Tài liệu Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học học của fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam NGUYỄN NGỌC ANH [email protected] Ngành Kỹ thuật hóa học Giảng viên hướng dẫn: TS. Hồ Đức Cường ____________ Chữ ký của GVHD PGS. Thành Thị Thu ____________ Thủy Viện: Kỹ thuật Hóa học Hà Nội, 09/2022 Chữ ký của GVHD CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên tác giả: Nguyễn Ngọc Anh Đề tài luận văn: Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số HV: 20202251M Tác giả, tập thể Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 23/09/2022 với các nội dung sau: STT Nội dung đề nghị chỉnh sửa Nội dung chỉnh sửa 1 Loại bỏ các trích dẫn tài liệu thảm Loại bỏ 04 tài liệu tham khảo khảo tại mục “Tóm tắt nội dung” trích dẫn tại mục “Tóm tắt nội dung” 2 Rà soát, chỉnh sửa và giảm bớt tài Rà soát và giảm bớt số lượng liệu tham khảo TLTK từ 124 xuống 98 TLTK 3 Bổ sung phổ GC, thay thế các phổ Thay thế các phổ chưa rõ nét, bổ chưa rõ nét sung phổ GC mẫu Ftđ (Phụ lục 3) 4 Rà soát lại số liệu IC50 thử nghiệm Rà soát và hiệu đính bảng kết quả hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính (Bảng 4.5) Ngày 10 tháng 10 năm2022 Giảng viên hướng dẫn TS. Hồ Đức Cường PGS. Thành Thị Thu Thủy Tác giả Nguyễn Ngọc Anh CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS. TS. Vũ Đình Hoàng SĐH.QT.BM11 Ban hành lần 1 ngày 11/11/2014 Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các cán bộ hướng dẫn khoa học TS. Hồ Đức Cường và PGS. Thành Thị Thu Thủy. Đây là những người thầy đã cho tôi những chia sẻ, sự hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô bộ môn: Công nghệ Hóa dược và BVTV, Viện Kỹ thuật Hóa học, ĐH BKHN cùng các cán bộ Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị thí nghiệm để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ nghiên cứu được giao. Sau cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên về tinh thần, thời gian và vật chất để tôi có động lực trong công việc và học tập. Tóm tắt nội dung luận văn Fucoidan là sulfate polysaccharide có trong rong nâu với nhiều hoạt tính sinh học quý báu nên luôn thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước và trên thế giới. Nhiều năm gần đây, các nhà khoa học hướng đến nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố cấu trúc như: trọng lượng phân tử, thành phần đường, liên kết glycoside, vị trí và hàm lượng nhóm sulfate đến hoạt tính sinh học của các sulfate polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng. Tuy nhiên vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được làm rõ và cần được tiếp tục nghiên cứu. Với mục tiêu nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của các fucoidan nhằm đóng góp vào việc làm sáng tỏ mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của fucoidan, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam” với các nội dung và phương pháp nghiên cứu cụ thể như sau:  Thu thập mẫu rong nâu Turbinaria decurrens B. tại biển Kiên Giang.  Chiết tách fucoidan từ loài rong này theo phương pháp của Bilan và CS thu được mẫu Ftđ. Xác định cấu trúc mẫu Ftđ bằng các phương pháp IR, NMR, MS, GPC…  Nghiên cứu và thực hiện tạo các mẫu fucoidan trọng lượng phân tử thấp (LMWF) bằng cách thủy phân mẫu Ftđ bằng acid HCl 0,1N với thời gian thủy phân khác nhau thu được 7 mẫu M1 – M7. Trọng lượng phân tử (TLPT) của các mẫu Ftđ và M1 – M7 được xác định bằng phương pháp GPC.  