Tài liệu Phân lập và xác định đặc tính enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------***-------- NGUYỄN THỊ THU HÀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------***-------- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Hoàng Hoa Long HÀ NỘI - 2015 2 MỞ ĐẦU Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột. Khoai tây có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, được người Pháp đưa vào Việt Nam từ năm 1890. Có thời kỳ khoai tây được xem là cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô. Khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất, caronoids và phenol tự nhiên. Khoai tây không chỉ là lương thực mà còn là dược phẩm. Một nhà khoa học của Viện Thực phẩm Anh mới đây phát hiện trong khoai tây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp nếu ăn thường xuyên. Trong một nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada đã phát hiện thấy trong khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư và một số bệnh khác. Theo thông tin của Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Việt Nam là quốc gia có khả năng phát triển mạnh khoai tây, nhiều nhất ở đồng bằng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên, với diện tích ước tính 200.000 ha. Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng khoai tây chỉ đạt 30.000-35.000 ha, với năng suất 10-11 tấn/ha. Một trong những nguyên nhân dẫn đến giảm năng suất và diện tích trồng khoai tây là do tình trạng gây hại của sâu bệnh, đặc biệt là bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia gây ra, phổ biến nhất là loài Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc). Bệnh gây ra chủ yếu trên các loài cây trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà, họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, một số loài hoa lan… Bệnh gây hại cho cây từ khi còn được trồng ở ngoài đồng ruộng cho đến khi thu hoạch và bảo quản trong kho. Đặc biệt khi điều kiện thời tiết nóng ẩm và mưa nhiều thì bệnh trở nên trầm trọng hơn. Vi khuẩn Ecc sử dụng Quorum Sensing (QS) như một cơ 3 chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm soát gen liên quan đến tính độc và các hoạt động của tế bào vi khuẩn. Trong cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò như các chất tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu được tổng hợp và tiết ra trong suốt quá trình phát triển của vi khuẩn. Khi nồng độ phân tử AHLs tăng lên cùng với sự phát triển của quần thể vi khuẩn và đạt đến một ngưỡng nhất định (quorum level), AHLs sẽ gây ra những hiệu ứng kiểu hình thông qua việc điều hòa sự biểu hiện gen đích, mà ở vi khuẩn gây bệnh Ecc là gen quy định tính độc đối với cây chủ. Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không mang lại hiệu quả cao, đặc biệt là việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đang gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản và môi trường sống của con người. Do đó biện pháp phòng trừ sinh học sử dụng các vi sinh vật đối kháng trong tự nhiên ngày càng được đặc biệt quan tâm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong tự nhiên tồn tại một nhóm vi khuẩn cư trú bên trong mô cây chủ và không gây triệu chứng bệnh cho cây được gọi là vi khuẩn nội sinh (bacterial endophyte). Trong số chúng, có những vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế Quorum Quenching (QQ), là một hoạt động xảy ra trong tự nhiên có tác dụng chặn đứng những bước quan trọng của hệ thống QS như sự hình thành, tích lũy hoặc tiếp nhận phân tử tín hiệu. Dựa vào cấu trúc phân tử AHLs, các nhà khoa học đã xác định được 3 nhóm enzyme phân hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase và AHL- oxidoreductase. Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase được nghiên cứu nhiều nhất. Enzyme này được phát hiện lần đầu tiên từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. 