Tài liệu Nhận xét kết quả chuyển phôi đông lạnh của kỹ thuật trữ lạnh phôi ngày 2 và phôi ngày 3 tại bệnh viện phụ sản trung ương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hơn 30 năm kể từ khi em bé đầu tiên ra đời từ thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON), ngành hỗ trợ sinh sản đã đạt được rất nhiều thành tựu đáng kể nhằm nâng cao khả năng được làm mẹ của các bệnh nhân vô sinh. Kích thích buồng trứng (KTBT) đã trở thành thường quy nhằm tạo được nhiều noãn, nhiều phôi, tăng cơ hội có phôi chuyển cho bệnh nhân, từ đó tăng tỷ lệ thành công của TTTON. Do vậy khả năng có phôi dư sau chuyển phôi và quá kích buồng trứng thường hay xảy ra. Trên cơ sở đó, kỹ thuật trữ lạnh phôi ra đời và trở thành một bộ phận không thể thiếu trong điều trị vô sinh bằng TTTON. Thành công của kỹ thuật trữ lạnh phôi làm tăng tỷ lệ có thai cộng dồn sau chuyển phôi tươi và chuyển phôi đông lạnh, giảm nguy cơ quá kích buồng trứng nặng và góp phần không nhỏ trong việc giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân. Trữ lạnh phôi là một kỹ thuật bảo quản các phôi ở nguyên hiện trạng ban đầu trong một thời gian dài. Điều này có thể đạt được bằng cách lưu giữ phôi ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-1960C), làm ngưng các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp, chuyển hóa…, giúp chúng vẫn tiếp tục phát triển bình thường sau 1 thời gian dài đông lạnh . Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới thành công của chu kỳ chuyển phôi đông lạnh như tuổi của mẹ, chất lượng niêm mạc tử cung và chất lượng phôi sau rã đông… Trong đó chất lượng phôi sau rã đông phụ thuộc vào kỹ thuật trữ lạnh và thời điểm trữ lạnh của phôi. Kỹ thuật trữ lạnh phôi gồm ba phương pháp là trữ lạnh chậm (slow freezing), trữ lạnh nhanh (fast cooling) và trữ lạnh cực nhanh – thủy tinh hóa (vitrification). Các kỹ thuật này có thể áp dụng trữ lạnh phôi ở các giai đoạn khác nhau như: giai đoạn phôi tiền nhân, phôi phân chia giai đoạn sớm (phôi ngày 2, phôi ngày 3) hay ở giai đoạn phôi nang. Tuy nhiên, nếu sự ra đời của kỹ thuật đông phôi thủy 2 tinh hóa đã thể hiện ưu thế vượt trội trong các phương pháp trữ lạnh thì cho đến nay việc trữ phôi vào giai đoạn nào tối ưu nhất vẫn còn đang tranh cãi. Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia – bệnh viện phụ sản Trung Ương đã áp dụng thường quy kỹ thuật đông phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) từ năm 2009, các phôi thường được đông vào giai đoạn phôi ngày 2 hoặc ngày 3. Tuy nhiên thời điểm đông phôi ngày 2 hay ngày 3 vẫn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và sự thuận tiện, hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về đề tài này. Vì vậy, với mục đích tìm hiểu thời điểm trữ lạnh - rã đông phôi tối ưu nhằm tăng tỷ lệ thành công của chu kỳ chuyển phôi đông lạnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhận xét kết quả chuyển phôi đông lạnh của kỹ thuật trữ lạnh phôi ngày 2 và phôi ngày 3 tại bệnh viện phụ sản Trung Ương” nhằm hai mục tiêu: 1. Đánh giá kết quả chuyển phôi của phôi trữ lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vào tuổi phôi ngày 2 và ngày 3 tại bệnh viện phụ sản Trung Ương từ 01/10/2014 đến 31/03/2015. 2. Nhận xét một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ thai lâm sàng sau chuyển phôi đông lạnh. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VÔ SINH Vô sinh được định nghĩa là tình trạng không có thai sau một năm chung sống vợ chồng mà không sử dụng bất cứ một biện pháp tránh thai nào, trong khi có quan hệ tình dục trung bình 2-3 lần/tuần . Trên thế giới, tỷ lệ các nguyên nhân vô sinh cũng có sự thay đổi theo thời gian điều tra. Theo một thống kê thì nguyên nhân vô sinh do nữ chiếm 40%, vô sinh do nam chiếm 40%, vô sinh không rõ nguyên nhân chiếm 20% . Ở Việt Nam, điều tra tại Viện bảo vệ Bà mẹ và Trẻ sơ sinh từ 19931997 trên 1000 trường hợp vô sinh, tỷ lệ vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh do nam chiếm 36% và vô sinh không rõ nguyên nhân chiếm 10%. Các nguyên nhân vô sinh do nữ bao gồm nguyên nhân do vòi tử cung chiếm 35%, do rối loạn phóng noãn chiếm 35%, do lạc nội mạc tử cung chiếm 20%, không rõ nguyên nhân chiếm 10% . Các nguyên