Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bifidobacteria ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN HOÀNG TUẤN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN HOÀNG TUẤN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTICS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Đào Thị Lương 2. PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Đào Thị Lương Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Bùi Thị Việt Hà - Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh - Khoa Sinh học - Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội, người đã chỉ bảo và góp ý nhiệt tình giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS. TS Dương Văn Hợp, cùng các cô chú anh chị, đặc biệt là Ths. Trần Thị Lệ Quyên và KS. Hà Thị Hằng, thuộc Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học (IMBT) - Đại học Quốc Gia Hà Nội, đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình thực tập. Tôi cũng xin tỏ lòng biết ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh, khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu, tạo nền tảng giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập vừa qua. Xin chân thành cảm ơn !!! Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017 Học viên Nguyễn Hoàng Tuấn CHỮ VIẾT TẮT VTCC Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam) GRAS Generally Recognized as Safe ( Một loại chứng nhận an toàn của FDA) FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) FISH Fluorescence In situ Hydridization (Lai tại chỗ phát huỳnh quang) F-6-PPK Fructose-6-Phosphate Phosphoketolase ATP Adenosine Triphosphat GI Tract Gastrointestinal Tract (Đường tiêu hóa) IBD Inflammatory Bowel Disease (Bệnh viêm ruột) HMO Human Milk Oligosaccharides MRS De Man Rogosa Sharpe CMC Carboxymethyl Cellulose OD Optical Density (Mật độ quang học) CFU Colony Forming Unit (Số lượng tế bào vi khuẩn) MỤC LỤC MỞ ĐẦU......................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3 1.1. Định nghĩa probiotic...................................................................................... 3 1.2. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic ......................................................... 3 1.3. Lợi ích của probiotic....................................................................................... 4 1.4. Bifidobacteria...................................................................................................5 1.4.1. Giới thiệu.......................................................................................... 5 1.4.2. Phân loại...........................................................................................5 1.4.2.1. Hình thái..............................................................................................5 1.4.2.2. Sinh học phân tử..................................................................................6 1.4.3. Môi trường sống...............................................................................9 1.4.4. Đặc điểm sinh lý sinh hóa............................................................. 11 1.4.4.1. Sự trao đổi carbohydrate.................................................................. 11 1.4.4.2. Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu.................................................... 15 1.4.4.3. Độ nhạy cảm oxy...............................................................................15 1.4.5. Bifidobacteria mang đặc tính probiotic........................................ 16 1.4.5.1. Giảm tiêu chảy.................................................................................. 16 1.4.5.2. Làm giảm sự không dung nạp lactose.............................................. 16 1.4.5.3. Ức chế Helicobacter pylori...............................................................17 1.4.5.4. Phòng ngừa bệnh viêm ruột..............................................................17 1.4.5.5. Giảm táo bón.....................................................................................17 1.4.5.6. Phòng ung thư đại trực tràng........................................................... 17 1.4.6. Một số loài bifidobacteria đã được thương mại hóa...................18 1.4.6.1. Bifidobacterium adolescentis............................................................18 1.4.6.2. Bifidobacterium animalis..................................................................18 1.4.6.3. Bifidobacterium bifidium.................................................................. 