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư ở người của các mẫu Ftđ và M1 – M7 theo phương pháp của Skekan và CS. Đánh giá sự ảnh hướng của TLPT đến hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan. Với mục tiêu và nội dung nghiên cứu nêu trên, nhóm nghiên cứu đã lên kế hoạch thực hiện đúng tiến độ và thu được các kết quả như sau: Mẫu fucoidan Ftđ phân lập từ loài T. decurrens B. với hàm lượng 2,9% là một galactofucan với cấu trúc hóa học xác định. Các mẫu LMWF (M1 – M7) có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư đại tràng ở người HT29 tốt hơn mẫu tự nhiên. Trong đó, mẫu M5 với thời gian thủy phân 30 phút và TLPT 96.000 g/mol thể hiện hoạt tính tốt nhất và cao hơn 92,6% so với mẫu tự nhiên Ftđ. Tiếp tục tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của mẫu M5 trên 2 dòng tế bào ung thư tuyến giáp và ung thư cổ tử cung ở người cho thấy mẫu M5 cũng thể hiện hoạt tính rất tốt trên cả 2 dòng tế bào ung thư này. Các kết quả đạt được, một lần nữa khẳng định và bổ sung thông tin cho các nghiên cứu trước đó rằng trọng lượng phân tử là một yếu tố cấu trúc ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính sinh học của fucoidan. Ngoài ra, kết quả cũng góp phần định hướng cho việc sử dụng fucoidan phục vụ cho cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực Y– dược. Học viên Nguyễn Ngọc Anh MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................................ 1 1.1. Tổng quan về rong biển ................................................................................. 1 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển .......................................................... 1 1.1.2. Nguồn lợi từ rong biển ..................................................................... 2 1.1.3. Phân loài rong biển ........................................................................... 3 1.1.4. Một số ngành rong biển phổ biến ..................................................... 4 1.1.5. Giới thiệu về rong nâu Turbinaria decurrens B. ............................. 7 1.2. Tổng quan về polysaccharide từ rong biển ................................................... 8 1.2.1. Polysaccharide từ các loài rong lục .................................................. 9 1.2.2. Polysaccharide từ các loài rong đỏ ................................................. 11 1.2.3. Polysaccharide từ các loài rong nâu ............................................... 12 1.3. Fucoidan từ rong nâu ................................................................................... 14 1.3.1. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu ......................... 14 1.3.2. Thành phần và cấu trúc của fucoidan từ rong nâu ......................... 17 1.3.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu ................................. 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 29 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 29 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 29 2.3. Cơ sở lý thuyết của các phương pháp nghiên cứu....................................... 29 2.3.1. Phương pháp chiết .......................................................................... 29 2.3.2. Chiết tách polysaccharide từ rong biển .......................................... 30 2.3.3. Phương pháp tạo fucoidan trọng lượng phân tử thấp ..................... 31 2.3.4. Phương pháp GPC nghiên cứu cấu trúc polysaccharide ................ 32 2.3.5. Phương pháp IR trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide .... 33 2.3.6. Phương pháp NMR trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide ..... 34 2.3.7. Phương pháp phổ khối lượng trong nghiên cứu polysaccharide .... 36 2.3.8. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ............................ 37 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 39 3.1. Thu thập và xử lý mẫu rong ........................................................................ 39 3.2. Xác định các thành phần chính có trong mẫu rong ..................................... 39 3.2.1. Xác định độ ẩm .............................................................................. 