Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy toluene

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHỊU NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TOLUENE CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS.NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ NGỌC THẢO NGUYÊN MSSV:3082615 LỚP:CNSHTT K34 Cần Thơ, Tháng 05/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Võ Ngọc Thảo Nguyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Qua quá trình thực hiện luận văn, em đã học hỏi được rất nhiều. Lần đầu tiên, em được trải nghiệm quá trình nghiên cứu khoa học thật sự và đầy thú vị. Cũng nhờ quá trình này, em càng hiểu và quý trọng những tình cảm, sự giúp đỡ của mọi người. Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến mọi người. Đầu tiên, em xin chân thành cám ơn toàn thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã mang đến cho em chân trời tri thức, giúp đỡ em hết mình trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình. Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Hiệp, người vừa là cố vấn học tập, đã quan tâm, giúp đỡ em trong suốt 05 năm đại học, vừa là thầy hướng dẫn tận tụy. Nhờ sự giúp đỡ tận tình của thầy mà em có thể hoàn thành luận văn này. Ngoài ra, em cũng xin chân thành cám ơn anh, chị và các bạn thuộc phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, phòng Sinh học Phân tử thực vật đã hỗ trợ em hết mình trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, em xin gởi lời tri ân đến gia đình. Nơi về hạnh phúc và an lành cho em. Võ Ngọc Thảo Nguyên Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp cuộc sống con người ngày càng tốt hơn. Tuy nhiên, công nghiệp hóa không đi liền với bảo vệ mội trường dẫn tới những ảnh hưởng tiêu cực lên Trái Đất cũng như sức khỏe con người. Nhiễm độc Toluene, một loại dung môi hữu cơ được sử dụng phổ biến ở ngành công nghiệp sơn và thuộc da, là vấn đề đang được các nhà nghiên cứu khoa học quan tâm. Mục tiêu của đề tài là phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene. Mẫu đất thu được tại 04 nguồn: mẫu dất gần Nhà máy thuộc da Tây Đô, Xí nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa có nguy cơ nhiễm độc Toluene cao ở địa bàn thành phố Cần Thơ được tăng sinh khối vi khuẩn bằng cách ủ với Toluene ở nồng độ 1% và 10% ở 45oC ở cả hai pha khí và pha lỏng và sử dụng môi trường MSB (mineral salt basal) để phân lập. Các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển với Toluene là nguồn carbon duy nhất và khả năng tạo enzyme protease, cellulase, amylase và lipase được giải trình tự và chứng minh khả năng phân hủy bằng phương pháp đếm mật số phát triển với Toluene là nguồn carbon duy nhất ở các nồng độ 0%, 1%, 1,5%, 2%. Từ 04 nguồn đất đã phân lập được 09 dòng vi khuẩn. Hầu hết các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp các enzyme. Ba dòng được tuyển chọn chính là T14, T38 và T50. Kết quả giải trình tự và so sánh bằng BLAST cho biết các dòng vi khuẩn này có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis (T14), Bacillus subtilis (T38) và Acinetobacter sp. (T50). Dòng T38 (Bacillus subtlis) được chọn để kiểm tra khả năng sử dụng Toluene như nguồn carbon duy nhất và đã chứng minh có thể phát triển ở nổng độ Toluene 1% và 1,5%. Từ khóa: Dung môi hữu cơ, nhiễm độc Toluene, phân lập, sự phân hủy, vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ....................................................................................................... ii LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... iii TÓM LƢỢC ................................................................................................................... i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... vii CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................................ viii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU...........................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................2 2.1. Sơ lƣợc về dung môi hữu cơ ..................................................................................3 2.1.1. Định nghĩa.......................................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại ............................................................................................................ 