Tài liệu Phân lập nấm aspergillus flavus và aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHẠM NHƢ TRỌNG PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t Mã số: 62 42 40 Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: PGS.TS. Phạm Xuân Đà Học viên: Phạm Nhƣ Trọng Hà Nô ̣i - 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Ngƣời viết báo cáo Phạm Nhƣ Trọng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii LỜI CÁM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại Khoa Vi sinh - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Xuân Đà Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, quan tâm từ thầy cô, đồng nghiệp, gia đình, bạn bè. Tôi Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Đà đã hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ Khoa Vi sinh, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này. Và cuối cùng, tôi xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn sát cánh bên tôi, chia sẻ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Ngƣời viết báo cáo Phạm Nhƣ Trọng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................. i MỤC LỤC ............................................................................................................ v DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ ix DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................... x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU ........................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích - Yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ....................................................................................................... 2 PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................... 3 2.1. Giới thiệu chung về lạc ............................................................................... 3 2.1.1. Cấu tạo của lạc ........................................................................................... 3 2.1.2. Giá trị và công dụng của lạc đối với đời sống của con người.................... 3 2.2. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc ....................................................... 4 2.2.1. Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc ........................................................... 4 2.2.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 4 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng A. flavus và A. parasiticus ........ 6 2.2.4. Điều kiện sinh độc tố .................................................................................. 7 2.3. Độc tố aflatoxin ............................................................................................. 7 2.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin ......................................................................... 7 2.2.2. Định nghĩa .................................................................................................. 8 2.2.3. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin ................................................... 8 2.2.4. Độc tính của aflatoxin .............................................................................. 10 2.2.5. Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thể.............................................. 11 2.2.6. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin ................................................................ 11 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 2.3. Các phương pháp xác định sự có mặt của độc tố aflatoxin ........................ 11 2.3.1. Phương pháp hóa sinh .............................................................................. 11 2.3.2. Phương pháp vi sinh ................................................................................. 11 2.3.3. Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR ........................................................ 12 2.4. Tình hình nghiên cứu về độc tố aflatoxin trên lạc ...................................... 14 2.4.1. Ngoài nước .............................................................................................. 14 2.4.2. Trong nước ............................................................................................... 14 PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 16 3.1. Đối tượng..................................................................................................... 16 3.1.1. Chủng chuẩn nấm Aspergillus và mẫu lạc ............................................... 16 3.1.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 16 3.1.3. Các môi trường chính sử dụng trong quá trình nghiên cứu ..................... 16 3.1.4. Hóa chất.................................................................................................... 16 3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 17 3.2.1. Phương pháp phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus ................... 17 3.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể ... 19 3.2.3. Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS.................... 19 3.2.4. Xác định khả năng sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ ... 