nhân vô sinh do nam bao gồm nguyên nhân bất thường về tinh dịch đồ (26,4%), giãn tĩnh mạch thừng tinh (12,3%), do suy tinh hoàn (9,4%), do tắc ống dẫn tinh (6,1%) và các nguyên nhân khác như các yếu tố bẩm sinh, mắc phải, miễn dịch, rối loạn cương, không xuất tinh . Có nhiều phương pháp điều trị tùy thuộc vào nguyên nhân gây vô sinh. Năm 1976, John Hunter thực hiện thành công trường hợp thụ tinh nhân tạo đầu tiên. Tuy nhiên đến cuối thế kỷ 20, các phương pháp đánh giá chức năng và cấu trúc vòi trứng mới trở nên hoàn thiện mở đường cho kỹ thuật nội soi phát triển. Cũng vào cuối thế kỷ 20, các tiến bộ trong lĩnh vực nội tiết sinh sản và nam khoa đã hỗ trợ tích cực trong việc chẩn đoán và điều trị vô sinh. 4 Sự ra đời của em bé đầu tiên từ TTTON Louise Brown năm 1978 đã mở ra một trang sử mới cho sự phát triển của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. 1.2. THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 1.2.1. Khái niệm Kỹ thuật TTTON là lấy noãn của người phụ nữ qua chọc hút kết hợp với tinh trùng đã được chuẩn bị trong ống nghiệm, sau đó phôi hình thành sẽ được chuyển trở lại trong buồng tử cung người mẹ. Quá trình phát triển của phôi thai sẽ diễn ra bình thường trong tử cung người mẹ. TTTON chiếm 50% các chu kỳ điều trị với kỹ thuật hỗ trợ sinh sản hiện nay trên thế giới . 1.2.2. Các chỉ định làm TTTON 1.2.2.1. Vô sinh do vòi tử cung Đây là chỉ định phổ biến nhất của TTTON ở Việt Nam. Theo Nguyễn Xuân Huy, tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2003, chỉ định TTTON do tắc vòi tử cung là 81,9% . 1.2.2.2. Vô sinh do chồng Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương (2003), chỉ định làm TTTON do tinh trùng yếu chiếm tỷ lệ 8,5% . Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI) ra đời đã cho phép những trường hợp nam giới thiểu năng tinh trùng nặng vẫn có cơ hội được làm cha. 1.2.2.3. Lạc nội mạc tử cung Lạc nội mạc tử cung (LNMTC) là sự phát triển của niêm mạc tử cung lạc chỗ, bên ngoài lòng tử cung. Trong số những phụ nữ hiếm muộn có tới 30 - 40% có LNMTC và 50% người bệnh có LNMTC bị hiếm muộn. Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương (2003), LNMTC chiếm khoảng 2,6% các chỉ định TTTON . 1.2.2.4. Do rối loạn phóng noãn 5 Không phóng noãn là nguyên nhân thường gặp trong điều trị vô sinh, chiếm khoảng 6% các chỉ định hỗ trợ sinh sản tại Mỹ. Lý do phổ biến trong nhóm nguyên nhân này là người bệnh có hội chứng buồng trứng đa nang. Trong số các trường hợp được chỉ định TTTON ở Bệnh viện Phụ sản Trung ương (2003) có 4,6% do hội chứng buồng trứng đa nang [6]. 1.2.2.5. Vô sinh không rõ nguyên nhân Tỷ lệ vô sinh không rõ nguyên nhân thay đổi từ 10 - 30%. Đây không phải là khái niệm mang tính tuyệt đối vì các nguyên nhân vô sinh có thể được phát hiện muộn trong những lần thăm khám sau và trong quá trình điều trị. Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương chỉ định TTTON do vô sinh không rõ nguyên nhân là 5,8% [6]. 1.2.2.6. Vô sinh do miễn dịch Các yếu tố miễn dịch gần như ảnh hưởng đến mọi bước trong quá trình sinh sản do quá trình phá hủy các giao tử bởi kháng thể kháng tinh trùng hay ngăn cản sự phân chia và phát triển sớm của phôi. Bơm tinh trùng lọc rửa vào buồng tử cung hoặc TTTON có thể được chỉ định trong trường hợp này [6]. 1.2.2.7. Thụ tinh nhân tạo thất bại TTTON thường được chỉ định sau 3 - 6 chu kỳ thụ tinh nhân tạo thất bại. Tuy nhiên chỉ định còn phụ thuộc vào các yếu tố khác, như người bệnh tuổi cao thì có thể chỉ định sớm hơn. Theo J.Mck Tabot và M.Lawrence, tỷ lệ thành công của kỹ thuật TTTON cao gấp 3 lần kết quả thụ tinh nhân tạo . Do đó TTTON hiện nay được chỉ định ngày càng rộng rãi hơn. 1.2.2.8. Hiến noãn và hiến phôi (Donation of eggs and embryos). 