19 1.4.6.4. Bifidobacterium breve.......................................................................20 1.4.6.5. Bifidobacterium longum....................................................................21 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................... 22 2.1. Nguyên liệu.....................................................................................................22 2.1.1. Chủng vi khuẩn..............................................................................22 2.1.2. Hóa chất..........................................................................................22 2.2. Thiết bị............................................................................................................22 2.3. Môi trường..................................................................................................... 23 2.4. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................24 2.4.1. Phân lập..........................................................................................24 2.4.2. Phân loại bằng sinh học phân tử..................................................24 2.4.3. Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng.................. 29 2.4.3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào.................................................... 29 2.4.3.2. Khả năng sinh trưởng....................................................................... 30 2.4.3.3. Khả năng sinh axít hữu cơ................................................................ 30 2.4.3.4. Khả năng chịu muối mật................................................................... 31 2.4.3.5. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột........................31 2.4.3.6. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mô phỏng................................................................................................ 31 2.4.3.7. Khả năng chịu kháng sinh.................................................................32 2.4.4. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng Bifidobacterium........................................................................................32 2.4.4.1. Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp................................................32 2.4.4.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp..................................................... 32 2.4.4.3. Lựa chọn pH nuôi thích hợp............................................................. 33 2.4.4.4. Lựa chọn nguồn cacbon nuôi thích hợp........................................... 33 2.4.4.5. Lựa chọn nguồn Nitơ nuôi thích hợp................................................33 2.4.4.6. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp................................................... 33 2.4.5. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít..............................................36 2.4.5.1. Chế độ khuấy đảo..............................................................................36 2.4.5.2. Tỷ lệ giống cấy.................................................................................. 36 2.4.5.3. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp................................................... 36 2.4.6. Bước đầu nghiên cứu một số loại chất mang thích hợp cho quá trình đông khô các chủng Bifidobacterium............................................36 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................37 3.1. Phân lập và phân loại....................................................................................37 3.1.1. Phân lập và quan sát hình thái..................................................... 37 3.1.2. Tách DNA genome và xác định gen F-6-PPK............................. 38 3.1.3. Phân loại dưa vào trinh tư rDNA 16S..........................................39 3.2. Nghiên cứu các đặc tính probiotic và lựa chọn chủng Bifidobacterium..42 3.2.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào................................................. 42 3.2.2. Khả năng sinh trưởng và sinh axít hữu cơ.................................. 44 3.2.3. Khả năng chịu muối mật............................................................... 46 3.2.4. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột.................. 47 3.2.5. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột....................................................................................................... 49 3.2.6. Khả năng chịu kháng sinh............................................................ 51 3.3. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của hai chủng Bifidobacterium..........................................................................................53 3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp.................................... 53 3.3.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp................................................ 54 3.3.3. Lựa chọn pH nuôi thích hợp.........................................................55 3.3.4 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp................................................56 3.3.5. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp.................................................... 57 3.3.6. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp...............................................58 3.4. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít......................................................................................59 3.4.1. Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp................................................. 59 3.4.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp...............................................61 3.4.3. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp...............................................62 3.5. Lựa chọn chất mang thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium...............63 KẾT LUẬN................................................................................................................64 KIẾN NGHỊ.............................................................................................................. 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 66 PHỤ LỤC.................................................................................................................. 75 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium....................... 10 Bảng 1.2: Khả năng sinh trưởng của B. longum NCC2705 trên 23 loại carbohydrate...............................................................................................................14 Bảng 3.1: Danh sach cac chung phân lâp nghi ngờ thuôc chi Bifidobacterium......37 Bảng 3.2: Độ tương đồng về trình tự rDNA 16S của các chủng vi khuẩn phân lập với các chủng chuẩn trên GenBank........................................................................... 41 Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme của 20 chủng vi khuẩn Bifidobacterium............. 43 Bảng 3.4: Khả năng sinh trưởng và sinh axit hữu cơ của 20 chủng vi khuẩn......... 45 Bảng 3.5: Khả năng chịu muối mật của 20 chủng vi khuẩn..................................... 46 Bảng 3.6: Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 20 chủng vi khuẩn................48 Bảng 3.7: Khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mô phỏng............................................................................. 50 Bảng 3.8: Khả năng chịu kháng sinh của các chủng vi khuẩn Bifidobacterium......52 Bảng 3.9: Khả năng tồn tại của 2 chủng nghiên cứu trên 4 loại chất mang............63 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Các con đường chuyển hóa Fructose 6-Phosphat ...................................12 Hình 1.2: Sơ đồ khác quá trình sự chuyển hóa đường của bifidobacteria theo Meulen và cộng sự .....................................................................................................13 Hình 1.3: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium......................................6 Hình 1.4: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA 16S.................................................................................................................................8 Hình 1.5: Bifidobacterium adolescentis ...................................................................18 Hình 1.6: Bifidobacterium animalis .........................................................................19 Hình 1.7: Bifidobacterium bifidium ......................................................................... 20 Hình 1.8: Bifidobacterium breve ..............................................................................20 Hình 1.9: Bifidobacterium longum ...........................................................................21 Hình 3.1: Đoan gen F-6-PPK (591 bp) ơ cac chung vi khuân phân lâp đươc khuyếch đai vơi căp môi đăc hiêu UR1 va UL2........................................................39 Hình 3.2: Vị trí phân loại của các chủng Bifidobacterium phân lập và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rDNA 16S..................................................... 40 Hình 3.3: Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium.... 54 Hình 3.4: Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium......... 54 Hình 3.5: Lựa chọn pH nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium................. 55 Hình 3.6: Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho các chủng Bifidobacterium........56 Hình 3.7: Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho các chủng Bifidobacterium............. 