Tài liệu Phân lập, phát hiện vi khuẩn bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THANH HOA PHÂN LẬP, PHÁT HIỆN VI KHUẨN Bacillus cereus SINH ĐỘC TỐ GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Hoa i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Thương phẩm, Khoa Quân nhu – Học viện Hậu cần đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Hoa ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... I Lời cảm ơn ........................................................................................................................II Mục lục .......................................................................................................................... III Danh mục từ viết tắt........................................................................................................ VI Danh mục bảng .............................................................................................................. VII Danh mục hình ............................................................................................................. VIII Trích yếu luận văn .......................................................................................................... IX Thesis abstract.................................................................................................................. X Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3 2.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ........... 3 2.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm ............................................................................ 3 2.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ................................................................ 3 2.2. Đặc điểm chung về Bacillus cereus.................................................................... 3 2.2.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus ..................................... 3 2.2.2. Đặc điểm hình thái Bacillus cereus .................................................................... 4 2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................................. 5 2.2.4. Đặc điểm sinh hóa .............................................................................................. 6 2.2.5. Đặc điểm huyết thanh học .................................................................................. 7 2.3. Đặc điểm gen Bacillus cereus ............................................................................ 7 2.3.1. Hệ gen của Bacillus cereus ................................................................................. 7 2.3.2. Sự phân bố các gen mã hoá độc tố ở vi khuẩn B. cereus.................................... 8 2.4. Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus .............................................................. 9 2.4.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus .............................................. 9 2.4.2. Nguồn gốc lây nhiễm ........................................................................................ 11 2.4.3. Triệu chứng lâm sàng ....................................................................................... 11 2.4.4. Các yếu tố gây độc của Bacilus cereus............................................................. 12 2.4.5. Cơ chế gây ngộ độc và liều lượng .................................................................... 14 2.5. Phương pháp phát hiện Bacillus cereus............................................................ 16 2.5.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa ......................... 16 iii 2.5.2. Phương pháp miễn dịch .................................................................................... 17 2.5.3. Phương pháp dựa trên đặc điểm gen ................................................................ 18 2.6. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về Bacillus cereus ...... 19 2.6.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 19 2.6.2. Giải mã trình tự gen (Sequencing).................................................................... 21 2.6.3. Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD) ................... 21 2.6.4. Kỹ thuật RFLP (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) ..................................... 21 Phần 3. Vật liệu và phương pháp ................................................................................ 22 3.1. Vật liệu ............................................................................................................. 22 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................... 22 3.1.2. Hóa chất và môi trường .................................................................................... 23 3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 26 3.2.1. Phương pháp phân lập Bacillus cereus ............................................................. 26 3.2.2. Phương pháp kiểm tra các chủng phân lập bằng đặc điểm hình thái và một số phản ứng sinh hóa ................................................................................. 26 3.2.3. Định danh chủng vi khuẩn ................................................................................ 27 3.2.4. Xác định một số gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR .......................................................................................................... 29 3.2.5. Xác định độ nhạy trong phát hiện các gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR ......................................................................... 29 3.2.6. Phát hiện B. cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định ............. 31 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 32 4.1. PHÂN LẬP Bacillus cereus ............................................................................. 32 4.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn được chọn lọc .............................. 34 4.2.1. Khả năng sinh Catalase..................................................................................... 34 4.2.2. Khả năng sinh axetoin (Phản ứng V-P) ............................................................ 35 4.2.3. Khả năng sinh gelatinase .................................................................................. 