6 Trong hiến noãn: đứa con sẽ là kết quả của tinh trùng chồng, noãn của người hiến và môi trường tử cung của người vợ khi có thai và khi đẻ. Hiến phôi là đặt phôi hình thành từ noãn và tinh trùng của một cặp vợ chồng khác vào buồng tử cung của người xin phôi. 1.2.2.8. Mang thai hộ Mang thai hộ được chỉ định cho những trường hợp không có tử cung hay tử cung không có khả năng mang thai mà buồng trứng vẫn còn chức năng. TTTON được thực hiện từ trứng của người vợ và tinh trùng của người chồng. Người mang thai hộ sẽ được chuyển phôi, mang thai và đẻ. Ở Việt Nam, Chính phủ vừa ban hành nghị định số: 10/2015/NĐ-CP về mang thai hộ vì mục đích nhân đạo. 1.2.3. Một số phương pháp HTSS thông dụng kèm theo TTTON - Trữ lạnh phôi thông dụng nhất và không thể thiếu được ở một trung tâm TTTON. - Trữ lạnh noãn và tinh trùng. - Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI). - Chọc hút tinh trùng từ mào tinh (PESA) và tinh hoàn (TESE). - Xin noãn, xin tinh trùng, xin phôi. - Nuôi cấy trưởng thành noãn non (IVM). - Hỗ trợ phôi thoát màng (AH). - Chẩn đoán sàng lọc di truyền tiền làm tổ. 1.3. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT TRỮ LẠNH Trữ lạnh trong HTSS nói chung là một kỹ thuật bảo quản các giao tử và phôi ở nguyên hiện trạng ban đầu trong một thời gian dài ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-1960C) . Sự trữ lạnh giao tử và phôi khởi đầu bằng sự tiếp xúc với các chất bảo quản lạnh, sau đó được làm lạnh tới nhiệt độ dưới 0 oC để lưu trữ, khi rã đông được pha loãng, loại bỏ các chất bảo quản lạnh và quay trở lại môi trường sinh lý để có thể phát triển tiếp tục. Tế bào phải giữ nguyên được cấu trúc của nó qua quá trình trữ lạnh. 7 Nguyên lí cơ bản quan trọng nhất của trữ lạnh là làm giảm tổn thương gây nên bởi sự hình thành các tinh thể đá nội bào. Để đạt được điều này, các tế bào được loại bỏ nước trước hoặc trong quá trình trữ lạnh. Nếu sự khử nước không hoàn toàn sẽ dẫn đến hình thành các tinh thể đá nội bào lớn gây tổn thương hoặc gây chết tế bào. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống sót của giao tử và phôi trữ lạnh bao gồm: loài, giai đoạn phát triển, loại chất bảo vệ đông lạnh và phương pháp đông lạnh . 1.3.1. Nguyên tắc trữ lạnh 1.3.1.1. Giảm độ hòa tan của các khí trong môi trường Yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc gây tổn thương tế bào qua việc tạo ra những bong bóng khí khổng lồ. Những bọt khí này thường có kích thước từ 25-100µm. Trong suốt quá trình rã đông, số lượng bọt khí tăng lên nhanh chóng trong vài phút, phình to lên thành không bào bên trong tế bào khiến tế bào trương phồng lên gây tổn thương các tổ chức nội bào, cũng như màng trong suốt, từ đó có thể làm vỡ các phôi bào hoặc noãn. Hiện nay người ta sử dụng môi trường trữ lạnh có hệ đệm PBS (phosphate buffer salt) để khắc phục hiện tượng này. 1.3.1.2. Sự hình thành các tinh thể nước đá Khi nước được làm lạnh dưới điểm đông (freezing point), nó sẽ đông đặc lại trong một cấu trúc tinh thể gọi là đá (ice), tạo điều kiện cho sự tồn tại đồng thời hai pha trong cùng một dung dịch, một là pha rắn của tinh thể đá, hai là pha dung dịch gồm các muối và các chất hòa tan. Trong môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300 mosmol/kg), việc hình thành các tinh thể đá diễn ra ở - 5 oC đến -15oC, tuy nhiên sự hình thành tinh thể đá chỉ liên tục khi nhiệt độ khoảng -10 0C. Khi nhiệt độ xuống dưới -130 oC thì không còn dung dịch nước nữa mà chỉ tồn tại ở dạng kết tinh (crystalisation) và sự thủy tinh hóa (vitrification). Khi đá chiếm một thể tích lớn hơn nước ở 8 trạng thái lỏng, nó sẽ gây ra một sức ép và lực xuyên thủng các cơ quan nội bào dẫn đến tổn thương tế bào. Trong quá trình đông lạnh, có hiện tượng nước di chuyển ra khỏi tế bào và hình thành đá trong khoang ngoại bào. Nhiều đá ngoại bào gây ra sự phá hủy cơ học, gây tổn thương màng tế bào qua cơ chế chèn ép. Vì thế nguyên lý quan trọng trong trữ lạnh là tránh hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào . 1.3.1.3. Tăng nồng độ các chất hòa tan trong môi trường Khi phần lớn nước trong môi trường trở thành trạng thái rắn, nồng độ các chất hòa tan tăng lên làm tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường, môi trường trở nên ưu trương, tế bào mất nước co lại. Sự giảm thể tích tế bào quá mức sẽ làm tổn thương không hồi phục cấu trúc và bộ khung tế bào làm tế bào chết. Vì vậy, nguyên lý thứ hai là tránh shock thẩm thấu. 1.3.1.4. Tăng nhiệt độ tiềm ẩn Khi nước chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, sẽ tỏa ra 1 lượng nhiệt tương đối lớn, có khả năng thay đổi nhiệt độ môi trường từ vài độ (-) lên lại 0°C. Thay đổi này làm ảnh hưởng tới khả năng sống của tế bào và chức năng của tế bào sau khi rã đông . 