57 Hình 3.8: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 3.1............................... 58 Hình 3.9: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 9.2............................... 58 Hình 3.10: Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bf 3.1............................... 60 Hình 3.11: Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bf 9.2............................... 60 Hình 3.12: Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp cho các chủng Bifidobacterium.....61 Hình 3.13: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 3.1 quy mô 5 lít.........62 Hình 3.14: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 9.2 quy mô 5 lít.........62 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 MỞ ĐẦU Probiotic là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích cho sức khoẻ, đã được nghiên cứu rộng rãi và sản xuất thương mại thành nhiều sản phẩm khác nhau trên thế giới. Lợi ích của chúng đối với sức khoẻ con người và động vật đã được chứng minh trong hàng trăm nghiên cứu khoa học. Ruột con người có một hệ sinh thái vi sinh vật rất lớn và đa dạng. Có hàng trăm loài vi khuẩn thường gặp và tổng khối lượng hệ vi sinh vật sống trong đại tràng ước tính khoảng vài trăm gram. Mật độ vi khuẩn trong đường ruột của con người ước tính lên đến 1013-1014, nghĩa là gấp khoảng 10 đến 20 lần tổng số các tế bào trong toàn bộ cơ thể. Hầu hết là các loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, bao gồm Clostridia, Eubacteria, nhóm Bacteroides và các chi Bifidobacterium: như Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve,... bifidobacteria có tự nhiên trong hệ vi sinh vật đường ruột, chiếm đến 25% số lượng vi khuẩn ở người lớn và 80% ở trẻ em, cho thấy sự phân bố của các loài bifidobacteria trong hệ vi sinh vật đường ruột của người lớn như thế nào. Bifidobacterium đã được chứng minh có các đặc tính probiotic, sử dụng chúng hiệu quả trong việc phòng ngừa và điều trị các tiệu chứng rối loạn tiêu hóa ở con người và động vật như: táo bón, nhiễm trùng đường ruột, u đại tràng và ung thư. Ngoài ra, bifidobacteria đã được cấp chứng chỉ GRAS (Generally Recognised As Safe) để chứng minh tính an toàn của chúng. Nhờ đó, Bifidobacterium được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm sữa lên men, thực phẩm chức năng và dược phẩm dùng cho cả con người cũng như động vật. Hiện nay, đã có mặt nhiều chế phẩm chứa Bifidobacterium trên thị trường Việt Nam, nhưng đa số là nhập khẩu, hoặc đóng gói tại Việt Nam nhưng nguyên liệu nhập khẩu từ nước ngoài. Mặc dù đã có những chế phẩm chứa Bifidobacterium xuất xứ từ Việt Nam, tuy nhiên các nghiên cứu về nguồn gốc, đặc tính probiotic, quy trình sản xuất chủng vẫn còn chưa nhiều. 1 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 Từ những đặc điểm trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:  Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bifidobacterium có các đặc tính probiotic tốt, từ những nguồn gốc khác nhau ở Việt Nam.  Phân loại và lựa chọn các chủng vi khuẩn Bifidobacterium có đặc tính sinh học an toàn.  Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy cho sinh khối cao, qua đó ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm probiotic cho động vật cũng như con người. Ngoài ra việc phân lập được các chủng Bifidobacterium cũng giúp phong phú thêm bộ sưu tập nguồn gen Quốc Gia ở Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) – Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội còn hạn chế về số lượng. 2 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Định nghĩa probiotic Probiotic xuất phát từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là "cho cuộc sống", ban đầu được nó được sử dụng với ý nghĩa trái ngược với từ "kháng sinh". Tuy nhiên, định nghĩa này đã được cải tiến trong những năm qua. Ban đầu, probiotic được mô tả là chất tăng cường sức khoẻ của bệnh nhân suy dinh dưỡng, kích thích sự phát triển của các vi sinh vật khác, hoặc góp phần vào cân bằng vi khuẩn đường ruột. Các định nghĩa gần đây cho thấy rằng probiotic bao gồm các vi sinh vật sống [62]. Trong đó, định nghĩa của Fuller (1992) được sử dụng rộng rãi: “Probiotic như là một chất bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột”. Theo khuyến cáo của một nhóm làm việc cho FAO / WHO về việc đánh giá probiotic trong thực phẩm, probiotic được định nghĩa là "các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích cho sức khoẻ"[23]. 