com