1.3.1.5. Độ pH của dung dịch Độ pH của dung dịch giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid - base của môi trường biến đổi theo chiều hướng tăng lực ion, làm cho các protein hòa tan trong môi trường dễ bị kết tủa. Các chất bảo vệ lạnh có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid - base của dung dịch. Ví dụ: glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, những ester (DMSO) là base mạnh. Sự biến đổi độ pH của dung dịch theo nồng độ sẽ khác nhau tùy theo loại chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng. Tuy nhiên, độ pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ thấp mà tế bào được bảo quản. 9 Người ta nhận thấy rằng sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH trên 9 . 1.3.1.6. Áp suất thẩm thấu Nhiệt độ chính xác để hình thành sự kết tinh và thủy tinh hóa phụ thuộc vào các chất hòa tan trong dung dịch. Trong dung dịch NaCl, hiện tượng thủy tinh hóa xảy ra ở nhiệt độ -20 oC đến -30oC. Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti. Vì vậy trước khi đạt đến điểm này, NaCl vẫn ở trạng thái dung dịch. Tuy nhiên, số lượng phân tử nước có mặt ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt độ. Kết quả trực tiếp là giảm áp suất thẩm thấu của môi trường: môi trường trở nên ưu trương. Ngay trước khi đạt đến điểm Eutecti, nồng độ NaCl khoảng 5M, ở điểm đông nó chỉ còn 0,16M (đẳng trương). Như vậy, khi bảo quản đông lạnh trong môi trường đẳng trương, tế bào sẽ mất nước và giảm thể tích do sự hình thành tinh thể đá ngoại bào làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường . 1.3.2. Các đối tượng trữ lạnh 1.3.2.1. Trữ lạnh tinh trùng Kỹ thuật này đã được các nhà khoa học biết đến ngay từ những năm cuối của thế kỷ 18. Tuy nhiên, đến năm 1953, đứa bé đầu tiên ra đời từ sự thụ tinh giữa trứng và tinh trùng sau trữ lạnh mới được ghi nhận. Trữ lạnh tinh trùng là một kỹ thuật đơn giản hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt nam, hệ thống ngân hàng tinh trùng và việc sử dụng tinh trùng trữ lạnh trong HTSS đã trở thành các kỹ thuật điều trị thường quy . 1.3.2.2. Trữ lạnh noãn Xét về tính chất, so với trữ phôi thì trữ noãn giúp hạn chế được những rắc rối pháp lý về quyền sở hữu phôi. Hiện nay việc bảo quản khả năng sinh sản ngày càng được quan tâm do tuổi sinh đẻ ngày càng muộn cũng như giúp 10 các bệnh nhân ung thư còn có cơ hội được làm mẹ, vì vậy tối ưu hóa kỹ thuật trữ lạnh noãn ngày càng được quan tâm và nghiên cứu. Tuy nhiên, xét về kỹ thuật, mặc dù trữ noãn động vật cũng như noãn người đã được thực hiện thành công nhưng hiệu quả của kỹ thuật này vẫn còn rất thấp. Vào thời điểm hiện nay chỉ có kỹ thuật trữ phôi và trữ tinh trùng là được áp dụng thường quy trên lâm sàng . 1.3.2.3. Trữ lạnh phôi Bên cạnh trữ lạnh tinh trùng, trữ lạnh phôi cũng phát triển vượt bậc trong thời gian gần đây. 1.4. TRỮ LẠNH PHÔI 1.4.1. Khái niệm trữ lạnh phôi Với việc sử dụng kỹ thuật KTBT để cải thiện và đơn giản hóa các quy trình TTTON người ta có thể thu nhận được một số lượng lớn noãn bào và kết quả là nhiều phôi được tạo thành cùng một lúc. Tuy nhiên không thể chuyển vào cơ thể người mẹ quá nhiều phôi, hoặc người mẹ chưa sẵn sàng để nhận phôi chuyển, vì thế các phôi tốt, có khả năng làm tổ cao còn dư, đã được trữ lạnh sau đó được rã đông và chuyển phôi vào một chu kỳ khác. Từ đó quy trình trữ lạnh phôi ra đời đã góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm. Mười năm sau khi Whitingham thành công trên việc trữ lạnh phôi chuột, năm 1983 Trounson và Mohr đã báo cáo trường hợp có thai đầu tiên từ phôi người trữ lạnh . Kể từ đó, việc trữ lạnh phôi được biết đến và tiếp tục phát triển mạnh. Điều này thu hút các nhà khoa học tập trung nghiên cứu vào lĩnh vực này kéo theo sự thay đổi không ít của các trung tâm hỗ trợ sinh sản. Hiện tại kỹ thuật trữ lạnh – rã đông – chuyển phôi đông lạnh được thực hiện thường quy với tỷ lệ làm tổ của phôi đông lạnh cũng tương tự như của phôi 11 tươi. Kỹ thuật này đã và đang phát triển nhanh chóng, ngày càng hoàn thiện hơn và trở thành hướng mở không thể thiếu trong TTTON. 