Tài liệu Phân lập, định danh và xác định khả năng chống tế bào ung thư của nấm thượng hoàng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG VĂN HƯNG “PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG ” LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG VĂN HƯNG “PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG ” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Mạnh Tuấn 2. TS. Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên, 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng hoặc công bố trong bất kì công trình nào khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Hoàng Văn Hưng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Công Nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Mạnh Tuấn và TS. Nguyễn Xuân Vũ đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài và hoàn thiện luận văn Thạc sĩ. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ, đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu. Trong quá trình học tập và ngiên cứu khó tránh khỏi những thiếu sót. Do đó, tôi mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô để luận văn được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng Tác giả luận văn Hoàng Văn Hưng năm 2022 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ............................................ 7 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 5 1.1. Trong nước ................................................................................................. 5 1.1.1. Đặc điểm tự nhiên và đa dạng sinh học của vùng miền núi phía Bắc .... 5 1.1.2. Tổng quan nghiên cứu về nấm Thượng Hoàng ...................................... 6 1.1.3. Tình hình nguồn cung cấp và nhu cầu nấm Thượng Hoàng ................... 9 1.2. Ngoài nước ............................................................................................... 10 1.2.1. Phân bố, phân loại và hình thái nấm Thượng Hoàng trong tự nhiên .... 10 1.2.2. Tóm lược lịch sử sử dụng của nấm Thượng Hoàng ............................. 11 1.2.3. Hoạt chất dược liệu của nấm Thượng Hoàng ....................................... 12 1.2.4. Ứng dụng của nấm Thượng Hoàng trong Y – Dược ............................ 17 1.2.5. Tính an toàn của nấm Thượng Hoàng................................................... 24 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 25 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 25 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 26 2.2.1. Phương pháp điều tra sự phân bố, thu thập nguồn gen nấm Thượng Hoàng trong tự nhiên....................................................................................... 26 iv 2.2.2. Phương pháp phân lập, lưu giữ nguồn gen nấm Thượng Hoàng .......... 27 2.2.3. Lưu giữ nguồn gen nấm Thượng Hoàng phân lập ................................ 28 2.2.4. Định danh, phân loại chủng nấm Thượng Hoàng thu thập được:......... 28 2.2.5. Phương pháp xác định hoạt chất chống ung thư của nấm Thượng Hoàng ....29 2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết hoạt chất sinh học tổng số từ nấm Thượng Hoàng in vitro............................. 30 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 32 3.1. Kết quả điều tra sự phân bố, thu thập, quy trình phân lập và lưu giữ nguồn gen của nấm Thượng Hoàng tại các khu rừng tự nhiên vùng núi phía Bắc ................................................................................................................... 32 3.1.1. Thu thập nguồn gen nấm Thượng Hoàng ............................................. 32 3.1.2. Phân lập nguồn gen nấm Thượng Hoàng từ quả thể............................. 38 3.1.3. Định danh, phân loại chủng nấm Thượng Hoàng thu thập được .......... 