3 2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ................................................................................5 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng sự phân hủy dung môi hữu cơ ........................................7 2.3.1. Biện pháp xử lý sinh học là gì? ......................................................................... 7 2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng sự phân hủy sinh học của dung môi hữu cơ .................. 8 2.4. Cơ chế phân hủy dung môi hữu cơ .....................................................................10 2.4.1. Phân hủy hiếu khí ............................................................................................ 10 2.4.2. Phân hủy kỵ khí ............................................................................................... 11 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT 2.5. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................12 2.5.1. Ngoài nước....................................................................................................... 12 2.5.2. Trong nước....................................................................................................... 13 CHƢƠNG 3. .................................................................................................................14 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................14 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .......................................................................................14 3.1.1. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 14 3.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 15 3.1.3. Vật liệu ............................................................................................................. 16 3.1.4. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................ 16 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................16 3.2.1. Chuẩn bị thí nghiệm......................................................................................... 16 3.2.2. Phân lập vi khuẩn............................................................................................. 17 3.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ......................................... 17 3.2.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene ...................... 19 3.2.5. Khảo sát khả năng tạo một số enzyme ............................................................ 19 3.2.6. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ....................................... 20 3.2.7. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy dung môi hữu cơ ....................... 20 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................23 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...................................................................................23 4.2. Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc................................23 4.3. Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene .........................................................................................................................26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT 4.4. Kết quả khảo sát khả năng tạo một số enzyme của các dòng vi khuẩn đã đƣợc phân lập ........................................................................................................................27 4.4.1.Khảo sát khả năng tạo enzyme protease …………………………………...27 4.4.2. Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase ……………………………………..28 4.4.3. Khảo sát khả năng tạo enzyme amylase…………………………………...29 4.4.4. Khảo sát khả năng tạo enzyme cellulase…………………………………..30 4.5. Kết quả giải trình tự .............................................................................................32 4.6. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy Toluene ......................................35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................36 5.1. Kết luận .................................................................................................................36 5.2. Đề nghị ...................................................................................................................36 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................37 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... Phụ lục 1: Kết quả 1. Kết quả trả cứu BLAST của dòng T14 ...................................................................... 