1.4.2. Một số chỉ định về trữ lạnh phôi - Còn dư phôi chất lượng tốt sau chuyển phôi tươi. - Bệnh nhân có nguy cơ bị hội chứng quá kích buồng trứng nặng. - Niêm mạc tử cung không thuận lợi để chuyển phôi: nghi ngờ polyp buồng tử cung, nhân xơ tử cung dưới niêm mạc, niêm mạc quá mỏng hoặc bị dính buồng tử cung, chu kỳ xin – cho noãn không hợp nhất được vòng kinh… - Không chuyển phôi đúng thời điểm do các lý do cá nhân hoặc các bệnh lý toàn thân như ung thư, điều trị hóa chất, tia xạ, xuất huyết nội …. - Chuyển phôi khó do catheter không qua được cổ tử cung. - Hiến phôi, mang thai hộ. 1.4.3. Điều kiện của phôi để được trữ lạnh Phôi được chọn phải có chất lượng tốt, có khả năng sống sót cao và tiếp tục phát triển tốt sau khi được rã đông. - Phôi có thể đông ở các giai đoạn khác nhau. Ở mỗi giai đoạn có các tiêu chuẩn khác nhau để phôi được trữ lạnh, các tiêu chuẩn này lại phụ thuộc vào mỗi trung tâm hỗ trợ sinh sản khác nhau. 1.4.4. Đánh giá hiệu quả trữ lạnh phôi Hiệu quả của việc trữ lạnh phôi được đánh giá qua 3 cấp độ: - Cấp độ 1: là khả năng sống của phôi sau khi rã đông. Phôi được đánh giá về hình dạng 1 giờ sau khi rã đông, thể hiện ở chỉ số sống (survival index). - Cấp độ 2: là khả năng phát triển của phôi trong môi trường nuôi cấy, đánh giá phôi sau 24 giờ, biểu hiện bằng tỷ lệ sống (survival rate). - Cấp độ 3: cũng là cấp độ quan trọng nhất, là khả năng phát triển của phôi sau khi được chuyển vào tử cung người mẹ, thể hiện bằng tỷ lệ phôi làm tổ. 12 1.4.5. Các giai đoạn của phôi được trữ lạnh Phôi người có thể được trữ lạnh ở các giai đoạn phát triển khác nhau: giai đoạn tiền nhân (zygote - pronuclear), giai đoạn phân chia sớm và giai đoạn phôi nang (blastocyte). 1.4.5.1. Giai đoạn tiền nhân (2 PN: pronucleotid): phôi ngày 1. Sau khi sự thụ tinh xảy ra, noãn bắt đầu quá trình phân bào giảm nhiễm lần 2 mà đang bị ngừng ở metaphase II, kết thúc bằng tống cực cầu 2 vào khoang quanh noãn khoảng vài giờ sau thụ tinh. Nhiễm sắc thể (NST) trong noãn được bao quanh lại bởi một màng và hình thành tiền nhân nữ, chất NST ở đầu tinh trùng tan ra và cũng được bao bọc bởi một màng và hình thành tiền nhân nam. Sự xuất hiện hai tiền nhân xảy ra 16 - 18 giờ sau đó. Ở một vài trường hợp tiền nhân có thể xuất hiện sớm hơn 12 - 14 giờ hoặc trễ hơn 20 22 giờ. Mỗi tiền nhân có bộ nhiễm sắc thể đơn bội của bố hoặc mẹ . Phôi tiền nhân có thể được trữ lạnh trong lúc còn ở giai đoạn 1 tế bào. Ở giai đoạn 1 tế bào, phôi tiền nhân dễ dàng được xác định là còn sống hay không sau khi rã đông. Phôi tiền nhân thoái hóa khi màng của nó không còn nguyên vẹn, hình thái của tế bào trở nên dẹp và bào tương thường có màu sậm. Sau nuôi cấy khoảng 15 - 24 giờ, phôi bắt đầu giai đoạn phân chia thứ nhất. Sự phân chia của tế bào biểu hiện cho sự sống sau khi rã đông; có ít hơn 5% phôi tiền nhân có sức sống giảm sau khi áp dụng phương pháp này. Hiện nay một số trung tâm HTSS ở Mỹ, Đức chỉ đông phôi giai đoạn này vì lý do tôn giáo . 1.4.5.2. Giai đoạn phân chia sớm Sự phân cắt là quá trình nguyên phân liên tiếp của hợp tử sẽ tạo ra 1 loạt phôi bào (blastomere) nhưng có kích thước nhỏ đi, do bào tương không tăng trưởng. Quá trình phân chia của nhân được bắt đầu khi hai tiền nhân hòa hợp, đồng thời khởi sự cho quá trình nguyên phân. Hai tiền nhân đơn bội khuếch 13 đại chuỗi gen, tiến sát với nhau, các NST sắp xếp dọc theo thoi vô sắc và sự hợp giao hai tiền nhân xảy ra tại thời điểm 20 - 23 giờ sau khi thụ tinh. Các trung thể kéo mỗi bên nhiễm sắc thể về hai cực, một khe xuất hiện ở giữa khiến cho hợp tử cắt thành hai tế bào phôi lưỡng bội. Sự phân chia đầu tiên thường quan sát thấy tại thời điểm 23 - 26 giờ sau khi thụ tinh.  Phôi ngày 2: Vào ngày thứ 2, các phôi ở giai đoạn 4 tế bào (khoảng 45 giờ sau khi thụ tinh).  Phôi ngày 3: Vào ngày thứ 3, các phôi ở giai đoạn 8 tế bào (khoảng 54,3 - 72 giờ sau khi thụ tinh). a: Phôi 2PN b: Phôi 2 tế bào c: Phôi ngày 2 d: Phôi ngày 3 Hình 1.1. Các giai đoạn phân chia của phôi Bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, nguyên sinh chất của phôi trở nên có hạt và các lõm nhỏ xuất hiện. Có một sự tăng cường kết dính phôi bào để sau đó đi vào giai đoạn nén. Sự nén ở phôi người có thể nhìn thấy ở trạng thái 8 tế bào, rất hiếm khi phôi người phân chia đến 16 - 32 tế bào trước khi nén .  