39 3.2.2. Xác định hàm lượng tro.................................................................. 40 3.2.3. Xác định hàm lượng protein thô..................................................... 40 3.2.4. Xác định hàm lượng lipid thô......................................................... 41 3.2.5. Xác định hàm lượng laminaran ...................................................... 42 3.2.6. Xác định hàm lượng acid alginic ................................................... 42 3.3. Chiết tách và tinh chế fucoidan từ rong nâu T. decurrens B. ...................... 43 3.4. Xác định thành phần hóa học của fucoidan từ T. decurrens B. .................. 45 3.4.1. Xác định thành phần đường ........................................................... 45 3.4.2. Xác định hàm lượng sulfate ........................................................... 45 3.4.2. Xác định hàm lượng acid uronic .................................................... 46 3.5. Xác định cấu trúc của fucoidan từ T. decurrens B. ..................................... 46 3.5.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ................................................. 46 3.5.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................ 46 3.5.3. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ..................................... 46 3.6. Thủy phân tạo các fucoidan trọng lượng phân từ thấp (LMWF) ................ 46 3.7. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Ftđ và LMWF ................... 47 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 48 4.1. Thành phần hóa học của mẫu rong T. decurrens B. .................................... 48 4.2. Thành phần hóa học của fucoidan từ rong nâu T. decurrens B. ................. 48 4.3. Phân tích cấu trúc fucoidan (Ftđ) từ rong nâu T. decurrens B. .................... 49 4.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) ....................................................................... 49 4.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .............................................. 49 4.3.3. Phổ khối lượng ESI – MS/MS ....................................................... 51 4.4. Kết quả xác định TLPT của các mẫu Ftđ và LMWF M1–M7 ....................... 56 4.5. Kết quả đánh giá hoạt tính gây tốc tế bào và ảnh hưởng của TLPT đến hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan .......................................................................... 57 4.6. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của mẫu M5 .............................. 59 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN ................................................................................. 60 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 60 5.2. Hướng phát triển trong tương lai ................................................................. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 62 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 72 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp chiết tách fucoidan được thực hiện đầu tiên............ 15 Bảng 1.2 Một số phương pháp chiết tách fucoidan hiện nay ............................... 15 Bảng 1.3 Thành phần của fucoidan từ rong nâu thuộc bộ Fucales ...................... 20 Bảng 1.4 Thành phần của fucoidan từ rong nâu thuộc bộ Dictyotales ................ 21 Bảng 1.5 Thành phần của fucoidan từ rong nâu thuộc bộ Laminariales ............. 21 Bảng 1.6 Cấu trúc đặc trưng của fucoidan phân lập từ một số bộ khác nhau ...... 24 Bảng 1.7 Cơ chế tác dụng của fucoidan với khối u ............................................. 27 Bảng 2.1 Một số tín hiệu phổ IR đặc trưng của polysaccharide từ rong biển...... 33 Bảng 2.2 Độ chuyển dịch hóa học của một số monosaccharide trong D2O. ....... 36 Bảng 4.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của mẫu rong (%) .................... 48 Bảng 4.2 Kết quả phân tích thành phần hóa học của mẫu Ftđ .............................. 49 Bảng 4.3 Sự phân mảnh của các mono và oligosaccharide ................................. 