240B có khả năng bất hoạt phân tử AHL. Gen mã hóa enzyme này khi được chuyển vào chủng vi khuẩn gây bệnh E. carotovora SCG1 đã làm giảm đáng 4 kể sự giải phóng AHL, giảm hoạt động enzyme pectolytic ngoại bào và giảm độc tính trên khoai tây, cà, cải bắp, cà rốt,… Kể từ đó trên thế giới, nhiều vi khuẩn có hoạt tính AHL-lactonase đã được miêu tả như Bacillus thuringiensis subsp. morisoni, Arthrobacter sp., Microbacterium testaceum. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh (VKNS) đối kháng để phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn. Do vậy, tôi đã tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lập và xác định đặc tính enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây” với hy vọng hướng nghiên cứu này sẽ góp phần đặt một trong những viên gạch để thiết lập một biện pháp phòng trừ hiệu quả bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra tại Việt Nam. Mục đích của đề tài Xác định được các hoạt tính của enzyme phân hủy N-acyl-Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase của các chủng vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây. Yêu cầu của đề tài - Phân lập và xác định khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn nội sinh từ cà dại. - Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy VKNS đến hoạt tính enzyme AHL lactonase. - Thử nghiệm các loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme AHL lactonase. - Xác định hoạt tính enzyme AHL lactonase của các chủng VKNS phân hủy các loại AHLs tổng hợp C6, C8 và C10. 5 - Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase trong điều kiện phòng thí nghiệm. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực hiện đề tài này giúp tôi có thêm kinh nghiệm, kiến thức về các kỹ thuật phân lập, xác định khả năng phân hủy, xác định hoạt tính enzyme phân hủy AHLs từ vi khuẩn nội sinh, đối tượng quan tâm, ngoài ra còn cung cấp thêm hiểu biết về các kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học hiện đại đang áp dụng. - Kết quả nghiên cứu của để tài sẽ cung cấp các vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu về enzyme phân hủy AHLs sẽ là tiền đề phát triển một chiến lược phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây an toàn và bền vững sau này. Ý nghĩa thực tiễn Ngoài ý nghĩa về khoa học, các vấn đề nghiên cứu trong đề tài còn có ý nghĩa trong thực tiễn. Các chủng vi khuẩn có ích mang enzyme phân hủy AHLs sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn trên nhiều loài cây trồng có giá trị hoặc chuyển những gen mã hóa enzyme này vào cây trồng giúp cây trồng chống chịu được với bệnh hại. 6 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây khoai tây 1.1.1. Nguồn gốc địa lý và sự phân bố của cây khoai tây Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà (Solanaceae). Đây là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột. Cây khoai tây có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ và du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 và Anh Quốc vào năm 1590. Sau đó, nó được lan truyền khắp châu Âu và tiếp theo là châu Á (Hawkes, 1994). Sau nhiều thế kỷ chọn lọc và nhân giống, hiện nay đã có hơn một nghìn loài khoai tây khác nhau. Hơn 99% các loài khoai tây được trồng hiện nay trên toàn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác nhau ở vùng đất thấp Trung-Nam Chile, các giống này đã được di dời từ các cao nguyên Andes. Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô (Steveson và cs., 2001). Năm 1890, một người Pháp là Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem hạt khoai tây trồng thử ở nước ta. Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đông có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng và phát triển. Vào năm 1980, Việt Nam đã trở thành nước sản xuất khoai tây lớn nhất Đông Nam Á với hơn 100.000 ha diện tích trồng (Batt., 2002). Khoai tây trở thành cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô ở Việt Nam. Tuy nhiên, theo thống kê của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), những năm gần đây diện tích trồng khoai tây chỉ dao động trong khoảng 35.000 - 40.000 ha (Bảng 1.1). Trong đó 90% diện tích tập trung ở các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ, một số ít ở miền núi phía Bắc và Trung Bộ, 0,5% diện tích còn lại được trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001). 7 Bảng 1.1: Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam giai đoạn 2005-2011 Năm Diện tích (ha) Sản lượng (tấn) 35.000 Năng suất (Tấn/ha) 10,6 2005 2006 37.613 11,1 419.161 2007 38.450 11,4 436.710 2008 41.160 11,8 486.184 2009 37.544 11,7 442.791 2010 37.100 12,0 446.200 2011 40.046 11,2 448.710 370.000 (Nguồn: FAO, 2012) Năng suất khoai tây trước đây thường đạt 8 tấn/ha, cao nhất là 18-20 tấn/ha. Từ năm 1981 đến nay, năng suất bình quân đạt gần 12 tấn/ha, cao nhất đạt 35-40 tấn/ha, có thời điểm khoai tây đã xuất khẩu sang Nga (có năm tới 1.000 tấn). Khi lương thực lúa gạo và ngô dồi dào thì khoai tây được nghiên cứu theo hướng chất lượng và hiệu quả. 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây Khoai tây Khoai tây là thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao, khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, cây chết sau khi ra hoa. Hoa có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, hoặc màu tím, nhụy hoa màu vàng. Khoai tây được thụ phấn chủ yếu bởi côn trùng, ong vò vẽ mang phấn hoa từ cây này đến cây khác. Sau khi khoai tây ra hoa, một số giống cho ra quả màu xanh lá cây giống màu xanh trái cây cà chua anh đào, có thể chứa 300 hạt (Wikipedia). 8 1.1.3 Vai trò của cây Khoai tây Khoai tây là một nguồn cung cấp lương thực dồi dào. Theo báo cáo của Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoai tây toàn Thế giới đến năm 2010 là 320 triệu tấn, trong đó hơn 2/3 là thức ăn trực tiếp của con người, còn lại là thức ăn cho động vật và nguyên liệu sản xuất tinh bột. Ở Việt Nam, khoai tây được nhập vào từ năm 1890. Do có giá trị kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi thế trong sản xuất vụ đông, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, ít tốn công chăm sóc, phù hợp với nhiều loại đất trồng nên khoai tây đang trở thành cây trồng xóa đói giảm nghèo cho bà con nông dân ở nhiều địa phương thuộc các tỉnh miền Bắc như Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái). Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam mới cung cấp được 80% nhu cầu tiêu dùng khoai tây trong nước, chúng ta vẫn phải nhập khẩu gần 100.000 tấn khoai tây hàng năm. Khoai tây là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, trong đó có 2% protein bao gồm cả lysine (một axit amin thường không có trong protein thực vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc. Trong protein khoai tây còn có một số axit amin tự do và các chất kiềm purin. Giá trị sinh học của khoai tây tương đối cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell). Người ta đã tính khoảng hơn 200g khoai tây nướng cả vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi 1 quả chuối), 28% khẩu phần sắt hàng ngày, 43% khẩu phần vitamin C, 35% khẩu phần vitamin B6 và nhiều chất khác như niacin, thiamin, folat… Việc sử dụng khoai tây làm thực phẩm còn được khuyến khích hơn nữa khi một số nhà khoa học của Viện Thực phẩm Anh mới đây phát hiện, trong khoai tây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp nếu ăn thường xuyên và chữa bệnh “ngủ” ở Châu Phi. 9 Không chỉ được sử dụng để làm lương thực và thực phẩm khoai tây còn được sử dụng trong y dược. Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát hiện thấy trong khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư và một số bệnh khác. Còn các nhà nghiên cứu Đại học Y Harvard, Mỹ, đã phát hiện ra rằng những người thường xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thư tuyến tiền liệt. 1.2 Bệnh thối nhũn khoai tây 1.2.1 Tác nhân gây bệnh và tác hại của bệnh Trong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta những năm gần đây nắng nóng, mưa nhiều đan xen nhiều cơn bão liên tục là điều kiện thuận lợi cho các loài vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng. Bệnh do vi khuẩn gây ra rất nguy hiểm và gây nhiều khó khăn cho công tác phòng trừ và bảo quản. Thời gian ủ bệnh rất khó phát hiện và đã gây ra những thiệt hại lớn trong thời kỳ sinh trưởng cũng như trong thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm. Đối với những khu vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnh thối nhũn ở khoai tây, cà rốt, hành tây, bắp cải….chủ yếu là do vi khuẩn Erwinia gây nên. Những nghiên cứu trước đây đã kết luận rằng vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây có ba loài: Erwinia carotovora pv. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv. atroseptica (Eca) và E. chrysanthemi (Ech). Trong đó Ecc là loài chủ yếu gây bệnh thối nhũn củ khoai tây (Jerenial), (Randall và cs). Vi khuẩn này khá phổ biến trên bề mặt, trên vết thương của củ khoai tây sau khi thu hoạch. Ecc gây bệnh ở cả vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới, và có phổ ký chủ rộng. Ecc cư trú trong đất, nước như sông, hồ thậm chí là đại dương. Vi khuẩn này có thể nhân lên và tồn tại trong vùng rễ của rất nhiều cây chủ hoặc không phải là cây chủ cũng như nhiều loài cỏ dại. Hai loài Eca và Ech là tác nhân chính gây ra bệnh thối đen 10 (blackleg) trên khoai tây. Tuy nhiên, đôi khi chúng cũng gây ra triệu chứng thối nhũn củ. Eca gần như chỉ gây hại trên khoai tây ở vùng ôn đới. Chúng không thể tồn tại trong đất hơn một năm, trừ khi chúng đã cư trú trong củ khoai tây bị bệnh hoặc những phần cây khoai tây mục nát khác. Ngược lại, Ech là tác nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật ở các cùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến một số cây trồng (ngô, thược dược) ở vùng ôn đới. Nhiễm trùng tiềm ẩn của củ khoai tây bởi vi khuẩn gây thối nhũn Erwinia là phổ biến và vì bệnh có xu hướng phát triển chỉ khi sức đề kháng của cây chủ bị suy yếu, chúng được mô tả như là tác nhân gây bệnh cơ hội (Pérombelon và Kelman, 1987; Perombelon và Salimond, 1995; Perombelon, 2002; Prajapat và cs., 2003) Vi khuẩn gây bệnh Ecc là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Tế bào hình gậy, hai đầu hơi tròn, có 2 - 8 lông roi bao quanh mình (Hình 1.1). Vi khuẩn không có vỏ nhờn, nhuộm Gram âm, hiếu khí, dịch hoá gelatin, tạo H2S, thuỷ phân tinh bột và không tạo NH3. Đặc tính của vi khuẩn gây bệnh là sản sinh một lượng lớn enzyme phân hủy pectin ngoại bào, một trong số những enzyme này phân hủy thành tế bào thực vật. Nuôi cấy trên môi trường pepton saccaro, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu trắng xám, hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt khuẩn lạc ướt (Hình 1.1). Trên môi trường có TZC khuẩn lạc của vi khuẩn có màu đỏ ở giữa, rìa ngoài màu trắng đó là đặc trưng để nhận biết loài Erwinia sp. Vi khuẩn phát triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất là 27 – 37oC, nhiệt độ tới hạn chết là 50oC; phạm vi pH cũng khá rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2. Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô và dưới ánh nắng. 11 Hình 1.1. Khuẩn lạc vi vi khuẩn Ecc trên môi trường YPDA (ảnh a) và tế bào vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora dưới kính hiển vi điện tử (ảnh b) (Nguồn: Dong Hwan Lee và cs., 2013) Hình 1.2: Bệnh thối nhũn trên khoai tây (Nguồn Wikipedia) Hiện tượng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn. Triệu chứng bệnh bắt đầu mềm và sũng nước, sau đó vết bệnh chuyển thành nhớt và bốc mùi thối khó chịu (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân., 1999). Đây là loại bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với khoai tây trong quá trình bảo quản, cất giữ, chuyên chở và xuất nhập khẩu (Hình 1.2). 