40 3.2. Xác định hoạt chất chống ung thư của nấm Thượng Hoàng ................... 46 3.3. Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết hoạt chất sinh học tổng số từ nấm Thượng Hoàng ....................................................................... 48 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 50 4.1. Kết luận .................................................................................................... 50 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng tổng hợp các hoạt chất sinh học chính được tách chiết từ nấm Thượng Hoàng (Phellinus spp.) ............................................ 13 Bảng 3.1. Phân bố và đặc điểm hình thái quả thể nấm Thượng Hoàng thu thập ..36 Bảng 3.2. Hiệu quả của các phương pháp khử trùng mẫu đến phân lập hệ sợi nấm Thượng Hoàng từ quả thể ......................................................... 38 Bảng 3.3. So sánh trình tự vùng gen ITS của các chủng phân lập với dữ liệu công bố trên GenBank ...................................................................... 42 Bảng 3.4. Hàm lượng hoạt chất polysaccharide và hispidin trong quả thể nấm Thượng Hoàng .................................................................................. 46 Bảng 3.5. Hoạt tính chống ưng thư của hoạt chất sinh học tổng số tách chiết từ nấm Thượng Hoàng ...................................................................... 48 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Đặc điểm hình thái nấm Thượng Hoàng thu thập........................... 37 Hình 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn ty của các chủng nấm Thượng Hoàng trên môi trường PDA, 7 ngày, 25oC. .............................................. 40 Hình 3.3. Điện di DNA tổng số (A) và sản phẩm PCR của trình tự gen ITS (B). M: marker 1kb; 1: NTH-PR1; 2: NTH-PR2; 3: NTH-PL3 và 4: NTH-PL4 ........................................................................................ 41 Hình 3.4. Sơ đồ phả hệ của các chủng nấm Thượng Hoàng dựa trên trình tự vùng gen ITS với dữ liệu công bố trên GenBank ........................... 45 Hình 3.5. Hàm lượng polysaccharide (a) và hispidin (b) có trong quả thể nấm Thượng Hoàng thu thập trong tự nhiên .......................................... 47 7 DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt CAT Catalase Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ Cs Cộng sự CT Công thức CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động ĐC Đối chứng IC50 Nồng độ ức chế 50% các dòng tế bào được khảo sát ITS Internal transcribed spacer KTST Kích thích sinh trưởng LSD Least Singnificant Difference Test MDA Malondialdehyde MT Môi trường NTH Nấm Thượng Hoàng PDA Potato Dextrose Agar SOD Superoxide dismutase 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới. Theo báo cáo của Tổ Y tế Thế giới (2018) có khoảng gần 1 triệu người chết nguyên nhân bởi các bệnh ung thư, trong đó có khoảng 70% trường hợp tử vong xảy ra ở các nước chậm phát triển và đang phát triển. Cùng với yếu tố di truyền thì các yếu tố ngoại cảnh (như tia cực tím từ ánh sáng mặt trời, hóa chất bảo vệ thực vật, các loại hoóc môn, khí thải và rác thải công nghiệp,….) được biết đến là tác nhân quan trọng nhất để “kích hoạt” các bệnh ung thư bùng phát. Theo dự đoán của Viện nghiên cứu ung thư thế giới (https://www.cancer.gov/) số lượng người bị bệnh ung thư có xu hướng tăng mạnh, lên đến khoảng 23.6 triệu người đến năm 2030. Nước ta có tỷ lệ mắc bệnh ung thư tương đối cao, có khoảng hơn 300.000 người sống chung với ung thư hàng năm, trong đó số người bị ung thư gan chiếm cao nhất (15,4%), ung thư phổi chiếm 14,4%, ung thư dạ dày khoảng 10,6%, ung thư vú chiếm 9,2%, ung thư đại trực tràng khoảng 8,9% và ung thư khác (https://pharmed.vn). Các loại thuốc/hóa chất là giải pháp hiệu quả để điều trị các bệnh ung thư khi phát hiện ra. Tuy nhiên, các loại thuốc/hóa chất điều trị ung thư rất tốn kém, dễ gây tác dụng phụ và biến chứng trong quá trình điều trị. Do đó, phát triển các loại hoạt chất sinh học tự nhiên, có hiệu quả, ít tác dụng phụ, ít tốn kém để phòng và điều trị ung thư là yêu cầu cấp bách, đặt ra cho các nhà khoa học và quản lý. Nấm Thượng Hoàng (Phellinus; danh pháp khoa học đồng nghĩa: Tropicoporus hoặc Inonotus hoặc Polyporus hoặc Sanghuangporus) phân loại lại thuộc ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes, bộ Hymenochaetales, họ Hymenochaetaceae. Nấm Thượng Hoàng được tìm thấy ở một số nước thuộc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Chen và cs, 2 2019)[15], là một trong những nấm dược liệu quý, có tác dụng rất hiệu quả trong phòng và điều trị ưng thư và được “mệnh danh là vua trị ung thư”. Các hoạt chất sinh học từ nấm Thượng Hoàng có tác dụng loại bỏ các tế bào/khối u ác tính mà không làm tổn hại đến các tế bào khác. Theo kết quả nghiên cứu của Ikekawa và cs (1968) [19] tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Tokyo (Nhật Bản), cho thấy tác dụng tiêu diệt tế bào/khối u của dịch triết các loại nấm dược liệu, thì nấm Thượng Hoàng có khả năng ức chế tế bào/khối u cao nhất (96,7%) so với các loại nấm dược liệu khác như nấm Hương (80,7%), nấm Vân Chi (75 – 77%), nấm Linh Chi (65 – 70%), nấm Cổ Linh chi (64,9%), nấm Mộc nhĩ (42,6%),… Khả năng ức chế, ngăn cản sự hình thành khối u trong phòng ngừa các bệnh ung thư ở người từ hoạt chất sinh học tách chiết từ nấm Thượng Hoàng được minh chứng qua rất nhiều thử nghiệm lâm sàng của các nhà khoa học trên toàn thế giới trong những năm gần đây. Hoạt chất từ nấm Thượng Hoàng có khả năng chống tế bào/khối u ở các bệnh nhân ung thư vú, bàng quang, ung thư ruột kết; chống viêm nhiễm và ức chế sự phát triển của khối u; tăng số lượng tế bào Lympho T (tế bào đóng một vai trò trung tâm trong miễn dịch ở người và động vật) và ngăn cản sự phát triển của khối u. Thêm một bằng chứng khoa học khác về hoạt chất sinh học từ nấm Thượng Hoàng có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư ở biểu mô tế bào gan, biểu mô đại tràng, biểu mô tuyến vú và ung thư phổi ở người. Bên cạnh đó, nấm Thượng Hoàng còn chứa đa dạng nhiều hoạt chất sinh học tiềm năng khác với tác dụng chống viêm nhiễm, chống đái tháo đường, bảo vệ gan, tim mạch. Các hoạt chất sinh học tiềm năng của nấm Thượng Hoàng có vai trò quan trọng để phòng và điều trị các bệnh ung thư, các hoạt chất sinh học của nấm Thượng Hoàng đã chứng minh có khả năng tiêu diệt các loại tế bào ung thư khác nhau: tế bào gốc ung thư tuyến tụy, tế bào u ác tính, tế bào ung thư 3 bạch cầu NB4, tế bào ung thư biểu mô tuyến, tế bào ung thư biểu mô vòm họng, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột HT29, tế bào ung thư vú, tế bào ung thư biểu mô thận A293, tế bào u tủy xương, tế bào ung thư não,... Đặc biệt, bên cạnh khả năng ức chế hiệu quả các loại tế bào ung thư, nấm Thượng Hoàng được coi là sản phẩm an toàn tự nhiên cho con người. Các nghiên cứu của Chen và cs (2019) [15], đã chứng minh về sự an toàn của nấm Thượng Hoàng. Thêm nữa, chưa có báo cáo về sự tác dụng phụ của nấm Thượng Hoàng ở người khi sử dụng cho tới nay. Vì vậy, sử dụng nấm Thượng Hoàng có chứa các hoạt chất chống ung thư từ tự nhiên trở thành xu hướng trên thế giới nhằm dần hạn chế/thay thế các loại thuốc hóa học trong điều trị ung thư (Chan và cs, 