52 Bảng 4.4 Kết quả sắc ký thẩm thấu Gel (GPC) ................................................... 56 Bảng 4.5 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 57 Bảng 4.6 Kết quả TLPT và hoạt tính của các mẫu Ftđ và LMWF ........................ 58 Bảng 4.7 Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của mẫu M5 trên các dòng TBUT .... 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh một số loài rong nâu ................................................................ 5 Hình 1.2 Hình ảnh một số loài rong đỏ .................................................................. 6 Hình 1.3 Hình ảnh một số loài rong lục ................................................................. 6 Hình 1.4 Hình ảnh một số đặc điểm của loài T. decurrens B. ............................... 8 Hình 1.5 Cấu trúc Ulvan từ rong lục .................................................................... 10 Hình 1.6 Cấu trúc của một số polysaccharide từ rong đỏ .................................... 12 Hình 1.7 Cấu trúc của một số polysaccharide từ rong nâu .................................. 13 Hình 1.8 Các monosaccharide là thành phần cấu tạo của fucoidan ..................... 17 Hình 1.9 Đồ thị thành phần của fucoidan từ họ Fucaceae .................................. 18 Hình 1.10 Đồ thị thành phần fucoidan từ họ Sargassaceae................................. 18 Hình 1.11 Đồ thị hàm lượng sulfate có trong fucoidan từ bộ Dictyotales ........... 19 Hình 4.1 Phổ IR của mẫu Ftđ ................................................................................ 49 Hình 4.2 Phổ 1H – NMR của mẫu Ftđ .................................................................. 50 Hình 4.3 Phổ 13C – NMR của mẫu Ftđ ................................................................. 50 Hình 4.4 Sự phân mảnh của các oligosaccharide................................................. 51 Hình 4.5 Phổ ESI – MS/MS của mẫu Ftđ ............................................................. 52 Hình 4.6 Phổ ESI – MS/MS của mẫu Ftđ phân mảnh m/z 243 ............................. 53 Hình 4.7 Phổ ESI–MS/MS của mẫu Ftđ phân mảnh m/z 389 ............................... 54 Hình 4.8 Phổ ESI – MS/MS mẫu Ftđ phân mảnh m/z 491 .................................... 54 Hình 4.9 Phổ đồ ESI – MS/MS mẫu Ftđ phân mảnh m/z 405 .............................. 55 Hình 4.10 Cấu trúc hóa học của mẫu Ftđ .............................................................. 56 Hình 4.11 Ảnh hưởng của Tthủy phân tới trọng lượng phân tử ............................... 57 Hình 4.12 Đồ thị mối quan hệ của TLPT tới hoạt tính ........................................ 58 Hình 4.13 Hình ảnh so sánh tế bào ung thư sau khi đã xử lý .............................. 59 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết và tinh chế fucoidan từ loài T. decurrens B. .............. 44 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh 13 1 C-NMR H-NMR Carbon-13 resonance Diễn giải nuclear Proton nuclear resonance magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H COSY Correlated Spectroscopy DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray ionization spectrometry FAO Food and agriculture organization of the United Nations Gel permeation chromatography GPC Phổ COSY mass Phổ phun mù điện tử Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc Sắc ký thẩm thấu gel bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HMBC Heteronuclear coherence multiple HSQC Heteronuclear coherence single-quantum IR Infrared spectroscopy LA 3,6-L-anhydrogalactose Phổ hồng ngoại Fucoidan trọng lượng phân tử thấp LMWF MS Mass spectroscopy Phổ khối lượng Mw Molecular weight Trọng lượng phân tử MWCO Molecular weight cut-off NOESY Nuclear overhauser spectroscopy effect Phổ NOESY TBUT Tế bào ung thư TLPT Trọng lượng phân tử TLTK Tài liệu tham khảo WoRMS JIRCAS World Register of