Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ l-tyrosin (tt)

  • Số trang: 29 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 85 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Tham gia: 31/07/2015

Mô tả:

B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O B YT TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N I NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN C U XÂY D NG QUY TRÌNH TỔNG HỢP LEVOTHYROXIN MONONATRI VÀ LIOTHYRONIN MONONATRI TỪ L-TYROSIN Chuyên ngành: Công nghệ dư c phẩm và bào ch thuốc Mã số: 62720402 TÓM T T LUẬN ÁN TI N Sƾ DƯỢC HỌC Hà N i, năm 2016 Công trình này đư c hoàn thành t i: - B môn Công nghiệp Dư c, trường Đ i học Dư c Hà N i - B môn Bào ch , trường Đ i học Dư c Hà N i - Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương - Viện Hóa học, viện Hàn lâm khoa học Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện TS. Nguyễn Văn Hân Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án s đư c bảo vệ trước H i đồng chấm luận án cấp trường họp t i: Vào hồi: giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án t i: Thư viện quốc gia Việt Nam Thư viện trường Đ i học Dư c Hà N i CÁC KÝ HI U, CH VI T T T Ch vi t t t Ch đầy đ hoặc nghƿa ti ng Vi t 13 Phổ c ng hưởng từ h t nhân carbon-13 C-NMR (Carbon13- Nuclear Magnetic Resonance) 1 H-NMR Phổ c ng hưởng từ h t nhân proton (Proton- Nuclear Magnetic Resonance) Ac Acetyl (CH3CO-) Acac Acetyl acetonat ACN Acetonitril DMF Dimethylformamid [HCON(CH3)2] eq Đương lư ng (equivalent) EI Ion hóa va ch m điện tử (electron impact) ESI Ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionization) Et Ethyl (C2H5-) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Highperformance liquid chromatography) IR Phổ hồng ngo i (Infrared Spectrophotometer) LD50 Liều ch t trung bình Me Methyl (CH3-) MS Phổ khối lư ng (Mass Spectrometry) OECD Tổ chức H p tác và Phát triển Kinh t (Organization for Economic Co-operation and Development) Rf Hệ số lưu giữ (retention factor) T2 Diiodothyronin (3,5-diiodo-thyronin) T3 Triiodothyronin, liothyronin (3,5,3’-triiodothyronin) T3 Na Liothyronin natri T3 diNa Liothyronin dinatri T4 Tetraiodothyronin, levothyroxin (3,5,3’,5’tetraiodo-thyronin) T4 Na Levothyroxin natri T4 diNa Levothyroxin dinatri tonc Nhiệt đ nóng chảy Ts Tosyl (p-CH3-C6H4-SO2-) TsOH Acid p-toluensulfonic MỞ Đ U Tính c p thi t c a lu n án Kho ng 3 - 5% dân s Vi t Nam bị suy tuyến giáp. B nh gặp ở nhiều lứa tuổi và nhiều đ i tượng. Trẻ em bị suy giáp sẽ chậm lớn và kém phát triển trí tu . B nh cũng hay gặp ở phụ nữ có thai, gây hậu qu nghiêm trọng đến thai nhi. Ngoài s ít trường hợp suy giáp do dùng thu c kháng giáp có thể hồi phục khi ngưng thu c, còn đa s các trường hợp khác đều ph i điều trị bằng hormon giáp tr ng c đời. Hi n nay, nhu cầu s dụng levothyroxin và liothyronin ở nước ta trong điều trị b nh là khá lớn mà vi c s n xuất nguyên li u trong nước chưa thực hi n được. Con đường tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri chủ yếu đi t L-tyrosin, nguyên li u này có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân các nguồn keratin khác nhau như s ng, tóc… Nếu chúng ta tiến hành nghiên cứu, s n xuất thành công levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri thì sẽ chủ động được nguồn nguyên li u. Quyết định s 61/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 07/05/2007 về vi c phê duy t “Chương trình nghiên cứu khoa học công ngh trọng điểm qu c gia phát triển công nghi p hóa dược đến năm 2020” đã đặt ra cho ngành dược Vi t Nam một mục tiêu quan trọng là tăng cường tự s n xuất nguyên li u làm thu c, tiến tới chủ động s n xuất thu c trong nước. Mục tiêu c a lu n án 1. Xây dựng được quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Đánh giá được độ ổn định và độc tính cấp của sản phẩm. 1 Nội dung c a lu n án 1. Kh o sát các phương pháp tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri t L-tyrosin. 2. Chọn ra phương pháp phù hợp để triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri đ t tiêu chuẩn dược dụng. 3. Đánh giá độ ổn định của 2 s n phẩm ở 2 điều ki n: lão hóa cấp t c và điều ki n thường. 4. Đánh giá độc tính cấp của 2 s n phẩm. Nh ng đóng góp mới c a lu n án 1. Đã xây dựng được quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri t L-tyrosin s n xuất trong nước theo phương pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco với c i tiến sau:  Đã thực hi n thành công ph n ứng kh hóa hợp chất 3,5-dinitro4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenylalanin ethyl ester ở điều ki n áp suất thường.  Đã c i tiến phương pháp t o mu i mononatri của levothyroxin và liothyronin bằng cách dùng natri bicarbonat bão hòa thay cho natri carbonat bão hòa. 2. Lần đầu tiên thực hi n thành công phương pháp t o ether Ullmann trong tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester t ph n ứng giữa dẫn chất L-tyrosin và 4-bromoanisol với xúc tác là mu i đồng (I) iodid và ph i t sắt (III) acetylacetonat trong môi trường kali carbonat và dung môi dimethyl formamid. C u trúc c a lu n án 2 Luận án gồm 135 trang, 50 hình, 38 b ng, 148 tài li u tham kh o. B cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (32 trang), Nguyên li u, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Thực nghi m và kết qu nghiên cứu (65 trang), Bàn luận (25 trang), Kết luận và đề xuất (2 trang), Tài li u tham kh o (17 trang), Danh mục các công trình khoa học đã công b liên quan đến đề tài luận án (1 trang), Danh mục phụ lục (4 trang), Phụ lục (79 trang). Ch ng 1: T NG QUAN 1.1. T ng quan v levothyroxin và liothyronin 1.1.1. Levothyroxin mononatri hydrat I HO I O I ONa NH O . x H O 2 2 I Hình 1.2. Công thức cấu t o của levothyroxin mononatri hydrat 1.1.2. Liothyronin mononatri hydrat O HO I I O NH O N a . x H 2O 2 I Hình 1.4. Công thức cấu t o của liothyronin mononatri hydrat 1.1.3. Tác dụng dược lý của hormon tuyến giáp Kích thích các ph n ứng trao đổi làm tăng chuyển hoá cơ b n, tăng hấp thu glucose ở ruột và tăng phân huỷ glycogen, nên gây tăng đường huyết, tăng phân huỷ triglycerid, phospholipid và cholesterol, tăng tổng hợp protein. Không đủ hormon tuyến giáp sẽ gây ra b nh 3 suy giáp, trẻ chậm lớn và không phát triển trí tu , người lớn bị chứng m ch chậm, gi m thân nhi t, gi m trao đổi chất cơ b n, gi m ho t động trí não, bướu cổ. 1.2. Các ph ng pháp t ng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri Có 2 phương pháp: Phương pháp chính tổng hợp qua chất trung gian 3,5-diiodo-Lthyronin: I 1 . I2/KI/base 1e q O HO I OH O I 2 . N a2CO 3 2 . N a2CO 3 1 eq 7 I 1 . I2/KI/base 2e q I ONa N H2 O NH 2 O 6 HO I HO I O I ON a NH2 O 8 I Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp levothyroxin mononatri (8) và liothyronin mononatri (7) t 3,5-diiodo-L-thyronin (6) Trong đó giới thi u các phương pháp tổng hợp 6: Phương pháp của các tác gi như: C. R. Harington và cộng sự, A. David và cộng sự, W. Siedel và cộng sự, G. Hillmann, J. R. Chalmers và cộng sự (sau này có c i tiến của P. Bracco trong 1 s bước quan trọng), P. Z. Anthony và R. I. Meltzer. Các phương pháp khác: Phương pháp của Salamonczyk, Phương pháp oxy hóa của L. G. Ginger. 1.3. Các ph ng pháp t o hợp ch t diaryl ether Có 4 phương pháp: Phương pháp ghép đôi nhờ xúc tác Cu: Ph n ứng Ullmann cổ điển; Ph n ứng ghép đôi Ullmann các dẫn chất có nhóm 4 thế ortho; Ph n ứng ghép đôi của các acid arylboronic nhờ xúc tác Cu(OAc)2. Phản ứng thế ái nhân trong nhân thơm: Ph n ứng thế ái nhân chuẩn; Ph n ứng thế ái nhân để t o phức kim lo i-aren; Với mu i diaryl iodo. Phản ứng oxy hóa: Oxy hóa các phenol. Các phương pháp khác. 1.4. Phân tích, l a chọn h ớng nghiên c u Qua tổng quan tài li u và dựa vào xu hướng nghiên cứu trên thế giới đã tổng kết được có 4 phương pháp tổng hợp 2 nguyên li u t Ltyrosin: Phương pháp 1: Oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp của L. G. Ginger t o levothyroxin; Phương pháp 2: Ngưng tụ với dẫn chất iodoni iodid của G. Hillmann t o levothyroxin và liothyronin; Phương pháp 3: Tổng hợp qua dẫn chất nitro của J. R. Chalmers t o levothyroxin và liothyronin; Phương pháp 4: T o cầu n i diaryl ether t dẫn chất của L-tyrosin với acid 4- methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo tác gi A. David t o levothyroxin và liothyronin. T các phương pháp trên chúng tôi dự định tiến hành kh o sát để tìm ra phương pháp phù hợp nhất với điều ki n thiết bị hi n có và có thể triển khai tổng hợp ở quy mô lớn hơn. Đồng thời nghiên cứu phương pháp t o ether Ullmann giữa một aryl halogenid và L-tyrosin để t o liên kết ether của hormon giáp tr ng với hy vọng sẽ có đóng góp mới về mặt khoa học, sau đó tiến hành nghiên cứu tiếp kh năng ứng dụng vào thực tế s n xuất. Ch ng 2: NGUYÊN LI U, TRANG THI T B VÀ PH PHÁP NGHIÊN C U 2.1. Nguyên li u 5 NG Nguyên li u, hóa chất, dung môi s dụng trong nghiên cứu đều là lo i đ t tiêu chuẩn tổng hợp. Các dung môi sắc ký đ t tiêu chuẩn dùng cho HPLC. 2.2. Thi t b nghiên c u S dụng các thiết bị tổng hợp hóa dược chuyên dụng, các thiết bị dùng để định tính, định lượng tin cậy của trường Đ i học Dược Hà Nội, vi n Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Vi n Hàn lâm Khoa học Vi t Nam, vi n Kiểm nghi m thu c trung ương. 2.3. Ph ng pháp nghiên c u 2.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học Bằng các ph n ứng hữu cơ cơ b n: iodo hóa, acetyl hóa, ester hóa, oxy hóa, thủy phân, nitro hóa, ngưng tụ, kh hóa, diazo hóa và ph n ứng t o mu i natri t phenol, t acid carboxylic. 