12 Vi khuẩn xâm nhập chủ yếu qua vết thương, qua mắt củ. Vi khuẩn tồn tại trong đất, trong tàn dư củ khoai tây. Bệnh thối nhũn củ khoai tây phát sinh và phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao. Mức độ bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó yếu tố nhiệt độ, độ ẩm và chất lượng củ giữ vai trò quyết định. Mức độ gây hại của bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng ký sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau, trong côn trùng cũng như trong đất (Hình 1.3). Hiện nay chưa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại do vi khuẩn này gây ra là rất lớn. Hình 1.3. Các giai đoạn sống trong chu kỳ gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn các loại rau củ thuộc chi Erwinia, Pectobacterium và Dickeya (Allen và cs., 2009) Trên thế giới, bệnh thối nhũn được xem là nguyên nhân gây thiệt hại đến sản xuất lớn nhất so với các bệnh vi khuẩn khác. Thiệt hại do vi khuẩn thối nhũn sau thu hoạch được đánh giá từ 15-30% năng suất cây trồng sau thu 13 hoạch (Agror, 2006). Một đánh giá khác của Balus cho rằng thiệt hại do bệnh thối nhũn củ khoai tây có thể xảy ra trong quá trình vận chuyển và bảo quản, ước tính mất mát có thể lên đến 40% nếu như thiếu phương pháp bảo quản thích hợp (Balus, Dahiru, 2006). Tại một số vùng trồng khoai tây chính ở Zimbabwe mùa vụ 2009-2010, thiệt hại do bệnh thối nhũn gây ra bởi Erwinia carotovora đã lên đến 65% (Elizabeth Ngadze, 2012). Trong một chương trình kéo dài 9 năm khảo sát bệnh trên củ khoai tây giống nhập khẩu vào Israel từ Bắc Âu của Tsror đã thống kê được sự nhiễm tiềm tàng Eca ở mức độ 103 tế bào/g vỏ có ở 30% lô củ giống hàng năm (Tsror và cs, 1993). Cũng một khảo sát khác của Tsror trên một lô khoai tây nhập khẩu từ châu Âu vào Israel cho thấy 7% lô hàng bị nhiễm bệnh blackleg và thối nhũn củ khoai tây gây ra bởi Erwinia spp. ở mức độ mạnh, 65% bị nhiễm ở mức độ trung bình (Tsror và cs., 1999). Tại Keren County, California, Farrar đã theo dõi 30% khoai tây sau thu hoạch bị tấn công bởi Ecc. Tiếp theo, họ đã thông báo những thiệt hại nghiêm trọng gây ra bởi Ecc cho khoai tây sau thu hoạch tại San Joaquin Valley (Farrar và cs., 2009). Ở Việt Nam, đến nay tuy chưa có một con số thống kê cụ thể về thiệt hại của bệnh thối nhũn khoai tây gây ra bởi vi khuẩn E. carotovora, nhưng bệnh đã được thông báo có mặt ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên cả nước. Đặc biệt do thời gian bảo quản khoai tây ở nước ta tương đối dài (8-9 tháng), điều kiện thời tiết nóng ẩm khiến cho bệnh là mối nguy hiểm nghiêm trọng gây thiệt hại đến năng suất và chất lượng củ khoai tây. Khoai tây giống sau 8 tháng bảo quản thường bị hao hụt khoảng 30-50%, thậm chí có nơi hao hụt lên tới 70% tổng số khoai bảo quản. Một trong những nguyên nhân gây ra thiệt hại này là do sâu bệnh và nấm mốc, trong đó có bệnh thối nhũn (Vũ Quốc Trung, 2005). Một nghiên cứu chi tiết về diễn biến của bệnh trong quá trình bảo quản khoai tây sau 14 thu hoạch cho thấy bệnh xuất hiện với tỷ lệ thấp ở tháng 1 đến tháng 3 do nhiệt độ không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh. Trong những tháng mùa hè bệnh thối nhũn củ phát triển mạnh nhất, cao nhất của bệnh vào tháng 6, 7, 8. Bệnh tiếp tục phát sinh gây hại ở mức độ bệnh giảm dần khi điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi (tháng 10 đến tháng 12) (Trần Thị Thúy). Bệnh thối nhũn củ khoai tây được đặt trong danh sách các bệnh cần phải kiểm nghiệm củ giống khoai tây theo tiêu chuẩn quốc gia do Bộ NN & PTNT và Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành (TCVN 8549-2011). 