Marine Species Japan International Research Center for Agricultural Science CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong biển 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển Rong biển còn được gọi là tảo bẹ hay cỏ biển, tên khoa học là marine – algae, marine plant hay seaweed, là những loài thực vật thuỷ sinh, sự sống gắn liền với nước. Chúng có thể là các đơn bào hay đa bào với nhiều hình dạng, kích thước khác nhau và sống thành quần thể. Là nhóm thực vật bậc thấp, thường sống trong các thuỷ vực nước mặn và nước lợ ở các vùng ven biển, cửa sông và các đảo xa bờ, chúng mọc trên các rạn san hô hay trên các vách đá, một số mọc được cả dưới tầng nước sâu có ánh sáng mặt trời chiếu tới. Trước khi được con người khai thác và sử dụng, rong biển chỉ là nguồn làm thức ăn cho thuỷ sản sống dưới đáy đại dương. Bắt đầu từ thế kỷ thứ IV tại các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc con người đã bắt đầu sử dụng rong biển như một loại thực phẩm, từ đó nhu cầu sử dụng rong biển lan qua các nước Bắc Mỹ, Nam Mỹ và các nước Châu Âu [1]. Từ những năm cuối thế kỷ XIX đến đầu thế kỷ XX, con người bắt đầu khai thác và sử dụng rong biển nhiều hơn phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp thiết yếu như: thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và sinh học... Ngoài ra, rong biển còn có thể sử dụng làm thức ăn cho cây trồng, chúng cung cấp hàm lượng khoáng chất và các nguyên tố vi lượng khá cao. Rong biển được coi là một món quà quý giá của tự nhiên được con người sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đem lại giá trị kinh tế cao [2]. Tại các nước Châu Á – Thái Bình Dương, sản lượng tiêu thụ rong biển lên đến 80% tổng sản lượng ước tính của toàn thế giới, nhu cầu sử dụng rong biển tăng dần qua mỗi năm ước tính khoảng 10% mỗi năm. Tại các nước phương Tây, rong biển được sử dụng nhiều để chế biến thức ăn và cung cấp khoảng 90% các sản phẩm keo trên thế giới được sản xuất tại các nước này [1]. Thành phần hóa học của rong biển bao gồm lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó, polysaccharide là thành phần chính của rong biển, được coi là nguồn đường vô tận của rong biển, được cho là rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học. Ngoài chức năng là làm 1 vật liệu cấu tạo nên thành tế bào, polysaccharide còn mang nhiều chức năng quan trọng khác đối với tế bào như trao đổi chất và bảo vệ tế bào do chúng có độ bền cơ học cao [3]. Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo rong quan trọng như agar, alginate, carrageenan, furcellazan, fucoidan dùng cho công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học… 1.1.2. Nguồn lợi từ rong biển Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO – 2000), sản lượng rong biển trên toàn thế giới đạt khoảng 15 triệu tấn rong tươi một năm. Doanh thu hàng năm từ kinh tế rong biển ước tính vào khoảng 8 tỷ USD. Trong đó polysaccharide đóng góp phần lớn giá trị của rong biển, khoảng 80% được dùng trực tiếp làm thức ăn cho người, số còn lại được sử dụng cho việc sản xuất các loại keo như agar, alginate, carrageenan hay chế biến thức ăn cho gia súc và làm phân bón cho cây trồng [4]. Từ rong biển, người ta đã sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng giá trị hàng năm được ước tính đạt cỡ 7,5 – 8,0 tỷ USD. Các sản phẩm mỹ phẩm, như kem bôi da, nước hoa mà trong nhãn của nó có chứa các cụm từ “marine extract”, “extract of alga”, “seaweed extract” hoặc tương tự, thường có nghĩa là nó chứa một trong số các hydrocolloid được chiết từ rong biển [5]. Đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá rong biển có giá trị dinh dưỡng cao khi cung cấp đầy đủ các chất khoáng, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng, các acid amin cần thiết cho cơ thể, các loại vitamin (A, B, C, E), các carbohydrate đặc trưng và các chất có hoạt tính sinh học (lecithin, sterol, antibiotic) có lợi cho cơ thể và có khả năng phòng bệnh (huyết áp, nhuận tràng, béo phì, đông tụ máu). Bên cạnh đó, thực tiễn còn cho thấy rong biển còn có tiềm năng trong xử lý nước thải. Một số loài còn có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng (Zn, Cd) từ nước bị ô nhiễm [3]. Polysaccharide chiết tách từ rong biển có các tính chất đặc biệt như là dễ tạo gel, có độ nhớt cao nên được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế (y tế, thực phẩm, mỹ phẩm...). Ngoài ra, do tính chất dễ tạo màng, nên có thể dùng polysaccharide tự nhiên để tạo màng sinh học. 2 Một tác dụng khác của polymer sinh học này là khả năng hấp thụ cholesterol để thải ra ngoài cơ thể, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu ổn định ở mức cân bằng. Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu khoa học công bố đã chỉ ra rằng, rong biển có tác dụng chống virus và phòng chống ung thư. Do đó, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và đang ngày càng được ưa chuộng trên thế giới. 1.1.3. Phân loài rong biển Việc phân loại rong biển được dựa trên sự khác nhau về các đặc điểm hình thái, màu sắc hay sắc tố quang hợp. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được khoảng hơn 10.000 loài rong biển và phân thành 4 ngành rong chính có giá trị kinh tế cao: Rong đỏ (Rhodophyta) khoảng 6.000 loài, rong nâu (Phaeophyta) khoảng 1.800 loài, rong lam (Cyanophyta) với khoảng 1.500 loài, rong lục (Chlorophyta) khoảng 1.200 loài [6]. Hệ thống phân loại 10 ngành rong của Gollerbakh (1977): • Ngành rong Lục (Chlorophyta) • Ngành rong Trần (Euglenophyta) • Ngành rong Giáp (Pyrrophyta) • Ngành rong Khuê (Bacillariophyta) • Ngành rong Vàng Anh (Chrysophyta) • Ngành rong Vàng (Xanthophyta) • Ngành rong Nâu (Phaeophyta) • Ngành rong Đỏ (Rhodophyta) • Ngành rong Lam (Cyanophyta) • Ngành rong Vòng (Charophyta) Ở Việt Nam, giai đoạn trước năm 1954 việc nghiên cứu về rong biển hoàn toàn do người nước ngoài thực hiện. Sau những năm 1964, việc nghiên cứu này bước đầu được tiến hành bởi các nhà khoa học trong nước. Một số sách và các công trình nghiên cứu đã được xuất bản sau đó như: Rong biển Việt Nam – phần phía Nam, Rong biển Việt Nam – phần phía Bắc. So với các nước thuộc vùng Đông Nam Á, nước ta là nước có nguồn rong biển đa dạng và phong phú. Việt Nam với khí hậu nhiệt đới có đường bờ biển dài khoảng 3.260 km cùng với nhiều đảo và quần đảo lớn nhỏ. Với các điều kiện tự 3 nhiên thuận lợi cũng như độ mặn của các vùng ven biển rất thuận lợi cho rong biển phát triển. Việt Nam ta có hệ thực vật tảo rất phong phú và đa dạng thể hiện ở số lượng và thành phần loài. Qua các nghiên cứu và khảo sát công bố tháng 03/2022 cho thấy, hiện nay đã xác định được hơn 805 loài thuộc 4 ngành rong chính: Rong đỏ khoảng 409 loài, rong lục 182 loài, rong nâu với khoảng 149 loài và rong lam với gần 65 loài. Trong đó 90 loài có giá trị quan trọng đối với ngành kinh tế [7]. 1.1.4. Một số ngành rong biển phổ biến Trong phân loại 10 ngành rong của Gollerbakh, ngành rong đỏ, rong nâu và rong lục là những ngành phong phú về số lượng loài, được nghiên cứu rộng rãi và có khả năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực. a. Ngành rong nâu (Phaeophyta) Rong nâu (Phaeophyta) được tìm thấy nhiều ở các quốc gia châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản với khoảng gần 1.800 loài. Tại Việt Nam các nhà khoa học đã xác định được 140 loài rong nâu, chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina [8]. Các loài rong thuộc ngành này có kích thước lớn, loài lớn nhất thường dài khoảng 20 m, loài trung bình dài từ 2 – 4 m và những loài nhỏ hơn với chiếu dài từ 30 – 60 cm. Chúng chứa sắc tố xanthophyll – fucoxanthin cùng với chlorophyll a và c nên có màu nâu lục đặc trưng. 