23 PHẦN THỨ TƢ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 26 4.1. Kết quả phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus............................... 26 4.2. Kết quả định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể ............... 26 4.4. Kết quả giải trình tự gen ITS định danh nấm A. flavus, A. parasiticus ....... 31 4.4.1. Kết quả tách chiết ADN ........................................................................... 31 4.4.2. Kết quả khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu ................................... 32 4.4.3. Kết quả giải trình tự ................................................................................. 33 4.4.4. Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử quét...................................................... 36 4.5. Kết quả phân tích khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký khối phổ .... 39 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi PHẦN NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 40 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 40 5.2. Kiến nghị ..................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 41 PHỤ LỤC .......................................................................................................... 43 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái nấm A. flavus và A. parasiticus ............................ 5 Bảng 2.2. Công thức phân tử của các aflatoxin và tính chất................................ 9 Bảng 3.1. Chương trình gradient của pha động ................................................. 24 Bảng 3.2. Điều kiện chạy khối phổ .................................................................... 24 Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu tạo vi thể ................................. 27 Bảng 4.2. Kết quả định danh nấm A. flavus và A. parasiticus ........................... 31 Bảng 4.3. Kết quả đo nồng độ ADN sau khi tách chiết ..................................... 32 Bảng 4.4. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế ................................... 36 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Công thức cấu tạo chung của aflatoxin ................................................ 8 Hình 2.2. Trình tự đoạn ITS đinh danh nấ m....................................................... 12 ̣ Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ....... 29 Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ....... 30 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS ........................................... 33 Hình 4.4. Trình tự từ nu từ 330 đên nu 590 ....................................................... 35 Hình 4.5. Trình tự ADN của nấm M45 .............................................................. 35 Hình 4.6. Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M50 .................................................... 37 Hình 4.7. Sắc đồ chạy sắ c ký khối phổ nấm M45.............................................. 39 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC VIẾT TẮT ADN : Axid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid ITS : Internal Transcriped Spacer HPLC : High-performance Liquid Chromatography MEA : Malt Extract Agar PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA TLC : Thin Layer Chromatography YEP : Yeast Extract Peptone Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm mốc là nguyên nhân hàng đầu gây nên sự giảm chất lượng và phá hủy nông sản sau thu hoạch, hơn thế nữa nhiều chủng nấm còn sinh độc tố nấm (mycotoxin) nhiễm vào thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người khi không may ăn phải, phổ biến nhất là chi Aspergillus (A. flavus; A. parasiticus; …) có khả năng sinh độc tố aflatoxin, các chủng nấm thuộc chi này có phổ hoạt động rất rộng vì vậy có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại nông sản như ngô, lạc, bông, đậu tương … Các loại hạt có dầu (đặc biệt như lạc) rất thích hợp cho sự phát triển của nấm Aspergillus cũng như sự hình thành độc tố aflatoxin, đây là một loại độc tố không bị phân hủy trong điều kiện đun nấu thông thường, có khả năng gây ung thư đối với người sử dụng lâu dài [4]. Cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp như sản xuất bánh kẹo... [11]. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện bảo quản lạc trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm. Đó là điều kiện thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm nếu không có biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt. Trong những năm gần đây công tác vệ sinh an toàn thực phẩm đã có những tiến bộ rõ rệt và ngày càng được chú trọng. Từ những năm 70 các nhà khoa học dựa vào hình thái đã xây dựng được hệ thống phân loại nấm khá đầy đủ, phương pháp truyền thống dựa trên các kỹ thuật vi sinh cơ bản và hình thái học của sợi nấm, chồi và túi bào tử [4]. Tuy nhiên phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian tiến hành lâu thường 5 đến 10 ngày hệ sợi nấm mới phát triển đầy đủ. Do đó, các nhà khoa học đã phát triển kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật PCR, giải trình gen… để phát hiện và định danh nấm sinh độc tố aflatoxin. Và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ được dùng để xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm. 1 Xuất phát từ thực tế trên, để đảm bảo chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng chúng tôi tiến hành đề tài " phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc ". 