2009) [12]. Chính vì khả năng phòng và điều trị rất hiệu quả các bệnh ung thư mà không gây tác dụng phụ, nên nấm Thượng Hoàng đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học và quản lý trên toàn thế giới. Ở nước ta thuộc vùng khí hậu nhiệt đới, rất thuận lợi cho các nấm ăn và nấm dược liệu sinh trưởng, tuy nhiên chỉ có một vài nghiên cứu về nấm Thượng Hoàng bắt đầu được triển khai trong vòng 5 năm trở lại đây. Phần lớn các kết quả của các công trình nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở giai đoạn ban đầu, chưa đánh giá được giá trị dược liệu của nấm Thượng Hoàng Việt Nam (Phạm Quang Thu, 2016; Trần Thị Văn Thi và cs, 2016[6]; Trần Thị Lụa và Vũ Văn Hạnh, 2017) [4]. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Phân lập, định danh và xác định khả năng chống tế bào ung thư của nấm Thượng Hoàng ” 2. Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn, xác định và thu thập. được các chủng nấm Thượng Hoàng tự nhiên từ các tỉnh miền núi phía Bắc; Lưu giữ được các chủng nấm Thượng Hoàng có chứa hoạt chất chống ung thư cao; 4 Xác định được hàm lượng của các loại hoạt chất chống ung thư chính (hoạt chất Hispidin, Polysaccharide) và đánh giá được khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư của dịch chiết hoạt chất sinh học tổng số từ nấm Thượng Hoàng trong điều kiện in vitro. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn các chủng Thượng Hoàng tiềm năng sản sinh các loại hoạt chất chống ung thư là cơ sở khoa học quan trọng bổ sung thêm cơ sở dữ liệu thế giới về đa dạng các loại nấm Thượng Hoàng và hoạt chất sinh học của chúng. Bệnh ung thư để lại rất nhiều gánh nặng và hậu quả nặng nề cho nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh việc gây thiệt hại rất nặng về sức khỏe và tinh thần người dân, bệnh ung thư còn gây tiêu tốn rất nhiều tiền bạc trong quá trình điều trị. Nước ta có số trường hợp bị bệnh ung thư tương đối cao so với các nước trên thế giới, nấm Thượng Hoàng có sản sinh các loại hoạt chất phòng và chống ung thư sẽ có tác động tích cực đến sức khỏe người dân và giảm gánh nặng về kinh tế trong quá trình điều trị bệnh. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Trong nước 1.1.1. Đặc điểm tự nhiên và đa dạng sinh học của vùng miền núi phía Bắc Nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 25ºC, lượng mưa trung bình từ 1.700 đến 2.400 mm đã hình thành nên thảm động thực vật và các sinh vật sống ký sinh rất phong phú cho các tỉnh miền núi phía Bắc. Sự phong phú của hệ sinh thái vùng miền núi phía Bắc tập trung chính vào các Vườn Quốc gia (khu bảo tồn thiên nhiên) tại Ba Bể (với diện tích gần 8.000 ha) thuộc tỉnh Bắc Kạn, Phia Oắc - Phia Đén (10.000 ha) thuộc tỉnh Cao Bằng, Tam Đảo (37.000 ha) thuộc các tỉnh Vĩnh Phúc/Thái Nguyên/Tuyên Quang và Hoàng Liên (38.000 ha) thuộc tỉnh Lào Cai. Vườn Quốc gia Ba Bể - Bắc Kạn (22°24′ vĩ Bắc, 105°36′ kinh Đông) có độ cao từ 150 đến 1.098m so với mức nước biển. Khu bảo tồn thiên nhiên Ba Bể là nơi sinh sống của khoảng 1.281 loài thực vật thuộc 162 họ, 672 chi (trong đó có khoảng 600 loài cây thân gỗ, thuộc 300 chi, 114 họ khác nhau), 65 loài thú, 214 loài chim (thuộc 17 bộ, 47 họ), 46 loài bò sát và động vật lưỡng cư và hơn 87 loài cá,... Vườn Quốc gia Phia Oắc - Phia Đén, tỉnh Cao Bằng nằm ở tọa độ 22°35′ vĩ Bắc, 105°53′ kinh Đông, có độ cao từ 1.000 đến gần 2.000 m so với mực nước biển với hơn 8.000 ha rừng tự nhiên. Phia Oắc - Phia Đén là nơi có 352 loài thực vật và 58 loài động vật quý hiếm. Vườn Quốc gia Tam Đảo nằm trải dài từ 21°21'-21°42' vĩ Bắc và 105°23'-105°44' kinh Đông thuộc các tỉnh Vĩnh Phúc, Thái Nguyên và Tuyên Quang. Diện tích rừng tự nhiên chiếm khoảng 70% diện tích với 6 khoảng hơn 1.300 loài thực vật thuộc 660 chi thuộc 179 họ thực vật bậc cao có mạch, trong đó có các loài điển hình cho vùng cận nhiệt đới. Vườn Quốc gia Hoàng Liên (22°15′ vĩ Bắc, 103°30′ kinh Đông) thuộc tỉnh Lào Cai. Vườn Quốc gia Hoàng Liên nằm ở độ cao từ 1.000 đến 3.000 m so với mặt biển, là nơi có khoảng hơn 2.000 loài thực vật, thuộc 200 họ, trong đó có trên 700 loài cây được dùng làm thuốc. 