1.2. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic [62] Tiêu chuẩn an toàn  Có nguồn gốc rõ ràng.  Xác định chính xác về phân loại.  Không độc hại, không gây bệnh, đạt tiêu chuẩn GRAS.  Đặc tính chủng: Chịu kháng sinh ở nồng độ thấp và có hoạt động trao đổi chất trong cơ thể vật chủ. Tính phù hợp về công nghệ  Có khả năng sản xuất và bảo quản số lượng lớn  Mật độ cao (ưu tiên 106 -108 CFU/ml,g).  Mang lại các tính chất cảm quan mong muốn (hoặc không có những phẩm chất không mong muốn).  Ổn định di truyền.  Kháng Phage. 3 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 Tiêu chuẩn chức năng  Kháng với muối mật và axit.  Bám dính được vào bề mặt niêm mạc.  Có khả năng sống sót, tăng sinh và hoạt động trao đổi chất ở vị trí mục tiêu trong cơ thể sống.  Có khả năng sinh bacteriocin, axit hữu cơ và một số các chất kháng khuẩn để cạnh tranh với các vi khuẩn khác.  Có khả năng mang lại một hoặc nhiều lợi ích về sức khoẻ được kiểm chứng lâm sàng. Tiêu chuẩn sinh lý và ảnh hưởng đến sức khỏe mong muốn  Phản ứng đối với vi khuẩn gây bệnh / ung thư.  Sản sinh các chất chống vi khuẩn (bacteriocin, hydrogen peroxide, axit hữu cơ hoặc hợp chất ức chế khác).  Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vắc-xin, peptide).  Cải thiện các phản ứng miễn dịch.  Giảm dị ứng lactose.  Giảm cholesterol huyết thanh.  Phòng ngừa một số loại bệnh tiêu chảy. 1.3. Lợi ích của probiotic Các tác động có lợi cho sức khoẻ của probiotic, được ghi nhận đối với một số chủng nhất định, bao gồm ngăn ngừa một số loại bệnh tiêu chảy, đặc biệt do rotavirus, giảm các triệu chứng liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá nhiều, giảm tỷ lệ dị ứng ở người dễ bị dị ứng, cải thiện đáp ứng miễn dịch, giảm hiện tượng không dung nạp lactose và giảm các chất chuyển hóa không có lợi. Một số ảnh hưởng có lợi khác liên quan đến sức khoẻ, thông qua việc sử dụng probiotic như sau: phòng ngừa hoặc giảm triệu chứng viêm ruột mạn tính, giảm nguy cơ tiêu chảy cấp ở trẻ em, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường hô hấp, ức chế Helicobacter pylori và giảm cholesterol huyết thanh [45]. 4 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 Hơn nữa, probiotic có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và các cơ quan khác bằng cách điều biến các thông số miễn dịch, tính thấm qua ruột hoặc bằng cách cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học. Các cơ chế được nghiên cứu bởi De Vrese và Schrezenmeir (2008) bao gồm: Giảm pH ruột; Sản xuất các chất diệt khuẩn (ví dụ axit hữu cơ, H2O2 và bacteriocin); Sự kết tụ các vi sinh vật gây bệnh; Tăng cường sự vững chắc cho các chất nền lên men hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào niêm mạc ruột; Hấp thu và chuyển hóa các chất có khả năng gây bệnh, độc hại hoặc ung thư; Điều biến các cơ chế miễn dịch; Kích thích nhu động ruột và sản xuất chất nhầy [16]. 1.4. Bifidobacteria 1.4.1. Giới thiệu Năm 1899, Tissier quan sát và phân lập vi khuẩn hình chữ Y trong phân của trẻ sơ sinh bú mẹ và gọi nó là "Bacillus bifidus communis" (Lat. Bifidus: đứt đoạn, phân nhánh). Tuy nhiên, do sự tương đồng với lactobacilli, bifidobacteria đã được đưa vào chi Lactobacillus. Và mãi cho đến khi đến khi hệ thống phân loại vi khuẩn mới của Bergey ra đời trong ấn bản cùng tên tái bản lần thứ VIII, chúng mới được phân loại lại và công nhận là một chi riêng. Khác với Lactobacillus, bifidobacteria có fructose-6-phosphate phosphoketolase, không có aldolase hoặc glucose-6-phosphate dehydrogenase và có hàm lượng G+C trong DNA cao nằm trong khoảng từ 55 đến 67%. Bifidobacteria catalase âm tính, ngoại trừ B. indicum và B. asteroids [6;11]. Chi Bifidobacterium, gồm 42 loài, thuộc Họ Bifidobacteriaceae, Bộ Bifidobacteriales, Phân lớp Actinobacteridae, Lớp Actinobacteria, Ngành Firmicutes, Giới Vi khuẩn[7]. 1.4.2. Phân loại 1.4.2.1. Hình thái Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, sống kỵ khí, không di động, không hình thành bào tử , tế bào thường cong, hình que phân nhánh, dạng đơn lẻ, xếp chuỗi hoặc tạo thành các cụm, dạng chữ “Y” hoặc “V” (Hình 1.3) [6]. 