Phôi ngày 4: Vào ngày thứ 4 sau khi thụ tinh, sau hiện tượng nén xảy ra vào cuối ngày 3, các phôi bào liên kết chặt chẽ đã được nén lại với các đường viền tế bào mờ đi, quan sát dưới kính hiển vi giống quả dâu nên gọi là phôi dâu (morula) với 30 - 32 tế bào. Phôi đã có sự phân cực từ các tế bào bên trong liên kết với nhau tạo thành các nguyên bào phôi (embryoblast) và các tế bào phía ngoài liên kết với nhau tạo thành các nguyên bào lá nuôi 14 (trophoblast). Các tế bào có hướng phát triển khác nhau sẽ được phân tách dần trong suốt quá trình phân cắt của phôi dâu. Trong quá trình này có sự tái sắp xếp của các tế bào lớp ngoài và lớp trong, kết quả dẫn đến sự hình thành một khối tế bào tập trung ở một cực của phôi sau này sẽ trở thành mầm phôi (ICM: inner cell mass). Lớp tế bào ở phía ngoài là nguồn gốc của lá nuôi phôi được gọi là nguyên bào nuôi (TE: trophoblast embryo). Giai đoạn phân chia sớm của phôi có thể được trữ lạnh thành công từ giai đoạn 2 tế bào cho đến giai đoạn phôi dâu, tuy nhiên việc quyết định trữ lạnh phôi thường được cân nhắc vào ngày 2 khi phôi ở giai đoạn 3 - 4 tế bào hoặc vào ngày 3 khi phôi ở giai đoạn 6 - 8 tế bào. Người ta có thể xác định được cả về hình thái lẫn tốc độ phát triển của phôi trước trữ lạnh và sau rã đông, cho phép lựa chọn được phôi có sức sống tốt trước khi trữ, cũng như lựa chọn những phôi có chất lượng tốt để chuyển phôi. Các nghiên cứu trên phôi trữ lạnh – rã đông giai đoạn phân chia sớm cho thấy phôi có khả năng sống khi còn giữ được ít nhất một nửa số phôi bào còn nguyên sau rã đông. Tỷ lệ phôi sống sau rã đông khoảng 50 - 80%, tỷ lệ phôi sống cao nhất khi phôi trước đông có hình thái bình thường, không có mảnh vỡ và các tế bào đồng đều . 1.4.5.3. Phôi ngày 5: phôi nang (blastocyst) Sự chuyên hóa các tế bào ICM và TE khiến cho phôi tiến lên giai đoạn phôi nang. Ở thời kì này, các bơm Na+/K+ ATPase sẽ bơm Na+ ra khỏi tế bào và vào trong khoảng không gian quanh tế bào, do sự chênh lệch áp suất riêng phần của Na+, nước sẽ di chuyển ra ngoài khoảng gian bào. Khoang chứa dịch tăng nhanh về thể tích hình thành một khoang rộng trong phôi gọi là khoang phôi nang (blastocyst cavity). Sự hình thành phôi nang invitro xảy ra giữa ngày thứ 5 và ngày thứ 7 sau khi thụ tinh, khi đạt được ở trạng thái khoảng 60 tế bào. Sự nở rộng của phôi nang gây nên sự mỏng dần của lớp màng trong suốt cho 15 đến khi nó vỡ và phôi nang bắt đầu thoát ra ngoài, gọi là thoát màng. Hiện tượng phôi thoát màng xảy ra vào ngày thứ 6 hay thứ 7, để bắt đầu giai đoạn bám vào nội mạc tử cung. Những phôi không thể thoát màng thường bị thoái hóa ở ngày thứ 8 đến ngày thứ 9 . a: phôi dâu (ngày 4) b: phôi nang (ngày 5) Hình 1.2. Phôi dâu (Morula) và phôi nang (Blastocyte). 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH PHÔI Hiện nay, kỹ thuật trữ lạnh có thể được chia thành ba nhóm chính: hạ nhiệt độ chậm, hạ nhiệt độ nhanh và hạ nhiệt độ cực nhanh hay thủy tinh hóa. 1.5.1. Phương pháp hạ nhiệt độ chậm (slow-freezing) Phương pháp hạ nhiệt độ chậm với chất bảo quản đông lạnh là PROH, với môi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường cấy phôi có bổ sung thêm 20% huyết thanh ngày càng ít được sử dụng. Trước khi làm lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi trường có chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế bào. Nồng độ PROH và sucrose trong từng môi trường là: giai đoạn làm lạnh 1(15 phút): 1,5M PROH và giai đoạn làm lạnh 2 (5 phút): 1,5M PROH + 0,1M sucrose. Sau đó phôi được cho vào các ống trữ có thể tích khoảng 0,25ml và trữ theo chương trình. Với phác đồ này, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá, đòi hỏi phải mất nhiều thời gian và có máy 16 móc. Qui trình đông lạnh này có thể áp dụng cho đông lạnh phôi ở bất cứ giai đoạn nào. 1.5.2. Phương pháp hạ nhiệt độ nhanh (fast cooling) Phương pháp làm lạnh nhanh (khoảng -30 oC /phút) không phụ thuộc vào sự cân bằng giữa sự hình thành tinh thể đá và sự khử nước của tế bào, mà chỉ phụ thuộc vào nồng độ cao của chất bảo quản lạnh và sự đi vào của chất bảo quản làm giảm lượng nước của tế bào, nhờ đó làm giảm sự hình thành tinh thể đá nội bào Ưu điểm của phương pháp làm lạnh nhanh khá đơn giản, có sự thay đổi trong thành phần của chất bảo quản lạnh giúp sự mất nước nhanh hơn từ tế bào, thời gian tiến hành trữ lạnh và rã đông ngắn, không nhất thiết sử dụng đến thiết bị làm lạnh (máy trữ phôi). Tuy nhiên, có nhiều bằng chứng cho thấy về tính gây độc của chất trữ lạnh đối với phôi, cụ thể khi nhiệt độ cân bằng trên 20 oC. Để giảm ảnh hưởng độc này có thể đặt phôi tiếp xúc với chất bảo quản xung quanh 0 oC nhưng điều kiện này lại làm giảm tốc độ khuếch tán của chất bảo quản qua màng tế bào . 