1.2.2 Quorum sensing (QS) và mối liên quan đến khả năng gây bệnh thối nhũn khoai tây của tác nhân gây bệnh. Vi khuẩn Gram âm (trong đó có Erwinia) sử dụng một dạng “giao tiếp của vi khuẩn” gọi là Quorum Sensing (QS). QS dựa trên cơ sở tổng hợp, giải phóng, phát hiện và phản ứng với các phân tử tín hiệu AHLs của tế bào vi khuẩn liền kề. Khi mật độ tế bào vi khuẩn tăng lên, các phân tử này sẽ được tích lũy trong môi trường ngoại bào và thông qua đó giúp vi khuẩn có thể kiểm soát được số lượng tế bào cũng như sự hiện diện của các loài vi khuẩn khác. Những phân tử này khi đạt đến một ngưỡng nhất định sẽ kích hoạt tín hiệu bên trong vi khuẩn và cực đại hóa hoạt động của một số gen đặc hiệu. Điều hòa biểu hiện gen thông qua cơ chế QS có sự tham gia của gen luxR và luxI mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR và AHL synthase (LuxI). Phân tử tín hiệu AHL đóng vài trò là chất tự cảm ứng (autoinducer) vì nó kiểm soát quá trình tổng hợp chính bản thân phân tử AHLs thông qua vòng điều khiển gen sinh tổng hợp AHL synthase. Hầu hết vi khuẩn gây bệnh sử dụng hệ QS đã được nghiên cứu đều cho thấy rằng QS có liên quan đến các gen gây bệnh (Hình 1.4) (Coutteau và Goossens, 2013; Dong và cs., 2000; Whitehead và cs., 2001) 15 Hình 1.4 Cơ chế Quorum Sensing ở vi khuẩn Gram âm. (r: gen mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR (R); i: gen mã hóa cho AHL synthase LuxI (I). Ở các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Erwinia có tồn tại ít nhất hai hệ thống QS và được xác định bởi bản chất của các tín hiệu hóa học liên quan: Nacyl homoserine lactones (AHLs; còn gọi là tín hiệu AI-1), được tổng hợp bởi nhóm protein LuxI; và tín hiệu AI-2, được tổng hợp bởi nhóm protein tương đồng LuxS. Hệ thống QS ở một số loài Erwinia đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen, tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và khả năng gây bệnh trên cây chủ. Nghiên cứu này của chúng tôi tập trung chính vào khả năng sản sinh phân tử tín hiệu AHLs của loài vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora có liên quan đến khả năng gây bệnh thối nhũn trên khoai tây. (Barnard và Salmond, 2006; Engebrecht và cs., 1983; Nasser và cs., 1998; Schaefer và cs., 1996) 16 N-acyl homoserine lactone (AHL) Hình 1.5 Cấu trúc phân tử N-acyl homoserine lactones (Barnard và Salmond, 2006) Phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactones (AHLs) được đặc trưng bởi một vòng homoserine lactone bất biến gắn với một chuỗi bên N-acyl. Các phân tử tín hiệu AHLs khác nhau về cấu trúc của chuỗi bên N-acyl có thể thay đổi (Hình 1.5). Mỗi tế bào trong quần thể vi khuẩn đều có khả năng sản sinh ra các tín hiệu QS, cho biết sự hiện diện của chúng với các tế bào khác trong quần thể. AHLs được tạo ra từ một phản ứng enzyme hóa, được xúc tác bởi LuxI autoinducer synthase. LuxI tổng hợp N-AHLs: N-(3-oxohexanoyl)-Lhomoserine lactone (3-oxo-C6-HSL), sử dụng S-adenosyl methionine và protein mang nhóm hexanoyl acyl làm cơ chất cho phản ứng. Các đồng phân LuxI khác cũng xúc tác cho phản ứng tương tự để tạo ra các AHLs cần thiết như: N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-hexanoylL-homoserine lactone (C6-HSL)… (Toth và cs., 2003; Val và Cronan, 1998) 17 Bảng 1.2: Hệ thống QS sử dụng phân tử tín hiệu N-AHLs của một số loài Erwinia (Barnard và Salmond, 2006) Chủng vi khuẩn Erwinia nhóm 1 Ecc EC153 Tín hiệu QS chính Đồng phân LuxI Đồng phân LuxR Tác động của QS 3-oxo-C8-HSL và 3-oxo-C6-HSL 3-oxo-C8-HSL và 3-oxo-C6-HSL AhlI ExpR AhlI ExpR1(ExpR)*, Gây bệnh, tổng ExpR2 hợp enzyme ngoại bào Erwinia nhóm 2 Ecc ATCC39048 3-oxo-C6-HSL CarI CarR, EccR(ExpR)*, VirR Ecc SCRI193 3-oxo-C6-HSL Ecc 71 3-oxo-C6-HSL Eca SCRI1043 3-oxo-C6-HSL Ecc SCC3193 Tổng hợp enzyme ngoại bào Tổng hợp kháng sinh, gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào AhlI ExpR, VirR, Gây bệnh, tổng [CarR hợp enzyme ngoại (cryptic)] bào AhlI ExpR1(ExpR)*, Gây bệnh, tổng (HslI)* ExpR2 hợp enzyme ngoại bào ExpI ExpR, VirR Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào Erwinia amylovora OMP-BO 1077/7 3-oxo-C6-HSL EamI Erwinia chrysanthemi 3937 3-oxo-C6-HSL, ExpI C6-HSL, C10-HSL *Danh pháp thay thế 18 EamR ExpR Tổng hợp enzyme