Tài liệu Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây củ mài (dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

  • Số trang: 49 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 781 |
  • Lượt tải: 1
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN -------*****------- PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI ( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật HÀ NỘI, 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN -------*****------- PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI ( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh lí học thực vật trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài. Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017 Sinh viên PHẠM THỊ QUY LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố. Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017 Sinh viên PHẠM THỊ QUY MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 2 4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3 1.1. Đặc điểm và phân loại cây Củ mài ......................................................... 3 1.1.1. Phân loại thực vật cây Củ mài ............................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài ............................................... 4 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ................................................................ 5 1.1.4. Đặc điểm của dƣợc liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế biến .... 5 1.1.5. Thành phần hóa học ............................................................................. 5 1.1.6. Công dụng .............................................................................................. 6 1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 7 1.2.1. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ....... 7 1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật .................................................. 7 1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ............................................. 7 1.2.1.3. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào ................................. 9 1.2.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .................... 9 1.2.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động ..................................................... 9 1.2.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy ........................................................................ 9 1.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi ............................................................... 9 1.2.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh .......................................................................... 10 1.2.2.5. Giai đoạn đƣa cây ra đất ................................................................. 10 1.2.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật . 10 1.2.3.1. Các muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng ......................................... 11 1.2.3.2. Nguồn cacbon ................................................................................... 12 1.2.3.3. Các vitamin và acid amin ................................................................ 12 1.2.3.4. Các chất điều hòa sinh trƣởng ........................................................ 13 1.2.3.5. Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trƣờng ................ 14 1.2.3.6. pH môi trƣờng .................................................................................. 15 1.2.4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ......15 1.2.4.1. Điều kiện vô trùng ............................................................................ 15 1.2.4.2.Môi trƣờng vật lý .............................................................................. 15 1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mài ở Việt Nam và thế giới. .....16 1.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mái ở Việt Nam. ............ 16 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 18 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................ 18 2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm .............................................................. 18 2.3.1. Thiết bị ................................................................................................. 18 2.3.2. Dụng cụ................................................................................................. 18 2.4. Môi trƣờng nuôi cấy............................................................................... 18 2.5. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 18 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 19 2.6.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm .......................................................... 19 2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................... 