1.5.3. Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification) Thủy tinh hóa (Vitrification) là quá trình làm lạnh phôi với thời gian rất nhanh, trong suốt quá trình hạ nhiệt độ toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển dạng thành khối đặc, trong suốt giống thủy tinh mà không có sự tạo thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào. Hiện tượng này cần tốc độ làm lạnh cực nhanh hoặc sử dụng dung dịch có nồng độ cao, điều này làm giảm sự hình thành tinh thể đá và tăng tính nhớt ở nhiệt độ thấp. Với kỹ thuật này, sự thành công phụ thuộc vào việc loại bỏ nước được hình thành trong các tế bào của phôi trong quá trình trữ lạnh. Để tránh sự hình thành tinh thể nước đá trong phôi, chất bảo quản lạnh được thêm vào để thay thế hầu hết nước có trong phôi, qua đó ngăn ngừa hình thành tinh thể nước đá nên phôi sẽ 17 được an toàn trong quá trình trữ lạnh. Khi phôi được rã đông, chất bảo quản lạnh sẽ được loại bỏ khỏi tế bào phôi để thay thế bằng nước. Phương pháp thủy tinh hóa bao gồm sử dụng nồng độ chất bảo quản đông lạnh cao (5 - 7M) và tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000 - 2500°C/phút). Tế bào bị khử nước nhờ tiếp xúc với nồng độ chất bảo quản đông lạnh cao. Sự chuyển sang trạng thái thủy tinh xảy ra ở khoảng -130 oC nhưng dao động phụ thuộc vào thành phần trong dung dịch thủy tinh hóa. Trong quá trình thủy tinh hóa, thời gian tiếp xúc với dung dịch bảo quản của mẫu phải ngắn do ảnh hưởng độc tính của dung dịch bảo quản có nồng độ cao. Tuy nhiên, nếu thời gian tiếp xúc quá ngắn, các chất bảo quản chưa thấm vào đủ và tinh thể nội bào có thể hình thành, thậm chí còn có cả tinh thể đá ngoại bào. Cách để ngăn ngừa độc tính của chất bảo quản trong quá trình thủy tinh hóa là sử dụng nồng độ chất bảo quản cao trong thời gian ngắn hoặc tăng thời gian cân bằng với dung dịch bảo quản có nồng độ thấp hơn. Năm 1937, Luyet là người đầu tiên đã mô tả đông lạnh mô bằng phương pháp thủy tinh hóa. Người ta có thể nhận thấy rằng phương pháp thủy tinh hóa tỏ ra có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp đông lạnh chậm: ngoài ưu điểm tiết kiệm về thời gian, giảm bớt chi phí cho một trường hợp đông lạnh trứng hoặc phôi, khả năng sống sau rã đông khi được đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm . Nghiên cứu tổng quan năm 2008 đã chỉ ra rằng phương pháp thủy tinh hóa cho tỷ lệ sống sót sau rã đông cao hơn có ý nghĩa thống kê so với phương pháp hạ nhiệt độ chậm, tuy nhiên tỷ lệ làm tổ thì không có sự khác biệt giữa hai nhóm . 1.6. QUY TRÌNH CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH 1.6.1. Chuẩn bị niêm mạc tử cung 18 Thành công hay thất bại của 1 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh trong TTTON phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố được xem là quan trọng nhất là chất lượng phôi sau rã đông và sự chấp nhận của nội mạc tử cung người mẹ. Chất lượng phôi có thể được đánh giá bằng các tiêu chuẩn về phôi học trong labo. Với các tiến bộ trong kỹ thuật trữ lạnh, chất lượng phôi sau rã đông ngày càng được cải thiện. Trong khi đó sự chấp nhận của NMTC vẫn chưa có lời giải đáp rõ ràng. Sự chấp nhận của NMTC hay còn gọi là “cửa sổ làm tổ” của phôi, là giai đoạn mà phôi có thể “bám dính” và phát triển tại NMTC. Thời điểm bắt đầu, độ dài và các yếu tố báo hiệu “cửa sổ làm tổ” đến nay vẫn chưa có chứng cứ thỏa đáng. Hiện nay đa số các nghiên cứu đều lấy thời điểm bắt đầu có sự hiện diện của progesterone làm mốc bắt đầu của “cửa sổ làm tổ”, độ dài của cửa sổ thường kéo dài 4 ngày từ ngày 20 đến ngày 23 của vòng kinh 28 ngày, hay bắt đầu khoảng ngày thứ 6 sau khi xuất hiện đỉnh LH . Trên lâm sàng, để đánh giá sự chấp nhận của NMTC thường khảo sát 2 yếu tố: độ dầy và hình ảnh NMTC trên