pectinase Theo như bảng 1.2 thì ở hầu hết các loài thuộc chi Erwinia có mối quan hệ mật thiết giữa khả năng sản sinh phân tử tín hiệu AHLs và khả năng gây bệnh trên cây chủ. Đây là cơ sở chính để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này. 1.2.3 Các biện pháp phòng trừ bệnh Bệnh thối nhũn củ khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra chủ yếu lây qua củ giống và sẵn sàng lan rộng bởi những củ nhiễm tiềm tàng. Bên cạnh đó vi khuẩn có thể lây qua không khí, côn trùng, động vật (côn trùng, chuột,..) và các dụng cụ lao động. Nhiều phương pháp phòng trừ đã được tổng hợp dưới đây nhưng ở mức độ thành công khác nhau (Czajkowski và cs., 2011). Phương pháp tránh lây nhiễm và cấp chứng chỉ củ giống: Đây được xem là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất và có những thành công nhất định. Sử dụng nguồn củ giống khỏe, được cấp chứng chỉ sạch bệnh. Trong quá trình canh tác, dụng cụ phải được rửa sạch. Loại bỏ củ thối trên đồng ruộng và thu hoạch. Tránh làm xây sát củ. Trước khi bảo quản không đổ khoai tây thành đống củ, cần phải giàn thành từng lớp, hong nhẹ dưới ánh sáng tán xạ để giảm bớt lượng nước, vỏ củ khô và dần chuyển thành màu hơi xanh. Khoai tây phải được bảo quản trong điều kiện thông gió, tốt nhất trong phòng lạnh để làm giảm nguồn nhiễm và tránh bệnh lây lan. Chế độ dinh dưỡng ảnh hưởng lên tính chống chịu bệnh. Dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, sự tương tác giữa cây trồng với tác nhân gây bệnh cũng như với những vi sinh vật khác. Canxi đóng vai trò quan trọng nhất quyết định đến tính chống chịu bệnh của cây do ion canxi cải thiện cấu trúc và độ cứng của thành tế bào thực vật. Đất tự nhiên thiếu canxi có thể được bổ sung CaSO4 (gypsum) không những làm tăng tính chống chịu của cây với bệnh thối đen (blackleg) mà với cả bệnh thối nhũn củ khoai tây. Tuy nhiên một chế độ dinh dưỡng cân bằng cùng với việc tăng hàm lượng Ca 19 trong đất không đủ để ngăn chặn được bệnh mà cần phải kết hợp với nhiều biện pháp khác trong phương pháp phòng trừ tổng hợp. Biện pháp chọn tạo giống: Chọn tạo giống bằng phương pháp truyền thống được xem như biện pháp kém khả thi nhất. Trong tự nhiên không có giống khoai tây nào mang tính chống chịu với bệnh thối đen và thối nhũn mặc dù cũng có một số giống chống chịu cục bộ, cùng với sự kém đa dạng di truyền của nguyên liệu chọn giống bố mẹ được sử dụng, Trong khi đó việc tạo ra những cây trồng biến đổi gen lại được xem như là phương pháp hứa hẹn để thay thế cho phương pháp truyền thống. Tuy đã có rất nhiều nghiên cứu khả thi nhưng thực tế cho đến nay cũng chưa có dòng khoai tây chuyển gen nào được thương mại hóa. Mọi nghiên cứu chỉ dừng ở quy mô nhà lưới, nhà kính nhằm kiểm tra tiến trình và đánh giá những nguy hiểm tiềm năng đến môi trường của cây chuyển gen . Sử dụng biện pháp lý học (xử lý nước nóng): Biện pháp này được áp dụng trước khi bảo quản củ khoai tây. Đây được xem là biện pháp thân thiện với môi trường. Biện pháp này có thể giúp loại trừ được vi khuẩn gây bệnh thối nhũn cùng với một số vi khuẩn gây bệnh bề mặt củ khác. Tuy nhiện hạn chế của nó là không diệt được vi khuẩn nằm sâu bên trong củ mà không làm tổn thương củ, giá thành đắt và không áp dụng được trên quy mô lớn. Biện pháp hóa học: Biện pháp này nhằm loại bỏ tận gốc tác nhân gây bệnh và tạo ra một môi trường không thuận lợi cho bệnh phát triển. Một khi bệnh đã phát triển, sự phòng trừ bệnh sẽ gặp khó khăn do sự nhân nhanh và lây lan của vi khuẩn, và chất hóa học khó xâm nhập vào bên trong mô củ. Tuy nhiên, biện pháp này nếu không được kiểm soát chặt chẽ sẽ gây hại đến môi trường, sức khỏe con người và tạo ra tính kháng thuốc của tác nhân gây bệnh. Biện pháp sinh học: Biện pháp này có thể thay thế biện pháp hóa học, lý học và chọn tạo giống chống chịu trong tương lai. Đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm sàng lọc và phát hiện vi sinh vật có khả năng ức chế 20