19 2.6.2.1. Tạo vật liệu khởi đầu ....................................................................... 19 2.6.2.2. Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất điều tiết sinh trƣởng đến khả năng tái sinh của chồi cây Củ mài. .......................... 20 2.6.2.3. Ra rễ tạo cây Củ mài in vitro hoàn chỉnh. ..................................... 21 2.6.2.4. Huấn luyện cây Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên........22 2.7. Phƣơng pháp thống kê. .......................................................................... 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 24 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ............................................................................. 24 3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây củ mài. ............................... 25 3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi ................................. 27 3.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi........... 28 3.3. Ảnh hƣởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Củ mài in vitro......29 3.4. Huấn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên. .. 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Củ mài ......... 28 Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài in tro ................................................................................................................ 29 Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của BAP kết hượp NAA đến khả năng nhân chồi Củ mài in tro .................................................................................. 29 Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Củ mài in vitro ............................................................................................................... 30 Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể tới sự thích nghi của cây Củ mài ................................................................................................................. 30 Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu đốt thân cây Củ mài................ 33 Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................................................. 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi của Củ mài nuôi cấy ................................................................................................................ 38 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng nhân chồi của củ mài sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................................................... 39 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Củ mài in vitro ......................................................................................................................... 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Củ mài ........................................................................... 11 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ......... ........................................................ 27 Hình 3.1: Vật liệu khởi đầu ............................................................. 34 Hình 3.2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Củ mài in vitro ................... 35 Hình 3.3: Rễ cây Củ mài in vitro ..................................................... 39 Hình 3.4: Rèn luyện cây con ngoài tự nhiên .................................... 41 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: α- Napthlacetic acid KI: Kinetin IBA: Indol 3- butyric acid IAA: - Indole - acetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige và Skoog Nxb: Nhà xuất bản MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây củ mài (Dioscorea persimilis Prain et Burkill), thuộc họ Củ nâu (Dioscoreaceae) là một trong những loài thực vật thân leo nằm trong danh mục nhóm lâm sản ngoài gỗ [9]. Ngoài ra trong dân gian cây củ mài còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: hoài sơn, sơn dược, khoai mài, mằn chèn, mán dịn, co mằn kép (tiếng dân tộc Thái), mằn ôn (tiếng dân tộc Nùng), hìa dòi (tiếng dân tộc Dao), gờ lờn (tiếng dân tộc K'dong).... Cây Củ mài là loài cây có rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, ngoài ra các lá non và thân non cây củ mài cũng được sử dụng như một loại rau rừng [18]. Do có vị ngọt và tính mát, mùi vị đặc trưng nên từ nhiều năm nay củ mài được chế biến thành những mặt hàng thực phẩm đặc sản (bánh củ mài, chè củ mài,...) tại một số vùng miền núi như Chùa Hương, Đền Hùng. Cây củ mài ngoài vai trò chính là nguồn cung cấp lương thực, trong dân gian còn được con người nghiên cứu và biết đến với vai trò là một vị thuốc nằm trong danh mục Dược điển Việt Nam [1]. Trong thực tế, nhân giống in vitro các loài thuộc chi Dioscorea đã được các tác giả tiến hành nghiên cứu cách đây khoảng 30 năm và sau đó tăng lên khá nhanh. Các tác giả sử dụng các bộ phận nuôi cấy khác nhau cho đối tượng nghiên cứu của họ. Kohmura và cs (1995) sử dụng là non làm mẫu nuôi cấy ở loài Dioscorea oppositaThumb [29]. Alizadeh và cs (1998) nghiên cứu về Dioscorea composite Hemsl [22]. Twyford và Mantell, (1996) sử dụng mẫu cấy là rễ ở loài Dioscorea alata [35]. Tor và cs (1998) dùng tế bào và protoplast trên loài Dioscorea Yams [34]. Nhiều tác giả như Matell và Hugo (1989), Jasik và Mantell (2000), Fotso và cs (2013), Borges và cs (2004) đã thực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Khoai Mỡ với mẫu là củ bi [25], [26], [27], [30]. Trong tự nhiên, Củ mài tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ. Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm 1 truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ [34].Hơn nữa, nhân giống theo phương pháp truyền thống không đảm bảo được cây sạch bệnh. Phương pháp nuôi cấy mô giúp sản xuất cây Củ mài với số lượng lớn có chất lượng cao (sạch bệnh). Điều quan trọng, phương pháp này là sản xuất ra cây giống ở quy mô công nghiệp trong thời gian ngắn, cây sạch bệnh và trồng được quanh năm. Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài(Dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”. 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn -Ý nghĩa khoa học: + Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình nhân giống cây củ mài bằng kỹ thuật in vitro. + Góp phần bảo tồn nguồn gen loại cây dược liệu, cây lương thực này. -Ý nghĩa thực tiễn: Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây củ mài bằng kỹ thuật in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với số lượng lớn, sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất, phục vụ nhu cầu lương thực, thực phẩm và dược liệu. 4. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro. - Tái sinh và nhân nhanh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây Củ mài. - Ra rễ, tạo cây in vitrohoàn chỉnh. - Huấn luyện cây Củ mài cấy mô thích nghi với điều kiện tự nhiên. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm và phân loại cây Củ mài 1.1.1. Phân loại thực vật cây Củ mài Theo hệ thống thực vật [19] cây Củ mài được phân loại như sau: Giới (regum) : Thực vật (Plantae) Ngành (Phylum) : Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class) : Hành (Liliospida) Phân lớp : Hành (Lilianae) Liên bộ: Hành (Liliales) Bộ (Ordo) : Củ nâu (Dioscoreales) Họ (family) : Củ nâu (Dioscoreaceae) Chi (genus) : Củ nâu (Dioscorea L.) Loài (species) : Dioscorea persimilis Hình 1.1: Cây Củ mài Chi Dioscorea được đặt theo tên bác sĩ Hy Lạp cổ đại và nhà thực vật học Dioscorides. Theo Ayensu ES. và cs (1972) chi này bao gồm hơn 600 loài, thuộc nhóm cây một lá mầm chủ yếu được trồng ở Nam Mỹ, Châu Á và Tây Phi [23]. Theo Jean M. và cs (1992) bộ Dioscoreales được xác định có niên đại khoảng 124 triệu năm trước [28]. Hầu hết các loài thuộc chi Dioscorea đều có nguồn gốc ở Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Đai Dương, xuất hiện cách ngày nay khoảng 10.000 năm (Khoai mỡ) và du nhập sang các vùng khác nhau trên thế giới, nhất là các quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [36]. Ở nước ta hiện nay có 4 loài phổ biến thuộc chi Dioscorea phân bố tập trung nhiều ở các vùng trung du, bán sơn địa và các vùng mới khai hoang: củ nâu(Dioscorea cirrhosa), khoai mỡ(Dioscorea alata), củ mài(hay hoài sơn: Dioscorea persimilis) và củ từ(Dioscorea esculenta). 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài Cây Củ mài thuộc loài cây thân thảo, leo quấn trên các giá thể khác nhau trong tự nhiên, cây sống nhiều năm, dài 5-10 m, cây có củ mọc sâu trong lòng đất từ 1,5 – 2 m. Cây thường mọc rải rác ven rừng, rừng tre nứa, khe núi đá, trên đất đồi, những địa điểm ẩm quanh năm, đất xốp và giàu chất dinh dưỡng. Cây củ mài (Dioscorea persimilis) thường có một củ chính to được hình thành từ rễ chính, củ dài hình chiếc dùi cui, mọc sâu vào trong đất độ sâu có thể từ 1-2 m. Trên rễ củ có rất nhiều rễ dinh dưỡng mọc dài có tác dụng hấp thụ nước và ion khoáng trong đất. Cây trồng một năm đã cho củ với năng suất trung bình đạt từ 1-1,2 kg/gốc [17]. Cây củ mài dạng thân leo (thân tự leo) dài trên 10 m, đường kính thân trung bình từ 0,2-0,5 cm thân quấn vào các giá thể khác theo chiều từ trái qua phải. Thân cây nhẵn, không có lông, màu nâu đỏ và có góc cạnh, trên thân không có tua. Chồi bên hình thành từ các nách lá hình thành lên các cành cấp 1 nhưng số lượng cành ít tập trung chủ yếu ở giữa thân. Thân cây chia đốt mỗi đốt thân dài khoảng 15-20 cm toàn thân cây có từ 50-100 đốt tùy mức độ sinh trưởng và phát triển của cây. Trên mỗi đốt thân có 4 lá. Do đặc điểm cấu tạo thân cây nhỏ, mềm dẻo nên cây Củ mài không tự đứng trong không gian mà phải leo lên các giá thể khác để lấy ánh sáng mặt khác khi leo lên cá giá thể khác sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát tán của hạt trong không gian [17]. Lá cây Củ mài là lá đơn, lá có dạng bản nhỏ, mọc so le hay mọc đối, hình tim đôi khi hình mũi tên, trên lá không lông, số lượng gân lá nhiều, gân lá có hình chân vit, dài khoảng 10-12 cm, rộng 6-8 cm, nhẵn, chóp lá nhọn [17]. Hoa nhỏ, đều, mọc thành bông, trục bông khúc khuỷu, hoa đơn tính. Hoa đực và hoa cái khác gốc, thích nghi với lối thụ phấn nhờ gió. Hoa đực có 6 nhị. Hoa cái mọc thành cụm dạng bông cong dài tới 20 cm. Cây ra hoa vào khoảng tháng 10 đến tháng 11 dương lịch hàng năm trước khi bước vào thời 4 kỳ tích lũy tinh bột. Cụm hoa đực dài không 40 cm, mang từ 20-40 hoa nhỏ, màu vàng [17]. Quả nang, quả có 3 cạnh rộng 2-3 cm, mang 6 hạt. Khi còn non quả có màu xanh, đến cuối tháng 12 quả chuyển sang màu vàng xanh. Đối với cây trồng 1 năm sẽ ra hoa và quả, quả được hình thành vào tháng 11 dương lịch hằng năm trước khi cây chuẩn bị bước vào thời kì ngủ nghỉ [17]. 