1.2. Mục đích - Yêu cầu 1.2.1. Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin trên lạc bằng phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS. Từ đó xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm. 1.2.2. Yêu cầu - Phân lập được chủng nấm mốc A. flavus; A. parasiticus có khả năng sinh độc tố afatoxin của các mẫu lạc thu thập từ các chợ tại Hà Nội; - Xây dựng được phương pháp định danh nấm mốc sinh độc tố aflatoxin dựa vào hình thái kết hợp giải trình tự gen ITS; - Phân tích khả năng sinh độc tố afatoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ. 2 PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu chung về lạc 2.1.1. Cấu tạo của lạc Lạc còn được gọi là đậu phộng hay đậu phụng (tên khoa học là Arachis hypogaea L), là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ. Nó là loài cây thân thảo hàng năm có thể cao từ 3-50 cm. Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3-7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), và quả (củ) thường dấu xuống đất để phát triển. Hạt lạc là loại thực phẩm rất giàu năng lượng vì có chứa nhiều lipid. Theo bảng thành phần dinh dưỡng các chất trong thực phẩm, hạt lạc có chứa nước 7,5%; protein 27,5%; chất béo 44,5%; glucid 15,5%; cellulose 2,5% và một lượng nhỏ vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, Folat ), các axid amin và các nguyên tố vi lượng ( K, P, Mg , Mn, Fe, Na, Zn, Cu...). Trong thành phần chất đạm (protein) có một globulin là arachin (60-70%) và một albumin là conarachin (25-40%) cả hai chất này đều không tan trong nước. Cả arachin và conarachin đều cho các acid amin như methionin, tryptophan và d-threonin. Thành phần chủ yếu trong nhân lạc là dầu lạc. Nó gồm các glycerid của acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất nhiều tuỳ theo loại lạc, acid oleic 51-79%; acid linoleic 7,4-26%, acid palmitic 8,5% acid stearic 4,5- 6,2%, acid hexaconic 0,1-0,4% và 2 acid chỉ thấy trong dầu lạc là acid arachidic và acid lignoceric [11]. 2.1.2. Giá trị và công dụng của lạc đối với đời sống của con người Lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp. Với giá trị dinh dưỡng của lạc, con người đã sử dụng như một nguồn thực phẩm quan trọng. Ngoài việc dùng để ăn dưới nhiều hình thức như luộc, rang, nấu xôi, làm bánh kẹo, chao dầu… Lạc được dùng để ép dầu ăn và khô dầu để chế biến nước chấm và chế biến các mặt hàng khác. Sản phẩm phụ của lạc là thức ăn quý cho động vật 3 nuôi. Khi ép dầu sản phẩm phụ là khô dầu với lượng dinh dưỡng khá cao làm thức ăn cho gia súc gia cầm. Khi phân tích thân lá lạc thì có 47% đường bột, trên 15% chất hữu cơ chứa nitơ và 1,8% chất béo nên thân lá lạc cũng có thể dùng làm thức ăn cho gia súc. Gần đây nhờ công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta chế biến nhiều mặt hàng thực phẩm có giá trị từ lạc như lạc rút dầu, bơ lạc, chao, phomat sữa, sữa lạc…, được sử dụng chế biến nhiều loại thuốc trong y dược, dùng làm dầu nhờn để xoa máy, bỏ trục xe, loại dầu xấu dùng để nấu xà phòng. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cho con người và là tài nguyên cho các ngành khác. Cây lạc còn là cây quan trọng nhất trong hệ thống luân canh cây trồng đạt hiệu quả cao vì nó có tác dụng cải tạo đất tốt. Nhu cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng tăng đã và đang khuyến khích đầu tư phát triển sản phẩm lạc với quy mô ngày càng mở rộng ở các quốc gia trên thế giới. Lạc còn có nhiều công dụng tốt cho sức khỏe, đặc biệt là đối với những người ăn kiêng và mắc bệnh tim mạch [11]. Trên thị trường thương mại thế giới lạc là mặt hàng xuất khẩu đem lại kim ngạch cao của nhiều nước. Do giá trị nhiều mặt của hạt lạc nên chưa bao giờ lạc mất thị trường tiêu thụ. Theo số liệu của FAO 1999, có 100 nước đang trồng và xuất khẩu lạc. Ở Senegal, giá trị lạc chiếm 80% giá trị xuất khẩu, ở Nigieria chiếm 60% giá trị xuất khẩu. Hiện nay có 4 nước xuất khẩu lạc chủ yếu, đó là: Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ và Việt Nam. Các nước phải nhập khẩu lạc là Nhật Bản , Canada, Philipin, Đức… Ở Việt Nam sản lượng lạc xuất khẩu dao động từ 100-130 nghìn tấn/ năm [21]. 2.2. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc 2.2.1. Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên sản phẩm nông sản (đặc biệt là lạc) thuộc chi Aspergillus gồm A. flavus và A. parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc gen và là hai loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất. Việc xác định các loài sinh aflatoxin hiện tại dựa vào đặc điểm hình thái và loại mycotoxin sản sinh ra hoặc dựa vào trình tự ADN (Ito và cộng sự, 2000). 