4 Hình 1.1 Hình ảnh một số loài rong nâu Rong nâu thường sinh trưởng ở vùng biển đá, nước biển lạnh thuộc Bắc bán cầu, chúng mọc cả trên đá và chân đập, cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và cũng có thể mọc ngay trên các loài rong khác. Trước đây rong nâu là nguyên liệu để chiết tách iodine và kalium, trong nhiều năm trở lại đây, rong nâu được khai thác để chiết tách alginate và fucoidan [9]. b. Ngành rong đỏ (Rhodophyta) Rong đỏ (Rhodophyta) là loài có kích thước nhỏ hơn rong nâu, dài từ vài centimeter đến hàng meter. Các loài rong thuộc ngành này không chỉ có màu đỏ, một số loài có màu tím hoặc nâu đỏ cũng được xếp vào ngành rong này do chúng có chứa hạt sắc tố phycobilin (là sắc tố đặc trưng của các loài rong đỏ). Với khoảng 2.500 loài đã được tìm thấy, gồm 400 chi thuộc nhiều họ, phần lớn chúng sống ở các vùng biển, cấu tạo từ nhiều tế bào [8]. Rong đỏ có dạng hình trụ dẹp dài, phiến chia hoặc không chia nhánh. Được sử dụng để chế biến keo rong biển và làm phụ gia thực phẩm do có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran. Phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippine… [10]. 5 Hình 1.2 Hình ảnh một số loài rong đỏ c. Ngành rong lục (Chlorophyta) Rong lục (Chlorophyta) là loài rong có kích thước nhỏ, nhìn qua thì gần giống như rong đỏ, bao gồm cả những loài đơn bào và đa bào. Với khoảng 1.200 loài đã được tìm thấy, khoảng 90% trong số chúng sống ở các vùng nước ngọt, 10% còn lại sống ở biển và đại dương. Tại các vùng biển và đại dương trên thế giới đã tìm thấy 948 loài rong lục thuộc 112 chi, 18 họ và 8 bộ. Rong lục chứa cả hai sắc số chlorophylls ở dạng a và b. Trên thế giới, rong lục phân bố chủ yếu tập trung tại Philippine, Hàn Quốc, Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài như Ulva reticulata, Ulva lactuca, Caulerpa racemosa… [8]. Hình 1.3 Hình ảnh một số loài rong lục 6 1.1.5. Giới thiệu về rong nâu Turbinaria decurrens B. Thông tin theo cơ sở dữ liệu sinh vật biển WoRMS (World Register of Marine Species) và JIRCAS (Japan International Research Center for Agricultural Science). a. Tên gọi và phân loài thực vật Tên gọi Tên khoa học: Turbinaria decurrens B. (Viết tắt: T. decurrens B.) Tên thường gọi (hay tên địa phương): Rong cùi bắp cạnh Phân loài thực vật Giới : Thực vật (Planet) Ngành : Phaeophyta Lớp : Phaeophyceae Phân lớp : Fucophycidae Bộ : Fucales Họ : Sargassaceae Chi : Turbinaria Loài : Turbinaria decurrens B. b. Đặc điểm loài, phân bố và sử dụng Rong mọc cao 10 – 30 cm, rễ to. Mỗi gốc rong có một hoặc một vài nhánh chính. Lá mọc dày chung quanh nhánh, mỗi lá gồm một phiến tròn hay gần giống hình tam giác dày, cứng, hơi lõm ở giữa và có nhiều răng nhọn ở mép. Cọng lá hình tròn hay hình 3 cạnh, dài khoảng 1cm. 7 Hình 1.4 Hình ảnh một số đặc điểm của loài T. decurrens B. Sinh học và hình thái: Mọc trên đá và san hô chết ở cùng thủy triều dọc theo các đường bờ biển tiếp xúc với sóng mạnh. Được tìm thấy ở các vùng biển thuộc các tỉnh, thành phố như: Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Kiên Giang [3]. 1.2. Tổng quan về polysaccharide từ rong biển Monosaccharide là các glucid đơn giản có công thức chung là (CH2O)n, mặc dù không phải tất cả các chất thỏa mãn công thức này đều là carbohydrate (VD: Acid acetic), monosaccharide là dạng carbohydrate đơn giản nhất. Chúng thường là chất rắn không màu, tan tốt trong nước và có vị ngọt và là các đơn phân cấu tạo disaccharide, acid amin và polysaccharide, một số monosaccharide thường gặp như Glu, Fuc, Gal... Disaccharide được cấu tạo từ 2 monosaccharide liên kết với nhau, một số disaccharide phổ biến trong tự nhiên là sucrose, lactose và maltose. Trong đó sucrose, loại đường phổ biến nhất, được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm như mía, củ cải và mật ong; Lactose được tìm thấy trong sữa và maltose thường được tìm thấy trong các loại ngũ cốc. Polysaccharide hay còn gọi là polycarbohydrate, thuộc 1 trong 4 phân nhóm chính của biopolymer, là loại carbohydrate phong phú nhất