5 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 Hình 1.1: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium [71] 1.4.2.2. Sinh học phân tử Phân loại đến chi Bifidobacteria có enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK) (EC 4.1.2.22), tham gia vào quá trình phân huỷ glucose qua con đường phosphoketolase hay còn gọi là "bifid shunt" thông qua erythrose-4-phosphate và acetyl-phosphate, đây là điểm khác biệt với vi khuẩn đường ruột khác. Do đó enzyme này cũng như gen mã hóa cho nó được dùng để làm phân tử chỉ thị cho nhóm này [5]. Phân loại đến loài Sự khác biệt của các loài trong chi thường dựa vào sự đồng nhất DNA-DNA hoặc các đặc tính hình thái khác nhau. Trong những năm gần đây, sự chú ý của nhiều nhà khoa học về mặt phân loại đã được thu hút vào các đầu dò DNA và gen rRNA. Các chuỗi DNA được sử dụng phổ biến nhất để nhận diện bifidobacteria ở chi và mức độ loài là gen 16S rRNA và 23S rRNA, cũng như vùng gen internal transcribed spacer (ITS) nằm giữa các gen rRNA 16S và 23S. Đặc biệt, trình tự rDNA 16S có 9 vùng biến đổi, đặc biệt thích hợp để thiết kế oligonucleotides dùng để định danh đến loài nhóm bifidobacteria. Ngoài ra, ưu điểm của việc sử dụng các gen rRNA là số lượng bản sao của chúng trong một tế bào vi khuẩn khá cao. Roy và cộng sự (1996) đã nghiên cứu thiết kế được các oligonucleotides dựa trên chuỗi 16S rDNA sử dụng cho B. breve, B. infantis, và B. longum. Sau đó, Matsuki và cộng sự (1998, 1999) đã 6 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 thiết kế được các cặp primer đặc hiệu cho hầu hết các loài Bifidobacterium sống ở đường ruột của con người như: B. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum, B. longum, B. infantis, B. dentium và B. gallicum [10] (Hình 1.4). Ngoài phân tích trình tự rDNA 16S, SR 23S và 16S-23S, hiện nay để phân biệt các loài có mối quan hệ gần gũi cùng thuộc chi Bifidobacterium, trình tự gen của protein ưa nhiệt 60 kDa (HSP60) được sử dụng. HSP60 là một protein thuộc họ chaperonin, thành viên họ này có trong tất cả các vi khuẩn và tế bào eukaryote ở các cơ quan như ty thể và lục lạp, gen HSP60 không dễ dàng chuyển từ một vi khuẩn này sang vi khuẩn khác, tính bảo thủ cao và có một bản sao trong gần như tất cả các loài vi khuẩn, do đó rất đặc trưng cho từng loài vi khuẩn. Những đặc điểm trên cho thấy HSP60 một đại phân tử thích hợp cho nghiên cứu phát sinh loài của các loài vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi với nhau. 7 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 Hình 1.2: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA 16S [24] 8 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 1.4.3. Môi trường sống Môi trường sống của bifidobacteria chủ yếu là trong đường ruột của động vật máu nóng. Đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh ở con người (chủ yếu là sâu răng) nhưng thường chúng được coi là không gây bệnh. Thông thường, các loài Bifidobacterium là đặc trưng đối với người và động vật; Ngoài ra, đã có nghiên cứu chứng minh rằng bifidobacteria có trong nước thải và trong các sản phẩm sữa lên men [6]. Ruột của trẻ sơ sinh bị xâm chiếm bởi vi sinh vật từ hệ sinh dục của người mẹ và môi trường bên ngoài. Ngoài ra, các nghiên cứu mới cho thấy việc di chuyển vi khuẩn từ tuyến ruột sang tuyến vú của người mẹ có thể là nguồn lây nhiễm cho sữa mẹ và dẫn đến sự lây lan sang ruột của trẻ sơ sinh [47]. Các nghiên cứu sử dụng công nghệ lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho thấy bifidobacteria chiếm tới 75% tổng số vi khuẩn trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và đến 91% trẻ bú sữa mẹ [28]. Theo thời gian số lượng bifidobacteria trong đường tiêu hoá của con người giảm dần, các vi sinh vật trong phân của trẻ em tương tự như người lớn sau hai năm đầu đời. Ở người cao tuổi, số lượng bifidobacteria thấp hơn, trong khi số lượng Clostridium trong phân tăng lên [51]. 9 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 2017 Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium Loài Chủng Nguồn ATCC15703T Phân, ruột thừa, răng bị sâu và âm đạo người lớn Phân lập từ người B. adolescentis Phân người lớn B. angulatum B. bifidum DSM 20215 Phân trẻ sơ sinh và phân, âm đạo JCM 1254 người trưởng thành NCIMB 41171 B. longum bv. infantis ATCC 15697 Phân và âm đạo trẻ sơ sinh B. breve UCC2003 Phân và âm đạo trẻ sơ sinh Phân người trưởng thành B. catenulatum Phân lập từ động vật B.animalis ssp. animalis Phân, ruột chuột, gà, thỏ và phân bê B. longum bv. suis Phân lợn con B. asteroides Ruột ong mật B. bouom Phân lợn B. choerimum Phân lợn con B. coryneforme B. pullorum ATCC 49618 Phân gà Phân lập từ nguồn gốc khác B. animalis ssp. lactis Sữa lên men B. minimum Nước thải B. subtile Nguồn: [9; 63; 36; 33] 10 Nước thải | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24