1.1.2. Tổng quan nghiên cứu về nấm Thượng Hoàng Những nghiên cứu về nấm Thượng Hoàng ở nước ta mới được triển khai trong vòng 5 năm trở lại đây và đã đạt được một số thành tựu nhất định trong việc phân lập lưu giữ nguồn gen, cũng như đánh giá hoạt chất sinh học tách chiết từ nấm Thượng Hoàng, cụ thể: Đầu tiên, Phạm Quang Thu (2016) [7] tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus PL108 được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam), hệ sợi nấm Thượng Hoàng được nuôi cấy trên 03 loại môi trường khác nhau: PDA (potato dextrose agar), GYA (glucose yeast extract agar) và PGA (potato glucose agar); nhiệt độ từ 10, 15, 20, 25, 30 và 35oC; độ ẩm từ 75, 80, 85, 90, 95 và 100%. Kết quả cho thấy chủng PL108 sinh trưởng tốt trên môi trường PDA (tốc độ sinh trưởng 2,92 mm/ngày) và PGA (2,71 mm/ngày); khoảng nhiệt độ cho nấm từ 20 đến 30oC (nhiệt độ thích hợp nhất là 25oC); độ ẩm phù hợp cho hệ sợi nấm Thượng Hoàng sinh trưởng dao động từ 90 đến100% (thích hợp nhất là ở 90%). Cũng trong năm 2016, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi và cs [5] tiến hành xác đinh hoạt chất chống oxy hóa của nấm Thượng Hoàng được nuôi trồng ở nước ta. Hoạt chất sinh học của nấm Thượng Hoàng được tách chiết với ethanol 96o trong hai tuần và được loại bỏ protein tự do bằng 7 CHCl3:BuOH (4:1, v/v). Kết quả xác định hàm lượng phenolic tổng số (hoạt chất chống oxy hóa) của nấm Thượng Hoàng là 4,6 mg/g, cao hơn rất nhiều so với các mẫu nấm Linh chi: Hàn Quốc (có hàm lượng phenolic là 0,132 mg/g), Quảng Bình – Việt Nam (0,106 mg/g) và Huế - Việt Nam (0,053 mg/g). Nguyễn Xuân Duy và Đặng Quang Quốc (2016) [2], đã xác định được nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus) thu thập tại nước ta có chứa 4 thành phần chính, bao gồm polyphenol, flavonoid, polysaccharid và triterpenoid. Dịch chiết từ nấm Thượng Hoàng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa trong điều kiện in vitro với giá trị IC50 cho khả năng khử gốc tự do DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium) và năng lực khử ion sắt lần lượt là 50,9 và 54,2 µg/mL. Kết quả phân tích hàm lượng hoạt chất sinh học của nấm Thượng Hoàng (Phellinus pini) thu thập ở Pù Huống – Nghệ An cho thấy, Phellinus pini có chứa 05 loại chất chính bao gồm 02 loại chất thuộc nhóm triterpenoid gilvsin A (PPH-1) và gilvsin B (PPE-1); 03 loại hoạt chất thuộc nhóm steroit: ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2), ergosterol (PPH-2) và ergosterol peroxide (PPE-3) (Nguyễn Ngọc Tuấn, 2017) [8]. Trần Thị Lụa và Vũ Văn Hạnh (2017) [4] đã xác định được môi trường PGB cải tiến (Thành phần môi trường bao gồm khoai tây: 200g/L, glucose: 20g/L, yeast extract: 10g/L, MgSO4.7H2O: 0,5g/L) thích hợp cho hệ sợi nấm Thượng Hoàng vàng (Phellinus baumi Pb) ở nhiệt độ 28oC, pH ban đầu 6 và tốc độ lắc 150 vòng/phút. Hồ Thị Thu Ba và cs (2018) [1], đã khảo sát tính an toàn của dịch chiết từ nấm Thượng Hoàng thu thập trong tự nhiên trên chuột nhắt trắng ở liều lượng 0,4g/kg trọng lượng. Kết quả theo dõi chỉ tiêu về trọng lượng cơ thể, thông số huyết học như hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công thức bạch 8 cầu, tiểu cầu, các chỉ số liên quan đến hồng