2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết Theo 2 phương pháp: Nhi t độ nóng ch y và Sắc ký lớp m ng. 2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp, đề tài đã s dụng phương pháp phổ: IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR. 2.3.4. Phương pháp kiểm nghiệm Theo USP 34 đ i với T3Na và BP 2010 đ i với T4Na. 2.3.5. Phương pháp đánh giá độ ổn định - Đ i tượng th : 3 lô đóng lọ PE, tránh ánh sáng. - Điều ki n th nghi m: Điều ki n lão hóa cấp t c: Nhi t độ 40  2°C; độ ẩm: 75  5%. Điều ki n thường: Nhi t độ thường 30  2°C; độ ẩm: 75  5% 6 - Các chỉ tiêu kh o sát: tính chất, góc quay cực riêng, mất kh i lượng do làm khô, giới h n t p chất liên quan và hàm lượng (theo USP 34 đ i với liothyronin mononatri và theo BP 2010 đ i với levothyroxin mononatri). 2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tính cấp Mô hình liều c định theo hướng dẫn của OECD. 2.3.7. Xử lý và biểu thị các kết quả nghiên c u Các kết qu nghiên cứu được x lý bằng công cụ th ng kê thích hợp. Ch ng 3: TH C NGHI M VÀ K T QU NGHIÊN C U 3.1. T ng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester Đây là bước t o cấu trúc diaryl ether, là ph n ứng “chìa khóa” của quy trình. Tổng hợp theo 3 phương pháp sau: 3.1.1. Phương pháp mới tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-Lthyronin ethyl ester (5)- ng dụng phương pháp tạo ether Ullmann O O 4 - br o m oa n is o l I M eO I OE t OEt N H Ac HO C u I, F e (a c ac ) 3, K 2C O 3 , DM F I 8 7, 0 % I N H Ac O 5 4 Hình 3.2. Ph n ứng t o 5 theo phương pháp Ullmann 3.1.2. Phương pháp c a J. R. Chalmers và P. Bracco 7 O O OH NH HO 2 H N O /H SO 3 2 4 NH HO 0 -2 0oC O H A c O/ N a O H 2 O 2N 2 OH 7 7, 9 % N O2 34 25 O O E t OH , S O C l2 8 9, 6 % O 2N N H Ac NO O N 2 M eO 1 . T s Cl / p y r id i n OEt HO N H Ac HO N O2 8 9, 1 % 3 O O 2N OE t 9 2, 5 % N O2 7 7, 1 % 2 H /P d - C 2 N H Ac O 2 . p - m e th o x y p h e n o l 27 26 O M eO H N 2 O OE t N H Ac O NH 2 . I /K I 2 2 I M eO 1 . N aN O / H S O , Ac OH 2 2 4 OE t N H Ac O 8 9, 1 % I 28 5 Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp 5 theo phương pháp J. R. Chalmers và P. Bracco 3.1.3. Phương pháp c a G. Hillmann O O OH a . I2 / KI I 9 1, 1 % NH2 HO 3 b . N aI O 3/ N aI NH 2 HO OH N H Ac HO 8 5,2 % 31 I 9 0, 1 % O I A c 2O / N aO H OH I 32 E tO H , Ts O H 8 8, 0 % N a I O 3, A c 2O , A c O H H 2S O 4, K I M eO O I M eO I I OMe OE t + 1 2, 3 % N H Ac HO 33 I 4 4 9, 3 % O M eO I OEt N H Ac O 5 I Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp 5 theo phương pháp của G. Hillmann 8 3.2. T ng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin Dùng 2 tác nhân: HBr 47% hoặc HI 57%: OEt NHAc O 5 O a. HBr 47% / AcOH 87,1 % O I MeO I HO b. HI 57% / AcOH 92,4 % I OH O 6 NH2 I Hình 3.5. Sơ đồ tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin (6) 3.3. T ng hợp và tinh ch levothyroxin mononatri 3.3.1. Tổng hợp levothyroxin (1) Tổng hợp 1 t 6 theo phương pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco. O HO I O 6 I OH O I2 / KI, EtNH2 HO I 86,4 % I O 1 NH2 I OH NH2 I 3.3.2. Tinh chế levothyroxin Kết tinh qua d ng mu i dinatri. K t qu : tonc: 235-236oC; Rf = 0,22 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR = 5,8 phút). Điều ki n sắc ký: Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid H3PO4 trong 1000,0 mL. T c độ dòng: 1,5 mL/phút. Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3243 (OHphenol); 3080 (CHthơm); 1638 (C=Ocarboxylic); 2974 và 2885 (C-Hno); 2599 (N+-Hmu phân t ether); ); 1638 (C=Ocarboxylat mu i nội phân t i nội );1559 (C=Cthơm); 1178 (C-Odiaryl 526 (C-I). ESI-MS (m/z): 777,5 [M+H]+ (CTPT C15H11I4NO4, M = 776,87). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 9 2 JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b 13 = 4,5 Hz, H-2); 7,1 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’). C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,8 (C-3); 54,7 (C-2); 87,8 (C-3’’, C-5’’); 91,8 (C-3’, C-5’); 125,0 (C-2’’, C-6’’); 139,0 (C1’); 140,9 (C-2’, C-6’); 150,1 (C-4’’); 151,0 (C-1’’); 151,4 (C-4’); 169,4 (C=Ocarboxylic). 3.3.3. So sánh và lựa chọn phương pháp tổng hợp levothyroxin B ng 3.6. So sánh các phương pháp tổng hợp levothyroxin Ph Đặc điểm Số phản ứng HS 5 từ Ltyrosin (%) ng Ph ng pháp J. Ph ng pháp pháp G. R. Chalmers và t o ether Hillmann P. Bracco Ullmann 7 8 5 33,3 40,9 58,8 33,3 82,4 58,8 HS 5 từ phản ứng có dùng Iod (%) Các ph n ứng Hợp chất không quá phức iodoni 33 d t p, trang thiết bị Các đặc điểm gây nổ, khó phù hợp với điều khác tinh chế, hi u ki n hi n có. Quy suất thấp trình khá ổn định. (12,2%) Không dùng iod t đầu. 10 Phương pháp mới, khó tinh chế s n phẩm của ph n ứng ether hóa, dùng iod ngay t ph n ứng đầu. 3.3.4. Tạo levothyroxin mononatri (8) Kh o sát 2 phương pháp t o mu i với 2 tác nhân là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa. Hi u suất t o mu i của 2 phương pháp tương đương nhau (78,0 %). Tạo muối với natri carbonat bão hòa: I HO I I O I OH O HO I I O N H2 O 1 Na2C O3 bh I 8 ONa NH2 I K t qu : tonc: 206,5-208,9 (phân hủy); Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH (70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C = 2 trong HCl 0,2M / EtOH 96%); Hàm lượng: 97,9 %; Kết quả phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3458 (NH2); 3060 (C-Hthơm); 2910 (C-Hno); 1591 (C=Ocarboxylat); 1534 (C=C thơm); 1242 và 1137 (C-Odiaryl ether); 543 và 436 (C-I). ESI-MS (m/z): 799,4 [M+H]+ (CTPT C15H10I4NNaO4, M = 798,85). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2 JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b 13 = 4,5 Hz, H-2); 7,0 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’). C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 35,1 (C-3); 55,0 (C-2); 87,9 (C-3’’, C-5’’); 91,8 (C-3’, C-5’); 124,91 (C-2’’, C-6’’); 139,2 (C-1’); 140,9 (C-2’, C-6’); 148,2 (C-4’’); 151,6 (C-1’’); 153,4 (C-4’); 169,6 (C=Ocarboxylat). Tạo muối với natri bicarbonat bão hòa: H HO I H O I OH N H2 O 1 N aH C O3 bh O HO I I O 8 I 11 ON a NH2 I K t qu : tonc: 207-209oC; Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH (70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C=2 trong HCl 0,2M/ EtOH 96%). 3.4. T ng hợp và tinh ch liothyronin mononatri Gồm 2 giai đo n: Tổng hợp liothyronin t 3,5-diiodo-L-thyronin (tinh chế qua mu i dinatri); và T o mu i mononatri (kh o sát với 2 tác nhân t o mu i là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa). O HO I O OH I2 /KI , ethyla min NH2 O HO I I O I 6 OH NH2 2 I NaOH 50 % O O HO I I O HCl 1 N OH NH2 2 I NaO I I O 37 ONa NH2 I Na2 CO3 bh O HO I I O 7 ONa NH2 I Hình 3.9. Sơ đồ ph n ứng t o liothyronin natri (7) K t qu : Liothyronin: tonc: 236-237oC; Rf = 0,32 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR = 4,3 phút). Điều ki n sắc ký: Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid H3PO4 trong 1000,0 mL. T c độ dòng: 1,5 mL/phút. Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3178 (OHphenol); 3035 (CHthơm); 2762 (N+-Hmu i nội phân t ); 1599 (C=Ocarboxylat mu i nội phân t ); 1570 và 1496 (C=Cthơm); 1246 và 1175 (C-Odiaryl ether); 534 (C-I). ESI-MS (m/z): 651,6 [M+H]+ (CTPT C15H12I3NO4, M = 650,97). 1H-NMR 12 (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3 JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2-H3b = 4,5 Hz, H-2); 6,6 (1H, dd, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, 4JH5’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-5’’); 6,8 (1H, d, JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, H-6’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’-H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8 3 (2H, s, H-2’, H-6’). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,9 (C-3); 54,9 (C-2); 84,5 (C-3’’); 91,9 (C-3’, C-5’); 115,1 (C-5’’); 116,2 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 138,8 (C-2’, C-6’); 140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,9 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 169,1 (C=Ocarboxylic). Liothyronin mononatri: Kh o sát 2 phương pháp t o mu i mononatri với 2 tác nhân t o mu i là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa. Hi u suất t o mu i của 2 phương pháp tương đương nhau (71,1 %). K t qu : tonc: 205-206°C (phân hủy); Rf = 0,31 [CHCl3 - MeOH HCOOH (70:15:15)]; Hàm lượng: 98,2%; Kết quả phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3389 (NH2); 2963 (C-Hthơm); 1618 (C=Ocarboxylat); 1498,08 (C=Cthơm); 1246,27 (C-Odiaryl ether); 498,87 và 456,01 (C-I). ESI-MS (m/z): 673,64 [M+H]+ (CTPT C15H11I3NNaO4, M = 672,96). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2 JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,4 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b = 4,5 Hz, H-2); 6,6 (1H, dd, 3JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, 4JH6’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-6’’); 6,8 (1H, d, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, H-5’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 35,3 (C-3); 55,1 (C-2); 84,5 (C-3’’); 92,0 (C-3’, C-5’); 115,1 (C-5’’); 116,1 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 139,1 (C-2’, C-6’); 13 140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,8 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 170,0 (C=Ocarboxylat). 3.5. Triển khai quy trình t ng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri L - ty ro s i n N IT R O H Ó A H N O 36 8 % /H 2S O 4 9 8 % N -A C E T Y L H Ó A A c 2O / N a O H 2 N E ST ER H ÓA E t O H / S O C l2 E TH ER H ÓA p -m e t h o x y p h e n o l/p y r i d in T s C l / p y ri d i n K H HÓ A á p s u ấ t t h ườ n g H 2/ P d -C D IA Z O H Ó A IO D O H Ó A (o n e p o t) N a N O 2/ H 2S O 4 9 8 % , A c O H I 2/K I H B r 4 7 % /A c O H L O I N HÓ M B O V IO D O H Ó A T O T3 T O M U I NA T R I I OD O HÓ A T O T4 I 2/ K I 1 e q , E tN H 2 T O MU I NA TR I N a H C O 3 bh L io thy ro n in m o n o n a tr i I2/ K I 2 e q , E t N H 2 N a HC O3 bh L e v o t h y ro x i n m o n o n a tr i Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri 14 Kh i lượng L-tyrosin: 525,0 g. Hi u suất toàn chặng: levothyroxin mononatri đ t 27,4 %, liothyronin mononatri đ t 23,0 %. Các ph n ứng cho hi u suất tương đ i ổn định. 3.6. Kiểm tra ch t l ợng s n phẩm theo tiêu chuẩn d ợc điển Nguyên li u liothyronin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn theo USP 34 và levothyroxin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn theo BP 2010. 