2. Kết quả tra cứu BLAST của dòng T38 ...................................................................... 3. Kết quả tra cứu BLAST của dòng T50 ...................................................................... Phụ lục 2: Kết quả ........................................................................................................... 1. Bảng 13: Kết quả thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene (OD 600nm) ..................................................................................................... 2. Bảng 14: Kết quả thí nghiệm khả nẳng tạo enzyme của các dòng vi khuẩn ............. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 3: Kết quả thống kê ........................................................................................... 1. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme protease....................................................... 2. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme lipase.......................................................... 3. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme cellulase ...................................................... 4. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme amylase ....................................................... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thường gặp………………………………..…3 Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm năng áp dụng biện pháp xử lý sinh học...............8 Bảng 3: Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy............................................9 Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng trong thí nhiệm ......................................................21 Bảng 5: Nguồn gốc các dòng vi khẩn đã phân lập........................................................23 Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập.................................24 Bảng 7: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn đã phân lập.......................................24 Bảng 8: Khả năng tạo enzyme protease của các dòng vi khuẩn phân lập được............28 Bảng 9: Khả năng tạo enzyme lipase của các dòng vi khuẩn phân lập được................29 Bảng 10: Khả năng tạo enzyme amylase của các dòng vi khuẩn phân lập được..........29 Bảng 11: Khả năng tạo enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn phân lập được.........30 Bảng 13: Mật số vi khuẩn của dòng T38......................................................................35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Nguyên tắc chính của quá trình phân hủy hiếu khí hydrocarbon gắn với quá trình tăng trưởng...........................................................................................10 Hình 2: Nguyên tắc pha loãng.……………………………………………..…..22 Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn sau 2 ngày……………..……25 Hình 4: Kết quả nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn.............................................26 Hình 5: Chỉ số đo OD của các dòng vi khuẩn ở ngày 0, ngày 02 và ngày 04..................................................................................................................27 Hình 6: Vòng sáng được tạo ra trong môi trường CMC và tinh bột của một số dòng vi khuẩn.............................................................................................................................31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT CHỮ VIẾT TẮT BLAST: Basic Local Alignment Search Tool CDC: Centers for Disease Control and Prevention CMC: Carbonxy methyl cellulose LB: Luria Bertani MSB: Mineral Salt Basal NIOSH: The National Institue for Occupational Saftey and Health OD: Optical density TOL: Toluene VOCs: Volatile Organic Coumpounds Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp tăng năng suất và hiệu quả lao động. Nhờ đó, đời sống con người cũng được cải thiện về mặt vật chất. Tuy nhiên, mặt trái của nền sản xuất công nghiệp là không thể phủ nhận khi mức độ ô nhiễm ngày càng tăng. Ô nhiễm do chất thải công nghiệp, cụ thể là dung môi hữu cơ, không những ảnh hưởng đến hệ sinh thái mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người (Lau, 2001). Mặc dù dung môi hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong các ngành sản xuất từ chất nhuộm, plastic, mực in, vải cho tới sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm nhưng nếu không được xử lý đúng cách thì lượng lớn dung môi hữu cơ tích tụ lâu ngày sẽ gây độc nghiêm trọng cho môi trường và con người. Các phương pháp xử lý truyền thống đối với những vùng bị nhiễm độc dung môi hữu cơ hay hydrocarbon bao gồm tách lớp đất đã bị ô nhiễm, cách ly vùng bị ô nhiễm (Vidali, 2001). Tuy nhiên, những phương pháp này không hiệu quả vì không giải quyết được triệt để nguồn ô nhiễm. Ngoài ra, phương pháp đốt hoặc dùng hóa chất cũng được sử dụng nhưng lại có nhiều nhược điểm và đòi hỏi kinh phí cao. Trong tình hình đó, phương pháp xử lý sinh học xuất hiện như một giải pháp tích cực giúp xử lý ô nhiễm hydrocarbon với những ưu điểm như giá thành thấp, không đòi hỏi kỹ thuật cao và tận dụng được quá trình phân hủy tự nhiên của vi sinh vật. Cũng chính vì lẽ đó mà các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu để có thể tìm ra những loài vi khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ với hiệu suất cao nhằm nâng cao hiệu quả của biện pháp xử lý sinh học. Việt Nam với những quần thể vi sinh vật phong phú sẽ là địa điểm đầy tiềm năng để có thể phân lập được những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene với hiệu quả cao. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene” được đề xuất. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về dung môi hữu cơ 2.1.1. Định nghĩa Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention-CDC) của Mỹ định nghĩa dung môi là những chất có khả năng hòa tan hoặc phân tán một hoặc nhiều chất khác. Dung môi hữu cơ là những dung môi có nguồn gốc carbon (chúng có chứa nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử). Trong sách “Hướng dẫn về an toàn sử dụng dung môi hữu cơ” của bộ lao động Newzeland, dung môi được định nghĩa là bất kỳ dung dịch nào có khả năng hòa tan một chất (Tyson et al., 1992). Cụm từ “Dung môi hữu cơ” được dùng để chỉ một nhóm lớn những hóa chất có nguồn gốc từ những sản phẩm dầu mỏ (petroleum). Như vậy, ta có thể định nghĩa dung môi hữu cơ là những dung dịch có khả năng hòa tan các chất khác và có chứa carbon có nguồn gốc từ petroleum. 2.1.2. Phân loại Dung môi hữu cơ được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học của chúng gồm có các nhóm chính: nhóm có chứa clo, hợp chất aliphatic, hợp chất thơm, rượu, glycol, ether, este, keton, aldehyde và những loại khác. Bảng 1 cho thấy một số nhóm chính của dung môi hữu cơ. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thƣờng gặp Nhóm Tên dung môi hữu cơ Hợp chất có chứa clo Trichloroethane Trichloroethylene Methylene chloride Chloroform Carbon tetrachloride Hợp chất aliphatic Hợp chất vòng thơm Rượu/Glycol/ Ether Ester/ketones/Aldehyd es Các loại khác Tetrachlorethylene n-hexane n-heptane Pentane Cyclohexene Cyclohexane Petroleum ether Benzene Toluene Xylene Naphthalenes Methanol Ethanol Propanol Butanol Ethylene glycol Diethyl ether Ethyl acetate Acetone Methyl ethyl ketone Methyl isobutyl ketone Methyl n-butyl ketone Formaldehyde Glutaraldehyde Carbon disulphide Pyridine amide amine (*Nguồn: http://www.uq.edu.au/ohs/pdfs/organicsolvents.pdf., ngày 10/01/2013) Dung môi sử dụng trong công nghiệp thường là hỗn hợp của nhiều chất khác nhau. Ví dụ như dung môi “methylated spirit” là sự pha trộn giữa methanol và ethanol. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Có thể có tới 20 hợp chất trong một số dung môi hữu cơ. Ví dụ: White Spirit, Turpentine and Kerosene (Tyson et al., 1992). 2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), ở Mỹ, 9,8 triệu công nhân phơi nhiễm với dung môi hữu cơ có trong các sản phẩm như sơn, véc-ni, chất kết dính, keo dán, chất tẩy nhờn và trong ngành sản xuất thuốc nhuộm, polymer, plastic, vải, mực in, sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm. Điều đáng lo ngại là rất nhiều những dung môi hữu cơ được cảnh báo bởi NIOSH (Viện quốc gia về an toàn lao động và sức khỏe) như chất gây ung thư (benzene, carbon tetrachloride, trichloethylene), chất độc sinh sản (2-ethoxyethanol, 2-methoxyethanol, methyl chloride) và chất độc thần kinh (n-hexane, tetrachloroethylene, toluene). Những nghiên cứu gần đây cho thấy có sự liên quan giữa sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ (trichloroethylene, perchloroethylene, carbon tettrachlorine) và bệnh Parkinson (Goldman et al., 2012). Những dung môi hữu cơ thường gặp ở nước ta bao gồm VOCs (Volatile Organic Compounds), Benzene và Toluene. Nhiễm độc các chất VOCs: VOCs là tên gọi chung các chất lỏng hay chất rắn có chứa carbon hữu cơ rất dễ bay hơi. Một số chất thông dụng như acetone, ethylacetate, buthylacetate .v.v. Nguồn ô nhiễm VOCs phát sinh do đốt không triệt để xăng dầu, các dung môi hữu cơ tự bay hơi, bay hơi của xăng dầu, bay hơi của các hoá chất rơi vãi. Cây xanh khi trao đổi khí ban đêm cũng thải VOCs. Nhìn chung, xăng và sơn là hai thứ thải ra VOCs nhiều nhất. Chúng ít gây độc mãn tính mà chủ yếu gây độc cấp tính như chóng mặt, say nôn, sưng mắt, co giật, ngạt viêm phổi. Chỉ một số ít chất có khả năng gây độc mãn tính thì lại tạo ra ung thư máu, bệnh thần kinh (Bạch Thái Toàn, 2008) Nhiễm độc Benzen: Benzen là một chất lỏng dễ bay hơi khi hỗn hợp với không khí có thể gây nổ. Benzen xâm nhập vào cơ thể qua da (tiếp xúc trực tiếp) và qua phổi. Khi xâm nhập, khoảng 75% - 90% được cơ thể thải ra trong vòng nửa giờ. Phần còn lại tích lũy trong mỡ và tuỷ xương, não sau đó được bài tiết chậm ra ngoài. Phần Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT benzen tích lũy này có thể gây các biểu hiện bệnh lý: Gây ra sự tăng tạm thời của bạch cầu; gây ra sự rối loạn oxy hoá - khử của tế bào dẫn đến tình trạng xuất huyết bên trong cơ thể; nếu hấp thu nhiều benzen cơ thể sẽ bị nhiễm độc với các hội chứng khó chịu, đau đầu, chóng mặt, nôn, có thể dẫn đến tử vong vì suy hô hấp. Nếu thường xuyên tiếp xúc với benzen có thể gây nhiễm độc mãn tính. Lúc đầu là rối loạn tiêu hoá, ăn kém ngon, xung huyết niêm mạc miệng, rối loạn thần kinh, đau đầu, bị chuột rút, cảm giác kiến bò, thiếu máu nhẹ, xuất huyết trong, phụ nữ hay bị rong kinh, khó thở do thiếu máu. Tiếp theo là xuất huyết trong nặng, thiếu máu nặng, giảm bạch cầu. Phụ nữ bị nhiễm độc nặng có thể bị đẻ non hoặc sẩy thai đây là bệnh nguy hiểm vì benzen có thể tích luỹ lâu dài trong tuỷ xương. Bệnh có thể xuất hiện sau 2 năm kể từ khi bị nhiễm benzene (Bạch Thái Toàn, 2008). Benzen được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các chất hữu cơ, dùng làm dung môi hoà tan mỡ, cao su, vecni, tẩy da, vải sợi, lau khô, tẩy dầu mỡ bám trên các dụng cụ, vật liệu, phương tiện. Năm 1997, Chính phủ nước ta đã có quyết định cấm dùng benzen làm dung môi pha chế sơn. Những ngành khác cần sử dụng benzen thì phải được sự cho phép của cơ quan có thẩm quyền. Điều này cho thấy benzen cực kỳ độc hại. Người sử dụng hãy cảnh giác với các sản phẩm sơn, nhất là sơn được sản xuất bằng công nghệ lạc hậu. Chất thải từ các nhà máy thuộc da, dệt nhuộm cơ khí, các xưởng sửa chữa tân trang xe, máy, đóng tàu cũng là những nguồn phát thải benzene (Bạch Thái Toàn, 2008) Nhiễm độc Toluen: Toluen là chất dễ bay hơi, cháy nổ. Chỉ cần một nồng độ nhỏ 1/1000, Toluen đã gây cảm giác mất thăng bằng, đau đầu, nếu nồng độ cao hơn có thể gây ảo giác, choáng ngất. Toluen có trong sơn, nhựa, keo dán công nghiệp và là chất xúc tác trong công nghệ in ảnh (Bạch Thái Toàn,2008) Sự hấp thu dung môi hữu cơ thường qua tiếp xúc ngoài da hoặc qua đường hô hấp. Nhân tố ảnh hưởng tới tốc độ và mức độ hấp thụ qua da bao gồm thời gian tiếp xúc, nồng độ dung môi và tình trạng của da (độ ẩm của da, vết thương…) và tính tan của các dung môi. Tốc độ thâm nhập qua da đã được chứng minh liên quan trực tiếp đến tính tan của dung môi. Nói chung, hợp chất clo được hấp thu qua da nhiều hơn các hợp chất không chứa clo. Hợp chất vòng thơm để xâm nhập qua da hơn hợp chất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT aliphatic (Baker, 1988). Sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ có thể được miêu tả như phơi nhiễm cấp tính (tiếp xúc trong thời gian ngắn nhưng nồng độ cao) hoặc phơi nhiễm mãn tính (tiếp xúc liên tục trong thời gian dài). Sự phơi nhiễm này có thể gây độc tại bộ phận cơ thể tiếp xúc với dung môi hữu cơ (tác động cục bộ) hoặc gây thay đổi chức năng của những cơ quan khác (tác động hệ thống). Phản ứng có thể xảy ra ngay lập tức (cấp tính) hoặc mãn tính. Sự hấp thu qua phổi phụ thuộc vào nồng độ dung môi được hít vào, tính tan của các dung môi và tốc độ trao đổi khí của phổi. Một ví dụ cụ thể là nếu một người công nhân phải làm việc với tần suất cao dẫn đến tăng tốc độ trao đổi khí của phổi sẽ hít vào lượng dung môi hữu cơ dễ bay hơi nhiều hơn (Baker, 1988). Trong môi trường, hợp chất thơm là một trong những chất ô nhiễm khó xử lý nhất (Seo et al., 2009). Dung môi hữu cơ có tác động tiêu cực đến môi trường xung quanh, ảnh hưởng đến hệ sinh thái, ức chế sự phát triển của thực vật và động vật. Thí nghiệm cho thấy, động vật phơi nhiễm với dung môi hữu cơ như n-hexane bị ảnh hưởng đến màng tế bào, sự cân bằng của trao đổi tín hiệu thần kinh và ảnh hưởng tới hô hấp tế bào cũng như sinh tổng hợp protein (Baker, 1988). 