cầu như MCV (Mean corpuscular volume: Thể tích trung bình của một hồng cầu), MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin: Lượng huyết sắc tố trung bình trong một hồng cầu), MCHC (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration: Nồng độ trung bình của huyết sắc tố hemoglobin trong một thể tích máu), RDW (Red Cell Distribution Width: Độ phân bố kích thước hồng cầu); thông số thuộc chức năng gan: GOT (enzym thực hiện chức năng trao đổi amin), DPT, protein toàn phần, triglycerid; thông số thuộc chức năng thận (creatinin, urea), vi thể gan và thận của chuột sau 1 tháng khảo sát đều ghi nhận các chỉ tiêu nằm trong giới hạn bình thường. Sử dụng methanol để tách chiết hoạt chất sinh học từ nấm Thượng Hoàng (Phellinus gilvus thu thập tại Vườn Quốc gia Pù Mát – Nghệ An). Dịch chiết thô được tinh sạch và phân tách đồng thời bằng cột silica gel 60, sephadex LH-20 và Prep HPLC (sắc khí phân tách và thu nhận) thu nhận được 5 chất riêng rẽ. Kết quả phân tích bằng 1D-2D NMR (quang phổ hấp thụ) và sắc ký khí GC-MS cho thấy Phellinus gilvus sản sinh 05 hoạt chất, bao gồm 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene; ergosterol; ergosterol peroxide; (E)- 4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one cyclohexandien-1-yl]-3,3’,6,6’-tetrone, 4, và [bi-1,4- 4’-dihydroxyl-2,2’,5,5’- tetramethyl. Hoạt chất 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene là một trong 05 hoạt chất có nhiều tiềm năng nhất, có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương và nấm, bao gồm: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum, Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Candida albican), cũng như ức chế dòng tế bào ung thư biểu bì KB (Đỗ Xuân Hưng và cs, 2018) [3]. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm Thượng Hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở Việt Nam cho kết quả rất 9 triển vọng ứng dụng trong thực phẩm, cụ thể: (i) hai loại nấm Thượng Hoàng Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis chứa đựng đa dạng các loại axít amin: threonine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine, histidine, aspartic, serine, cysteine, alanine, tyrosine và proline với tổng axit amin thiết yếu lần lượt là 2694,64 và 3175,4 µg/g và tổng axit amin không thiết yếu là 3774,32 và 3346,65 µg/g; (ii) Các loại vitamine: E, D2, B3; (iii) Các khoáng chất: Na, K, Ca, Mg. Kết quả xác định cấu trúc của 9 loại hoạt chất tách chiết từ nấm Thượng Hoàng, bao gồm igniarine (PIE-1), meshimakobnol B (PIE-3), inoscavin A (PIE-6), daidzin (PIE-7), ergosterol (PIE-4), pterocarpin (PIE-8), ergosterol peroxit (PIE-5), meshimakobnol A (PIE-2) và 5-hydroxy-7methoxy-flavon (PIE-9). Tuy nhiên, các hoạt chất này thể hiện hoạt tính yếu với các dòng tế bào ung thư Lu, HepG2 và MCF7. 1.1.3. Tình hình nguồn cung cấp và nhu cầu nấm Thượng Hoàng Trong những năm trở lại đây, khi người dân nhận thức được giá trị của nấm Thượng Hoàng thì trên thị trường có rất nhiều loại nấm Thượng Hoàng và các sản phẩm chế biến từ chúng. Nấm Thượng Hoàng đến từ hai nguồn chính, đó là từ khai thác trong tự nhiên và nhập khẩu từ nước ngoài. Từ nguồn nhập khẩu dẫn đến giá thành khá cao, chỉ một số ít bộ phận người dân tiếp cận được với nấm Thượng Hoàng; hơn nữa có thể là khó để kiểm soát được chất lượng nấm Thượng Hoàng. Trong tự nhiên, nấm Thượng Hoàng sinh trưởng rất chậm, phải mất hàng năm mới hình thành quả thể nấm trưởng thành và nấm Thượng Hoàng được tìm thấy không nhiều ở nước ta. Việc khai thác nấm Thượng Hoàng trong tự nhiên ở nước ta đang diễn ra theo hình thức “tận thu” dẫn đến nguy cơ mất nguồn gen dược liệu quý và không chủ động được nguồn cung cấp nấm và các sản phẩm chế biến của chúng. Hơn nữa, nước ta có quá ít cơ cở nuôi cấy thành công quả thể nấm Thượng 10 Hoàng trong điều kiện nhân tạo. Trong khi nhu cầu ngày càng tăng của người dân về nấm Thượng Hoàng trong phòng và điều trị các bệnh ung thư. Theo báo cáo ngày 24/9/2019 của Bộ Y tế, nước ta xếp ở vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100.000 dân, đứng thứ 19 ở châu Á và thứ 5 ở khu vực Đông Nam Á. Số ca mắc ung thư mới hàng năm ở nước ta không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010. Năm 2018, số ca mắc mới tăng lên gần 165.000 ca/96,6 triệu dân, trong đó gần 70% trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca. Tính chung cả hai giới, 5 loại ung thư có tỉ lệ mắc nhiều nhất ở nước ta bao gồm ung thư gan chiếm cao nhất (15,4%), ung thư phổi chiếm 14,4%, ung thư dạ dày khoảng 10,6%, ung thư vú chiếm 9,2% và ung thư đại trực tràng khoảng 8,9% (https://pharmed.vn). Các loại thuốc hóa học để điều trị ung thư thì rất tốn kém và phát sinh nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Hơn nữa, nước ta là một trong các nước bị ảnh hưởng nặng bởi biến đổi khí hậu, trong đó có sự thay đổi bức xạ khí quyển là một trong các tác nhân quan trọng để “kích hoạt” các bệnh ung thư bùng phát. Thêm nữa, ngoài hiệu quả trong phòng và điều trị các bệnh ung thư, các hoạt chất sinh học của nấm Thượng Hoàng còn có tác dụng khác như chống béo phì, chống đái tháo đường, bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan, chống vi khuẩn gây bênh (kể cả vi khuẩn kháng kháng sinh) và chống virút. Vì vậy, chúng ta cần chủ động nguồn cung cấp nấm Thượng Hoàng có chất lượng cao cho nhu cầu của người dân, hạn chế sự phụ thuộc vào nguồn ngoại nhập hoặc từ tự nhiên. 1.2. Ngoài nước 1.2.1. Phân bố, phân loại và hình thái nấm Thượng Hoàng trong tự nhiên Nấm Thượng Hoàng (Tên khoa học: Phellinus spp.) thuộc ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes, bộ Hymenochaetales, họ 11 Hymenochaetaceae, chi Phellinus. Nấm Thượng Hoàng là một loại nấm dược liệu nổi tiếng phương Đông. Cho đến nay, có khoảng hơn 363 loài được phát hiện và công bố (http://www.mycobank.org), chúng tập trung chủ yếu ở các khu vực rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Phellinus linteus, Phellinus igniarius, Phellinus gilvus, Phellinus pini và Phellinus hartigii là các loài được nghiên cứu sớm nhất, chúng chứa đa dạng các loại hoạt chất dược liệu quý, đặc biệt về khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư mà không gây tác dụng phụ. Các loài thuộc nấm Thượng Hoàng có đặc điểm hình thái chung: sống ký sinh ở thực vật thân gỗ, quả thể nấm có kích thước từ 5 – 15 cm, độ dày của quả thể từ 1 – 5 cm nhưng hình dạng không đồng nhất giữa các loài, tuy nhiên phần lớn chúng có hình “móng ngựa” hoặc hình bán cầu,... Màu sắc mặt trên của quả thể nấm Thượng Hoàng cũng đa dạng tùy loài, có màu nâu, màu nâu sẫm, màu vàng, nâu gỉ, nâu đỏ sẫm, hoặc xám đến đen; mặt dưới của quả thể nấm chủ yếu là màu nâu vàng hoặc nâu thẫm. 1.2.2. Tóm lược lịch sử sử dụng của nấm Thượng Hoàng * Thời kỳ Cổ đại: Nấm Thượng Hoàng được tôn sùng như thuốc thảo dược quý trong hàng ngàn năm ở Trung Quốc và Nhật Bản. Hoàng đế của các triều đại lớn của Trung Quốc và Hoàng gia Nhật Bản đã sử dụng nấm Phellinus spp. để có sức khỏe tốt hơn và kéo dài cuộc sống. Trong lịch sử Trung Quốc cổ đại, Tần Thủy Hoàng (Hoàng đế đầu tiên của Trung Quốc) vào năm 220 trước Công nguyên coi nấm Phellinus spp. như một loại thuốc “tiên” cho phép duy trì tuổi trẻ “vĩnh viễn” và chỉ dành riêng cho Hoàng đế. Chính vì vậy, nấm Phellinus spp. được gọi tên là “nấm Thượng Hoàng”.