2.2.2. Đặc điểm hình thái A. flavus và A. parasiticus đều thuộc họ nấm cúc có khả năng sinh độc tố aflatoxin trong môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy. 2.2.2.1. Đặc điểm hình thái của A. flavus 4 A. flavus phân bố ở khắp nơi trên trái đất: Dưới đất, trên các nông sản thực phẩm đặc biệt là trên lạc và sản phẩm từ lạc là nơi phát triển ưa thích của chúng. Con đường xâm nhập của A. flavus là chúng xâm nhập qua các điểm tiếp hợp nhờ những chỗ do côn trùng hủy hoại gây ra. Tuy nhiên ở cây lạc tươi A. flavus khó xâm nhập hơn vì vậy mà chúng xâm nhập khi củ lạc già, nhất là sau khi thu hoạch. A. flavus xâm nhập vào hạt lạc chứa 15- 30 % nước, tức là vào thời gian đầu của việc làm khô [4]. A. flavus có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 và axid cyclopyazonic (CPA). 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái của A. parasiticus A. parasiticus có đặc điểm hình thái tương tự A. flavus song bào tử của A. parasiticus thường có màu xanh lục, có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 nhưng không có khả năng sinh axid cyclopyazonic (CPA). Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về đặc điểm hình thái nhưng người ta vẫn tìm được một số khác biệt nhỏ giữa A. flavus và A. parasiticus. Sự khác biệt giữa hai chủng này có thể tóm tắt trong bảng dưới đây: Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái nấm A. flavus và A. parasiticus [6,7] Đặc điểm A. flavus A. parasiticus Đường kính Đại - d = 3-5 cm - d = 2- 3 cm Màu sắc - Ban đầu hơi vàng cuối - Khóm nấm xanh lục, hơi xanh lục hoặc vàng lục vàng - Đôi khi hóa nâu khi già - Không bao giờ hóa nâu khi thể già Bông - Lớn, cầu, tỏa tia, đôi khi - Nhỏ, cầu hoặc tỏa tia tạo cột không rõ Vi thể Bọng - Cầu - gần cầu - Hình gần cầu Thể bình - 1 hoặc 2 tầng - 1 tầng Vách cuống - Xù xì - Xù xì Hạt đính - Cầu đến gần cầu, trơn hoặc Cầu, vách có gai 5 có gai Theo các kết quả nghiên cứu không phải tất cả các loại A. flavus đều có khả năng sinh độc tố aflatoxin nhưng phần lớn các chủng A. parasiticus phân lập được lại đều sinh tổng hợp aflatoxin. Các chủng A. flavus tạo thành aflatoxin lạc chiếm 40 - 50 %. 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng A. flavus và A. parasiticus  Nhiệt độ: A. flavus và A. parasiticus là loại nấm mốc ưa nhiệt có thể sinh trưởng và phát triển ở dải nhiệt độ từ 20 - 60ºC, tºopt = 25 - 35ºC, dưới 12ºC A. flavus không phát triển được hoặc phát triển rất yếu (Schroeder và cộng sự,1996).  Độ ẩm: Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của chúng wopt = 80-85%, A. flavus và A. parasiticus phát triển tốt trên các loại cơ chất có dầu như các nông sản: lạc, ngô, gạo, bông... Hàm lượng nước trong cơ chất thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của chúng từ 15- 30% . Ở hàm lượng nước cao hơn hoặc thấp hơn đều ức chế sự phát triển của chúng [4].  Độ pH: A. flavus và A. parasiticus có thể phát triển ở khoảng pH khá rộng (pH =2 - 8) tùy thuộc vào loài. Nhưng pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là 4,5 6,5 [4].  Nguồn cơ chất: A. flavus và A. parasiticus có các enzyme thủy phân tinh bột, nhưng nguồn hydrocacbon thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm này là glucose và saccharose [2]. A. flavus và A. parasiticus đều có khả năng đồng hóa các loại muối amoni và nitrat. Ngoài ra còn có khả năng sử dụng axid glutamic, prolin, trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine, methionine. Để đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển, các vi nấm đòi hỏi một lượng cần thiết các nguyên tố đa lượng (P, K,S, Mg, Ca…), các nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…) và các muối MgSO4, KCl, FeSO4, KCl, FeSO4... [2] 6 2.2.4. Điều kiện sinh độc tố Khả năng sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Chủng nấm mốc, nhiệt độ và thành phần môi trường. Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố trên. Một số chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng độc tính của chúng nếu cấy chuyền liên tiếp trên môi trường thích hợp. Khi khối lượng hệ sợi nấm càng nhiều thì khả năng sinh độc tố càng mạnh và ngược lại. Môi trường bổ sung cao nấm men, peptone hay là acid amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH = 5- 5.4, nhiệt độ 25- 28Cº) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành aflatoxin [4]. Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng có tác dụng kích thích sự tạo thành các aflatoxin. Tuy nhiên, riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng nhiều. Người ta đã xác định được khi A. flavus phát triển trên hạt lúa mỳ thì hàm lượng aflatoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ. Việc thêm nước chiết từ mầm lúa mỳ, lipid hay các axid béo sẽ kích thích tốt sự hình thành aflatoxin. Điều này khiến người ta nghĩ rằng các chất này có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp aflatoxin vì sự phân hủy của chúng tạo thành các chất trao đổi tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin [3]. 2.3. Độc tố aflatoxin 2.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là '' Turkey X disease" . Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều. Qua điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hóa học của chất này là aflatoxin do vi nấm A. flavus và A. parasiticus gây ra. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 trong đó thì AFB1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất ( Nabil Saad, 2004). Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin. 7 2.2.2. Định nghĩa Aflatoxin là nhóm các hợp chất có nhân difuranocumarin, là sản phẩm của quá trình trao đổi chất bởi nấm A. flavus, A. parasiticus và một số nấm khác. Người ta đã phát hiện và xác định có 17 loại aflatoxin khác nhau, trong đó aflatoxin B1 có độc tính mạnh nhất, còn các loại khác chính là sản phẩm chuyển hóa của AFB1 gồm AFB2, AFG1, AFG2, AFM1, AFM2…[1,4] 2.2.3. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin 2.2.3.1. Cấu tạo của aflatoxin Aflatoxin có nhiều loại và có cấu trúc khác nhau. Các loại này là các dạng biến đổi của các aflatoxin loại B, G, M. Cấu tạo của aflatoxin là các chất trao đổi chất có liên quan đến aflatoxin B1 và G1. Aflatoxin B2 và G2 là dẫn xuất hydro của các hợp chất mẹ. Các aflatoxin M1 và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B1, B2 theo thứ tự chúng có công thức sau: Hình 2.1. Công thức cấu tạo chung của aflatoxin 8 Trong 4 loại aflatoxin thì aflatoxin B1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn.  Aflatoxin B1 và B2: Được sinh ra bởi A. flavus và A. parasiticus.  Aflatoxin G1 và G2: Được sinh ra bởi A. parasiticus.  Aflatoxin M1: chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật.  Aflatoxin M2: chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin ( Đậu Ngọc Hào và cộng sự, 2003). 2.2.3.2. Tính chất hóa lý của aflatoxin Aflatoxin là tinh thể màu trắng, các aflatoxin có khả năng phát quang mạnh khi ở dưới ánh sáng cực tím (λ= 360 nm) cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ rất thấp. Từ đó, nó cung cấp một cơ sở lý thuyết cho việc phát hiện định lượng các aflatoxin bằng phương pháp hóa lý [1]. Bảng 2.2. Công thức phân tử của các aflatoxin và tính chất Công thức Khối lượng phân LD50 (µg/50g trọng Màu huỳnh phân tử Aflatoxin tử (g/mol) lượng cơ thể vịt) quang 18,2 Xanh da trời AFB1 C17H12O6 312 AFB2 C17H14O6 314 84,8 Xanh da trời AFG1 C17H12O7 328 39,2 Xanh lá cây AFG2 C17H14O7 330 172,5 Xanh lá cây AFM1 C17H12O7 328 16,6 Xanh tím AFM2 C17H14O7 330 62,0 Xanh tím Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho phép phát hiện các aflatoxin ở nồng độ thấp ( 0,5 ng hay thấp hơn trên một vết của sắc ký bản mỏng). Từ đó, nó cung cấp một cơ sở lý thuyết cho phép phát hiện và định lượng các aflatoxin bằng phương pháp hóa lý [4]. Các aflatoxin tan tốt trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform và metanol, đặc biệt là trong dimetylsulfoxit. Aflatoxin tan trong nước dao động khoảng từ 10-20mg/l [2]. Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao không bị phân hủy khi đun nóng thông thường mà chỉ bị phân hủy khi hấp ở 120ºC trong 30 phút. Do đó nó vẫn tồn tại trong 9 lạc mà không có sự có mặt của nấm mốc. Tuy nhiên khi để trong không khí đặc biệt là dưới tia tử ngoại aflatoxin tương đối không bền. Các aflatoxin cũng có thể bị phá hủy hoàn toàn bằng việc xử lý mạnh bằng amoniac hoặc hypoclorid. Sự có mặt của vòng lactone ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm. Đặc tính này là quan trọng trong quá trình chế biến thực phẩm vì xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin trong các sản phẩm thực phẩm. Tuy nhiên nếu sau quá trình xử lý kiềm nếu acid hóa sẽ làm giảm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin [1]. Các aflatoxin khá bền với các enzym tiêu hóa, aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ có trọng lượng phân tử thấp dễ dàng được hấp thụ sau khi ăn. Sự chuyển hóa aflatoxin B1 ở đường tiêu hóa chính là nhờ sự hoạt động tương tác giữa protein ở niêm mạc ống tiêu hóa tạo ra sản phẩm AFB1 - epoxie, AFB1- dihydrodiol hoặc AFB2α. AFB1 và các sản phẩm chuyển hóa của nó được bài tiết qua ba con đường chính là qua mặt, nước tiểu và sữa (sản phẩm của AFM1). Người ta đã xác định có sự tương quan giữa AFB1 ăn vào và lượng AFM1 trong sữa. Lượng AFM1 trong sữa ước tính khoảng 1% trong lượng AFB1 ăn vào [4]. 2.2.4. Độc tính của aflatoxin Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính độc tố aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư. Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất. Nếu hấp thu một lượng là 2,5 mg aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng) có thể dẫn đến ung thư gan sau một năm. Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây: - Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác - Ức chế hệ miễn dịch - Ăn mòn thành ruột và dạ dày - Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết - Gây ra ung thư gan ở người và gia súc AFB1 là chất gây ung thư gan nhóm 1 đối với người. Aflatoxin khi kết hợp với virut viêm gan B làm tăng nguy cơ ung thư gan gấp 12 lần. Phơi nhiễm aflatoxin là một yếu tố gây bệnh còi cọc và thiếu cân, suy giảm thần kinh, suy giảm miễn dịch và gây tử vong trẻ em. Phơi nhiễm aflatoxin gây suy giảm miễn dịch, nó có thể tương tác với HIV/AIDS và các bệnh nhiễm trùng khác [3]. 10