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng sự phân hủy dung môi hữu cơ 2.3.1. Biện pháp xử lý sinh học là gì? Biện pháp xử lý sinh học (bioremediation) được định nghĩa là quá trình mà những chất thải hữu cơ được phân hủy bằng con đường sinh học dưới điều kiện được kiểm soát cho đến khi đạt được trạng thái vô hại hoặc đến mức độ được chấp nhận bởi cơ quan quản lý (Vidali, 2001). Quần thể vi khuẩn sử dụng trong xử lý sinh học có thể là quần thể có sẵn tại điểm ô nhiễm hoặc những quần thể được đưa vào từ nơi nguồn khác. Bởi vì biện pháp xử lý sinh học có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống khác như giá thành rẻ hơn, thân thiện với môi trường nên được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Năm 1975, Dick Raymond đã nhận bằng sáng chế cho biện pháp xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm nhiễm gas. Phương pháp này bao gồm sự kích thích sự phát triển vi khuẩn tại chỗ bằng cách bổ sung chất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT dinh dưỡng. Rõ ràng qua hơn 50 năm, xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm đã cho thấy những thành công và hiểu biết hơn về xử lý ô nhiễm, đặc biệt đối với ô nhiễm dầu mỏ (petroleum). Trong những năm gần đây, ứng dụng của biện pháp xử lý sinh học được phát triển ở lĩnh vực xử lý dung môi, hydrocarbon thơm đa vòng, dioxin và kim loại (Hazen, 2010). Thật vậy, biện pháp sinh học đã được áp dụng trên nhiều địa điểm trên khắp thế giới bao gồm Châu Âu với mức độ thành công khác nhau (Zeyaullah et al., 2009) nhưng cũng đã cho thấy tiềm lực của biện pháp xử lý này. 2.3.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự phân hủy sinh học của dung môi hữu cơ Theo nghiên cứu của Atlas (1981), sự phân hủy của vi sinh vật đóng vai trò chính trong quá trình phong hóa của hỗn hợp petroleum hydrocarbon. Sự phân hủy petroleum trong hệ sinh thái tự nhiên rất phức tạp. Sự thay đổi của hợp chất hydrocarbon dựa vào bản chất của các hydrocarbon, quần thể vi khuẩn và các nhân tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật. Những n-alkanes nhìn chung được đánh giá là hợp chất dễ phân hủy nhất trong hỗn hợp dầu mỏ (Atlas, 1981). Qua bảng 2 ta có thể biết được những chất ô nhiễm phù hợp với biện pháp xử lý sinh học. Trong đó, các dung môi hữu cơ trichloroethylene, perchloroethylene, benzene, toluene, etthylbenzene cũng nằm trong số đó. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm năng áp dụng biện pháp xử lý sinh học Nhóm Ví dụ Dung môi có có chứa clo Trichloroethylene Perchloroethylene Hiếu khí Kỵ khí Nguồn + Chất tẩy rửa khô Sản xuất hóa chất 4-Chlorobiphenyl 4,4Dichlorobiphenyl + Sản xuất điện Trạm xăng dầu Đường ray tàu lửa Chlorinated phenol Pentachlorophenol + Hợp chất thơm Benzene Toluene Ethylbenzene Xylene + Xử lý gỗ Đất Sản xuất và tồn trữ dầu Sân bay Sản xuất sơn Sản xuất hóa chất… Hợp chất thơm đa vòng Naphthalene Antracene Fluorene Pyrene Benzo(a)pyrene Atrazine Carbaryl Carbofuran Coumphos Diazinon Glycophosphate Parathion Propham 2,4-D + Polychlorinated biphenyls Thuốc trừ sâu + + Sản xuất và tồn trữ dầu Nhà máy nước ngọt Đất Trạm xăng dầu + Nông nghiệp Nhà máy xử lý gỗ Sản xuất thuốc trừ sâu Đất (*Nguồn: Vidali, 2001) (Ghi chú: *: (+) nằm trong nhóm vi khuẩn) Đối với quần thể vi sinh vật cho quá trình xử lý sinh học, ta có thể chia thành 4 nhóm bao gồm quần thể hiếu khí, kỵ khí, nấm ligninolytic và methylotrohps (Vidali, 2001). Yếu tố môi trường cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân hủy của hydrocarbon. Để đạt được điều kiện phân hủy tốt nhất, môi trường cần đảm bảo ở trạng thái đầy đủ dinh dưỡng với độ ẩm, pH, nhiệt độ thích hợp. Bảng 3 cho ta thấy những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy của hydrocarbon. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học