3.7. Đánh giá độ n đ nh c a s n phẩm S li u độ ổn định ở điều ki n lão hóa cấp t c cho thấy 2 s n phẩm không có biến đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theo dõi. Dữ li u độ ổn định dài h n cho thấy hàm lượng trong giới h n qui định. Tuổi thọ của levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri được dự đoán lần lượt là 26 tháng và 30 tháng. 3.8. Đánh giá độc tính c p C hai nguyên li u không độc, không xác định được LD50. Ch ng 4: BÀN LU N 4.1. V t ng hợp hóa học 4.1.1. Các phương pháp tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin Qua tổng quan tài li u chúng tôi tìm được 5 phương pháp tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri t L-tyrosin. Trong đó có 2 phương pháp chúng tôi không kh o sát: Phương pháp oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp của L. G. Ginger; và Phương pháp t o cầu n i diaryl ether t dẫn chất của Ltyrosin với acid 4-methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo tác gi A. David. . Đã kh o sát 3 phương pháp sau đây: 15 Ph ng pháp mới sử dụng ph n ng t o diaryl ether c a Ullmann: Cách đây hơn 100 năm, Ullmann đã đưa ra phương pháp t o ether giữa phenol và aryl halogenid. Xúc tác cho ph n ứng là bột đồng nguyên t hay các mu i đồng với lượng lớn, nhi t độ ph n ứng thường cao. Trong su t hơn 100 năm qua đã có hàng trăm công trình tổng hợp ether theo phương pháp t o ether Ullmann cổ điển được công b , nhưng đặc bi t chưa có công trình nào áp dụng trong tổng hợp hormon giáp tr ng. Trường hợp các aryl halogenid có nhóm thế ortho t o phức với Cu như triazen hoặc trifluoroacetamid thì ph n ứng có thể x y ra ở nhi t độ thấp hơn các ph n ứng Ullmann cổ điển. Trường hợp trong ph n ứng thay thế các aryl halogenid bằng các acid arylboronic thì ph n ứng có thể x y ra ở nhi t độ phòng với các xúc tác như Cu (II) acetat, triethylamin hoặc pyridin. Phương pháp này đã được áp dụng trong tổng hợp levothyroxin với hi u suất t o ether là 81 %. Không chỉ d ng ở đó, đến năm 2010, hai tác gi người Trung Qu c là Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự đã tiếp tục c i tiến phương pháp t o ether Ullmann kết hợp xúc tác Cu/Fe đã làm gi m đáng kể lượng chất xúc tác. Các tác gi này đã tổng hợp thành công cấu trúc diaryl ether của hàng chục chất với quy mô lớn và hi u suất tương đ i t t. Nghiên cứu của Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự t o ý tưởng cho chúng tôi trong quá trình tìm kiếm phương pháp mới tổng hợp cấu trúc diaryl ether của hormon giáp tr ng. Chúng tôi th nghi m ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa 3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester và 4-bromoanisol với xúc tác là các nguồn đồng và ph i t là các nguồn sắt. Nghiên cứu bước đầu cho thấy, ph n ứng có nhiều ưu điểm như: d tiến hành, thích 16
- Xem thêm -