35 4.2.4. Khả năng phân giải thạch huyết ....................................................................... 36 4.3. Định danh chủng D1.7 bằng phân tích trình tự 16S rDNA .............................. 37 4.4. Phát hiện gen mã hóa độc tố của chủng B. cereus D1.7 ................................... 39 4.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR .............................................................. 43 iv 4.6. Phát hiện Bacillus cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định ............................................................................................................. 45 Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 47 5.1. Kết luận............................................................................................................. 47 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 47 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 48 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt bp : base pair CTAB : Cethyltrim ethylammonium bromide DNA : Deoxyribonucleotide acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphate ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay EtBr : Ethidium bromide LB : Luria – Bertani MPA : Meat – Pepton – Agar MPB : Meat – Peptone – Broth MYP : Manitol – Yolk – Polimyxin PCR : Polymerase chain reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rDNA : ribosome deoxyribonuclease RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse : Ribonuclease rRNA : ribosome ribonuclease SDS : Sodium dodecyl sulfate TAE : Tris Acetate Ethylendiamin Tetraacetic Acid TE : Tris Ethylendiamin Tetraacetic Acid UV : Ultra violet VP : Voges – Prokauer VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài trong nhóm Bacillus cereus [27]....................................................................................................................7 Bảng 2.2. Các loại độc tố của B. cereus [21] ..................................................................14 Bảng 2.3. Đặc trưng của hai loại bệnh do vi khuẩn B. cereus gây ra ............................ 15 Bảng 3.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 22 Bảng 3.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen 16S rDNA ................. 28 Bảng 3.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR ........................................................... 29 Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập ........ 37 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi ......................... 5 Hình 2.2. Khuẩn lạc vi khuẩn B. cereus trên môi trường MYP, trên môi trường thạch máu ....................................................................................................... 6 Hình 2.3. Cấu trúc hoá học của độc tố gây nôn ........................................................... 13 Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc chủng D1.7 khi phân lập trên môi trường MYP và trên môi trường MPA sau 24h nuôi cấy ở 37oC........................................... 32 Hình 4.2. Hình thái tế bào của chủng D1.7 sau 24h nuôi cấy ở 37oC quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần và trên kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 13000 lần .................................................... 33 Hình 4.3. Hình thái bào tử chủng phân lập C1.1 sau 3 ngày nuôi cấy ở 37 oC trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần. ........................................... 34 Hình 4.4. Khả năng sinh Catalase của 11 chủng phân lập. Lần lượt từ 1 đến 5 là C1.1, B1.5, D1.7, C1.3 và CV1.6 . .............................................................. 34 Hình 4.5. Khả năng sinh axetoin của 11 chủng nghiên cứu. Lần lượt từ 1 đến 5 là CV1.6, D1.7, C1.3, C1.1 và B1.5 . .......................................................... 35 Hình 4.6. Khả năng sinh gelatinase của 11 chủng phân lập ....................................... 36 Hình 4.7. Khả năng phân giải thạch huyết của các chủng phân lập ............................ 36 Hình 4.8. Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu trên gel agarose 1,2% ........... 38 Hình 4.9. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn D1.7 ........ 39 Hình 4.10. Điện di đồ sản phẩm PCR với các mồi NheA, HblA, HblD, Bcet, CytK, EntFM trên gel agarose 1,5% ............................................................ 40 Hình 4.11. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblA, HblD, BceT, CytK, EntFM trên gel agarose 1,5%............................................................................................ 44 Hình 4.12. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD trên gel agarose 1,5% .................. 45 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Đề tài nghiên cứu “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam” tiến hành tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ vi sinh - Khoa công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 10/2016 đến tháng 6/2017. B. cereus thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, có khả năng sinh bào tử. Vi khuẩn này có thể tổng hợp một số protein độc gây ra các bệnh liên quan đến ngộ độc thực phẩm. Đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích phân lập vi khuẩn B. cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm và bước đầu xây dựng quy trình phát hiện một số gen mã hóa độc tố từ B. cereus. Từ các mẫu đất và thực phẩm có nguồn gốc khác nhau, bằng phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc và căn cứ vào đặc điểm hình thái, tôi đã thu được 11 chủng vi khuẩn giống với vi khuẩn B. cereus. Nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa, sinh lý của 11 chủng này đã chọn ra chủng D1.7 mang các đặc tính giống hoàn toàn với chủng B. cereus chuẩn. Phân tích trình tự 16S rDNA cho thấy chủng D1.7 và chủng B. cereus có độ tương đồng 99%. Kết hợp các đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tích sinh học phân tử đã xác định chủng vi khuẩn D1.7 thuộc loài B. cereus. Bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã xác định chủng B. cereus D1.7 mang các gen mã hóa một phần các protein độc tố ruột. Đồng thời xác định độ nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện các gen mã hóa độc tố gây ngộ độc thực phẩm là 3,5x103 vi khuẩn/ml. Đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen mã hóa thành phần L2 của độc tố HBL của B. cereus D1.7 trực tiếp từ thực phẩm giả định tại nồng độ 3,5x103 vi khuẩn/ml. ix THESIS ABSTRACT Study on "Detection of pathogenic Bacillus cereus bacteria isolated in Vietnam" was conducted at the laboratory of the Department of Microbial Biotechnology, Faculty of Biotechnology, VNUA from 10/2016 to 6/2017. B. cereus belong to Bacillus genus, is a Gram positive, catalase positive and spore-forming bacterium. They are able to synthesize a number of pathogenic proteins that cause foodborne illness. This study was designed to isolate B. cereus bacteria that produce toxins caused the food poisoning and to initially develop a process for the detection of several toxin-coding genes from B. cereus. Different soil and food samples were collected for isolation. Based on morphological characteristics of colonies, cell and spore-forming we selected 11 isolates similar to B. cereus. Biochemical and physiological characteristics of 11 strains were show that the D1.7 strain has the most of characteristics as the B. cereus strains. Analysis of 16S rDNA sequences showed that D1.7 and B. cereus strains were 99% homologous. A combination of morphological, biochemical and molecular biology we indicated the D1.7 isolated strain is B. cereus. Using PCR with specific primers suggest that the B. cereus D1.7 strain carrying genes that partially encode enterotoxin proteins. At the same time, the sensitivity of the PCR response to detecting genes encoding toxins causing foodborne botulism is 3,5x10 3 bacteria/ml. PCR technique was used to detect the gene that encode L2 component of enterotoxin HBL from food presumably at a concentration of 3,5x103 bacteria/ml. x PHẦN 1. MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là một tình trạng bệnh lý xảy ra do ăn uống phải các thức ăn bị ô nhiễm chất độc hại đối với sức khoẻ con người. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra, nhưng trong số đó thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1]. Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có 2 dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh. Dạng khác là vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người, sự hiện diện của chúng hoặc các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Bacillus cereus là vi khuẩn có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn [29]. Chủng vi khuẩn này còn có khả năng hình thành bào tử và phân bố rộng khắp trong môi trường, vì thế đây là nhóm vi khuẩn quan trọng khi nhìn từ khía cạnh vệ sinh thực phẩm. Việt Nam là nước có điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B. cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B. cereus là không nhỏ tại Việt Nam. Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định B. cereus gây ngộ độc thực phẩm: Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các đặc tính sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn. Phương pháp ELISA. Phương pháp phát hiện gen dựa vào phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR). Trong đó phương pháp phát hiện gen nhờ PCR đang được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác được sự ô nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh. Ưu điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể cả nguyên vật liệu. Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng gây 1 ngộ độc thực phẩm là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực trong việc góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm do B. cereus. Do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam”. Đề tài được đặt ra nhằm đạt được mục tiêu sau: Phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm từ các chủng phân lập tại Việt Nam. Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nội dung sau: - Phân lập và xác định vi khuẩn B. cereus từ các mẫu khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự 16s rDNA. - Phát hiện gen mã hoá độc tố của các chủng B. cereus bằng kỹ thuật PCR. - Xác định độ nhạy của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện B. cereus. - Phát hiện vi khuẩn B. cereus sinh độc tố trong một số thực phẩm giả định bằng kỹ thuật PCR. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI NIỆM NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 2.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [6]. 2.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc, đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn thường xuyên xảy ra, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[5]. Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật luôn là nguyên nhân phổ biến nhất. Các loại vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất là tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…[2]. 2.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ Bacillus cereus 2.2.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus Phân loại quốc tế B. cereus: • Thuộc giới Bacteria • Ngành (phylum) Firmicutes • Lớp (class) Bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceae • Chi (genus) Bacillus 3 • Loài (species) B. cereus B. cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887. Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn. Các vụ dịch ngộ độc thức ăn do B. cereus có đặc điểm là nôn và tiêu chảy [25]. Để khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml và uống 200ml cocktail. Sau 13h ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau một triệu chứng ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus gây ra lại xuất hiện ở công nhân Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h). Sau đó, B. cereus được công nhận là một nguyên nhân quan trọng của ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [28]. 2.2.2. Đặc điểm hình thái Bacillus cereus Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus như là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [31], thì B. cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B. cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động. B. cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng. Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối [18]. Khả năng hình thành bào tử là đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. cereus nói riêng. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất. Vì vậy, khả năng lây nhiễm B. cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn. Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng khô hạn…, B. cereus sẽ sinh nội bào tử. Nội bào tử nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài. Khi gặp môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu…, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất. Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất 4 lợi nội bào tử lại được hình thành [4]. Do bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng nên trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B. cereus. Hình 2.1. Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy Là loại vi khuẩn dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường.  B. cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng 5 - 50oC, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của B. cereus là 30 - 37oC.  Độ pH biến thiên từ 4,3 – 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,2.  B. cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7 – 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [18, 27].  Trên môi trường LB lỏng: đục Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7 – 7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B. cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzyme lecithinase) [17,19,27]. 5 Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA, khuẩn lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4 – 0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,32]. A B Hình 2.2. Khuẩn lạc vi khuẩn B. cereus trên môi trường MYP (A), trên môi trường thạch máu (B) Trên môi trường thạch máu, B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết. Đây là một trong các đặc điểm để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn khác như B. anthracis (không có khả năng sinh ra haemolysin), đây cũng là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. cereus [18,27]. 2.2.4. Đặc điểm sinh hóa Để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn trong Bacillus nhóm 1 (B. anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis,…) dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L – tyrosine..., được trình bày trong bảng sau: 6 Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài trong nhóm Bacillus cereus [27] Đặc tính Loài B. cereus B. thuringiensis B. mycoides B. anthracis Nhuộm Gram + + + + Sinh Catalase + + + + +/+ +/+/- + + Sinh protein tinh thể - + - - Kháng lysozyme + + + + Phản ứng với lòng đỏ trứng + + + + Lên men glucose Phản ứng VP + + + + + + + + Sinh acid từ manitol - - - - Tan máu (cừu) + + + - Di động Khử nitrate Chú thích: +: phản ứng dương tính +/-: 50% phản ứng dương tính -: phản ứng âm tính 2.2.5. Đặc điểm huyết thanh học Hiện nay theo một số nghiên cứu, B. cereus có 13 kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên O) và giống như B. thuringiensis, B. cereus cũng có kháng nguyên tiên mao (kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử dụng cho phân loại B. cereus. 23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới các thể bệnh gây ra bởi B. cereus. Các nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết thanh 1, 2, 6, 8, 10, 12 và 19 thường liên quan tới các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu chảy còn các nhóm huyết thanh 1, 4, 7, 11, 18 của B. cereus lại liên quan tới những vụ ngộ độc thể nôn. Trong đó, typ huyết thanh H1 thường chiếm ưu thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [18]. 2.3. ĐẶC ĐIỂM GEN Bacillus cereus 2.3.1. Hệ gen của Bacillus cereus Bản đồ di truyền của chủng B. cereus đã chỉ ra rằng kích thước nhiễm sắc thể có thể thay đổi từ 2,4 đến hơn 5,5 Mb. Bộ gen dường như có một khu vực liên tục 2,4 Mb và một khu vực ít ổn định [21]. Plasmid đóng một vai trò quan trọng trong sinh học của các loài Bacillus. Cùng với các yếu tố di động khác như bacteriophages, chúng cho phép chuyển 7 gen theo chiều ngang giữa các loài thuộc chi này, một lực lượng chính làm thay đổi tính đa dạng di truyền. Plasmid thay đổi đáng kể về kích thước và nội dung gien của Bacillus spp và đóng góp rất lớn vào sự biến đổi gen [50]. Plasmid tìm thấy trong 5 chủng B. cereus với kích thước biểu kiến là 730 kb (ATCC6464), 600 kb (F2038/78), 450 kb (chủng 41), 400 kb (ATCC 33.018) và 290 kb (F4810/72) Beverley (1988) [21]. Mặc dù B. anthracis, B. cereus và B. thuringiensis được phân biệt theo đặc tính kiểu hình và đặc tính bệnh lý, dữ liệu trình tự bộ gen đã chỉ ra rằng chúng liên quan chặt chẽ, và trình tự gen 16S rRNA của chúng có độ tương đồng hơn 99%. Các nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các chỉ thị về nhiễm sắc thể cho thấy không có cơ sở phân loại để chia B. cereus và B. thuringiensis thành 2 loài riêng biệt, trong khi B. anthracis về cơ bản có thể được coi là một dòng của B. cereus. Các đặc điểm phân biệt giữa các loài được mã hoá bởi các gen nằm trên plasmid, được coi là các yếu tố di truyền di động cao, cũng nằm trong nhóm B. cereus [31]. 2.3.2. Sự phân bố các gen mã hoá độc tố ở vi khuẩn B. cereus Các gen mã hóa độc tố của B. cereus gồm hblA, hblD, hblC nằm trên cùng một operon mã hóa độc tố HBL; nheA, nheB, nheC nằm trên cùng một operon mã hóa độc tố NHE; Các gen bceT, cytK, entFM, ces lần lượt mã hóa độc tố bcD-ENT, cytK, entFM, Cereulide. Tỷ lệ hiện nhiễm các chủng tiêu chảy của B. cereus trong thực phẩm và tham gia vào các đợt bùng phát dường như đã thay đổi xu hướng trong thập kỷ qua. Trước đây các chủng chứa gen mã hóa độc tố HBL được tìm thấy là phổ biến hơn và cũng liên quan nhiều hơn đến sự bùng phát. Tuy nhiên các báo cáo mới nhất cho thấy các dòng sản xuất NHE xuất hiện thường xuyên hơn trong số các thực phẩm phân lập. Trong thực tế, các gen mã hoá NHE hiện nay được cho là có mặt trong hầu hết các chủng B. cereus. Guinebretière et al. (2002) đã phân tích kết quả của 37 chủng B. cereus gây ngộ độc thực phẩm. Ông chỉ ra rằng một trong những chủng này có thể mang một số gen gây bệnh. Trong 37 chủng B. cereus gây ngộ độc thực phẩm, 36 (97,3%) có gen mã hóa cho cả ba thành phần của độc tố NHE, 27 có gen mã hóa cho tất cả các thành phần của HBL và cytK (73%), và 21 (56,8%) cho bc-DENT. Tất cả các chủng có gen mã hóa cho các thành phần HBL cũng có gen mã hóa các thành phần NHE. Trong 27 chủng dương tính với gen cytK, 26 cũng 8