siêu âm. Nhiều nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa độ dày NMTC và tỷ lệ có thai. Tỷ lệ có thai gần như không xảy ra ở những trường hợp NMTC mỏng hơn 7mm . Trong nửa đầu chu kỳ chuyển phôi đông lạnh bệnh nhân sẽ được chuẩn bị niêm mạc tử cung bởi các hormone estrogen và progesterone nội sinh hoặc ngoại sinh để giúp cho NMTC người mẹ ở trạng thái sẵn sàng nhận phôi. Có nhiều phương pháp chuẩn bị niêm mạc tử cung khác nhau nhưng đều nhằm mục đích cuối cùng là giúp niêm mạc phát triển theo chiều hướng có lợi, đảm bảo chất lượng, quyết định thời điểm chuyển phôi thích hợp với cửa sổ làm tổ của phôi, tạo điều kiện tối ưu cho phôi sau rã đông làm tổ trong nội mạc tử cung. Các phương pháp chuẩn bị niêm mạc tử cung 19 1.6.1.1. Với BN bị suy chức năng buồng trứng: do cơ thể không tự sản sinh ra estrogen và progesterone, BN bắt buộc phải sử dụng hormone estrogen và progesterone ngoại sinh. Hiện nay, có rất nhiều phác đồ sử dụng hormone estrogen và progesterone ngoại sinh với các đường dùng, liều dùng và biệt dược khác nhau, tùy theo quan điểm của từng tác giả. - Các đường dùng Estrogen: đường uống Progynova (Schering), Valiera (Relacine S), đường dán (Estraderm)….. - Ưu điểm: chủ động được thời gian chuyển phôi, tác động trực tiếp lên NMTC, có thể thực hiện trên tất cả các đối tượng bệnh nhân. Khuyết điểm: thời gian sử dụng nội tiết hỗ trợ thai kỳ dài hơn, tác dụng phụ estrogen ngoại sinh. 1.6.1.2. Với BN còn chức năng buồng trứng: BN có thể chuẩn bị NMTC bằng estrogen và progesterone nội hoặc ngoại sinh.  Sử dụng estrogen và progesterone ngoại sinh: như đã trình bày ở trên.  Theo dõi chu kỳ tự nhiên: Với phác đồ này sự phát triển của độ dày NMTC và cửa sổ làm tổ của phôi liên quan trực tiếp tới các hormone sản phẩm của buồng trứng và thời điểm rụng trứng. Vì vậy cần kiểm soát chặt chẽ nồng độ estradiol và LH vào giai đoạn nang noãn sớm và mỗi ngày vào giai đoạn chuẩn bị phóng noãn . - Ưu điểm: Đơn giản, không tốn kém. Thời gian sử dụng nội tiết hỗ trợ thai kỳ ngắn hoặc không cần. Khuyết điểm: khó khăn trong việc theo dõi LH nội sinh, không thích hợp với bệnh nhân rối loạn phóng noãn, không chủ động thời gian chuyển phôi.  Kích thích buồng trứng: có thể sử dụng gonadotropin đơn thuần hoặc phối hợp GnRH agonist. Tuy nhiên theo một nghiên cứu phân tích gộp 2008 cho thấy GnRH agonist không làm tăng ích lợi trong chuẩn bị NMTC . - Ưu điểm: Thời gian sử dụng nội tiết hỗ trợ thai kỳ ngắn. Khuyết điểm: Không chủ động thời gian chuyển phôi, chi phí tiêm thuốc tốn kém, nguy cơ 20 quá kích buồng trứng. Hơn nữa nồng độ estradiol cao sẽ gây feedback ngược lên giai đoạn hoàng thể làm giảm tỉ lệ có thai.  Kích thích nhẹ buồng trứng: Tiêm gonadotrophins FSH liều thấp (100IU) từ N8 - N10, cho hCG 10.000IU vào N11. Vào N13 nếu NMTC  7mm bổ sung estradiol và progesterone. Rã phôi và chuyển phôi 48 - 72 giờ sau E2 và P4 . - Ưu điểm: chi phí không cao, tránh tác dụng không mong muốn khi KTBT là QKBT, thời gian theo dõi ngắn, có thể thay thế cho các trường hợp thất bại khi chuẩn bị NMTC bằng sử dụng estradiol ngoại sinh. Khuyết điểm: thời gian sử dụng nội tiết hỗ trợ thai kỳ dài hơn. Theo Kristen và cs (2006); Tarek và cs (2006) các phác đồ chuẩn bị NMTC để chuyển phôi trữ cho tỉ lệ có thai tương đương nhau . Một nghiên cứu tổng quan gồm 22 nghiên cứu tiến cứu, ngẫu nhiên đối chứng cho thấy: trong các phác đồ chuẩn bị NMTC cho chuyển phôi đông lạnh thì việc bổ sung thêm Aspirin, corticosteroid hay hCG trước chuyển phôi trữ không làm tăng tỷ lệ có thai; hay việc sử dụng progesterone đường âm đạo không khác biệt so với đường tiêm bắp [8]. 1.6.2. Rã đông phôi Mỗi một phương pháp trữ lạnh và một môi trường trữ lạnh có một cách thức rã đông riêng. Các phôi sẽ được lấy ra khỏi bình trữ lạnh, được nhúng vào nước ấm hoặc vào môi trường rã đông ở 37 oC. Phôi được chuyển qua môi trường rã đông với nồng độ giảm dần, cuối cùng là môi trường đệm để chất bảo vệ từ từ thoát khỏi tế bào. Sau khi rã đông phôi được cho vào môi trường nuôi cấy, có thể nuôi cấy tiếp 1 - 2 giờ hoặc nuôi cấy qua đêm để đánh giá khả năng phát triển tiếp của phôi rồi tiến hành chuyển phôi. 1.6.3. Kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng (Hatching Assisted).