được tìm thấy rất nhiều trong tự nhiên. Được cấu tạo từ các đơn vị monosaccharide liên kết với nhau bằng các liên kết glycoside, chúng có cấu trúc mạch thẳng hoặc mạch 8 nhánh cùng với mức độ phân nhánh khác nhau mà ảnh hưởng đến các tính chất vật lý như: độ nhớt, độ tan, khả năng tạo gel. Polysaccharide được tìm thấy ở cả thực vật và động vật cả trên cạn hay dưới nước, trong đó rong biển được xem là một trong những nguồn cung cấp polysaccharide vô cùng phong và đa dạng, chủ yếu từ 3 ngành rong chính là rong nâu (Phaeophyta) rong đỏ (Rhodophyta) và rong lục (Chlorophyta). Trong các phân tử polysaccharide chiết tách từ rong biển thường có chứa các nhóm chức như carboxyl, sulfate hoặc amino là các phần tử mang điện nên được gọi là các ionic polysaccharide. Các ionic polysaccharide có khả năng tạo nhiều dạng cấu trúc khác nhau dẫn đến sự phong phú trong cấu trúc hoá học cũng như sự đa dạng về hoạt tính của các ionic polysaccharide này. Hoạt tính sinh học của các polysaccharide phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phân tử, cấu trúc và thành phần hoá học, ngoài ra còn đặc biệt phụ thuộc vào vị trí và hàm lượng của các nhóm chức có trong phân tử của chúng. 1.2.1. Polysaccharide từ các loài rong lục Là ngành rong phong phú nhất về số lượng loài, nên polysaccharide chiết tách từ các loài thuộc ngành rong này vô cùng phong phú. Các loài rong lục cung cấp polysaccharide chủ yếu thuộc các chi Ulva, Enteromorpha, Monostroma, Codium, Caulerpa và một số chi khác. Polysaccharide có trong rong lục được phân thành 4 nhóm chính: ulvan, heterorhamnan, arabinogalactan, galactan. a. Ulvan Ulvan là các sulfate polysaccharide được phân lập từ các loài rong lục thuộc 2 chi Ulva và Enteromorpha. Ulvan được chiết tách bằng nhiều phương pháp khác nhau dựa trên khả năng hòa tan của chúng trong nước cho hàm lượng từ 8 – 29% tính theo khối lượng rong khô [11]. Thành phần đường chủ yếu bao gồm: Rha, Xyl, acid uronic và nhóm sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide lặp lại với tỷ lệ khác nhau, tạo nên cấu trúc đa dạng và phức tạp với nhiều kiểu liên kết glycoside: α–(1→2)–, α–(1→3)– và α–(1→4)–Rha; β–(1→2)–, β–(1→3)– và β–(1→4)–Xyl; β–(1→3)–, β– (1→4)–Glu ; β–(1→4)–GlcA. Nhóm sulfate trong phân tử ulvan xuất hiện ở vị trí carbon C–3 hoặc C–2 của các đơn vị Rha [12]. 9 Hình 1.5 Cấu trúc Ulvan từ rong lục b. Heterorhamnan Sulfate heterorhamnan (hay còn gọi là sulfate rhamnan) là polysaccharide được phân lập từ các loài rong lục thuộc chi Monostroma. Thành phần chủ yếu là đường Rha và nhóm sulfate nhưng cấu trúc cho thấy sự khác biệt so với Ulvan ở kiểu liên kết glycoside và vị trí nhóm sulfate. Sulfate heterorhamnan chiết tách từ loài M. nitidum với liên kết α–(1→3)– giữa các đơn vị Rha và nhóm sulfate nằm ở vị trí C–2 [42] và loài M. latissimum bao gồm lượng lớn các gốc Rha liên kết với nhau bằng liên α–(1→3)– và α–(1→2)–, nhóm sulfate nằm ở vị trí carbon C– 3 hoặc C–4 của các gốc Rha liên kết α–(1→2)– [12]. c. Arabinogalactan Sulfate arabinogalactan được phân lập từ các loài thuộc chi Codium như: C. fragile, C. adhaerens… cho các loại polysaccharide khác nhau, bao gồm các liên kết α–(1→3)–glucan, β–(1→3)–mannan hoặc (1→3)–xylan và một số sulfate polysaccharide đặc biệt khác (galactan, arabinan hoặc arabinogalactan), cùng với lượng nhỏ proteoglycan cũng được gọi là arabinogalactan. Thành phần đường chủ yếu là L–Ara và D–Gal, ngoài ra còn chứa D–Glu và D–Man, có hàm lượng sulfate cao (11,0 – 20,7%) ở các vị trí carbon C–2 và C–4 hoặc chỉ ở vị trí C–4 và một phần nhỏ ở vị trí C–6 [12]. d. Galactan Sulfate galactan được phân lập từ rong lục chi Caulerpa, chủ yếu là các loài C. cupressoides và C. racemosa. Là một polysaccharide phức tạp cấu tạo từ nhiều loại monosaccharide, thành phần chủ yếu gồm Gal và một lượng nhỏ Glc, Man, Xyl tạo thành chuỗi với các kiểu liên kết glycoside (1→3)– và (1→3,6)– 10