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến Cây mọc hoang khắp nơi tại các vùng rừng núi nước ta, nhiều nhất ở các tỉnh Hà Bắc, Hoàng Liên Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Bình, đặc biệt là các vùng dọc dãy Trường Sơn và vùng núi đá vôi của tỉnh Quảng Bình, hiện nay đã được trồng phổ biến để chế biến thuốc. Mùa thu hoạch tốt nhất vào thu đông cho đến đầu xuân (từ tháng 10 đến tháng 4 năm sau). Chế biến: củ mài đào về cần chế biến ngay. 1.1.4. Đặc điểm của dƣợc liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế biến Hạt tinh bột Củ mài có hình trứng hay hình chuông, dài 10-60 m, rộng khoảng 15-50 m, có vân đồng tâm, rốn lệch tâm, hình chấm hay hình vạch. Tinh thể calci oxalat hình kim dài 35-50 m. Mảnh mô mềm gồm các tế bào màng mỏng, chứa tinh bột, mảnh mạch mạng. 1.1.5. Thành phần hóa học Thành phần chính của củ mài là tinh bột, chiếm 63,3%, ngoài ra còn có 0,5% chất béo và 6,8% protid. Theo phân tích của Viện Dược liệu Việt Nam (2011) [40] trong rễ củ của cây củ mài khô có chứa một số thành phần dinh dưỡng như: gluxit 63,25%, protit 6,75%, lipit 0,45%, chất nhầy 2,0 – 2,8%, dioscin sapotoxin, allantoin, dioscorin và các axit amin, mucin là một loại protein nhớt và một số chất khác như allantion, cholin, arginin, men maltose, saponin có nhân sterol. Viên đã có một số nghiên cứu tác dụng dược lý của củ mài trên cơ thể sống 5 (chuột) thông qua các chỉ tiêu như tăng thân trọng, tăng sự đồng hóa và tác dụng nội tiết hướng sinh dục…. Theo danh y Đỗ Tất Lợi (2004) [4] chất mucin trong củ mài hòa tan trong nước ở điều kiện axit và nhiệt độ thích hợp sẽ phân giải thành chất protid và hydrat carbon. Ở nhiệt độ 45 – 55 độ C, khả năng thủy phân chất đường của men trong củ mài rất cao, trong axit loãng trong 3 giờ có thể tiêu hóa 5 lần lượng đường có vai trò rất quan trọng trong việc chữa bệnh tiểu đường ở con người. 1.1.6. Công dụng Ngoài việc dùng để ăn chống đói, củ mài (hoài sơn) còn là vị thuốc. Củ mài với công năng kiện tỳ, chỉ tả, bổ phế khí, ích thận, cố tinh, giải độc, được dùng trong các trường hợp tỳ vị hư nhược, ăn uống kém tiêu, tiêu chảy hoặc trẻ em bị vàng da, bụng ỏng, mắt mũi nhoèn gỉ mà y học cổ truyền gọi là bệnh cam, có thể phối hợp với các vị thuốc kiện tỳ: bạch truật, hoàng kỳ, bạch biển đậu… hoặc trong trường hợp khí phế hư nhược, đoản hơi, mệt mỏi, ho khan, phối hợp với đảng sâm, cát cánh, bách bộ.. Còn dùng khi thận hư, mộng tinh, di tinh, tiểu tiện không cầm, phụ nữ bạch đới, phối hợp với ba kích, kim anh, khiếm thực…, đái tháo đường, phối hợp với mạch môn, thiên hoa phấn, sinh địa… Dùng ngoài, trị viêm tuyến vú gây đau đớn: củ mài tươi, rửa sạch, giã nát, đắp vào chỗ sưng đau, cách dùng vị hoài sơn là rất phong phú và đa dạng. Đề tài : Chế biến tinh bột củ mài hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường týp 2[38] do Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược Huế cùng cộng sự được thực hiện từ tháng 3- 2011 đến tháng 9- 2012 nhằm nghiên cứu về các đặc tính lý hóa, cấu trúc và thành phần của tinh bột củ mài. Theo Trần Hữu Dũng thông qua nghiên cứu lâm sàng trên 60 người tình nguyện bị đái tháo đường type 2 (được cho ăn các khẩu phần bánh chế biến từ nguyên liệu tinh bột củ mài theo một cách xác định), bước đầu đã chứng minh được rằng, khẩu phần bánh tạo ra có thể sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường một cách hiệu quả. 6 1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Cuối thế 19 đầu thế kỉ 20 nhà sinh vật học ngưới Đức Haberlandt (1902) đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [3]. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thựcvật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó. Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi, cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [20]. Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào. 1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể. Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái 7 sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Sự giãn tế bào: tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa thành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống [6]. Hình 1.2 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bàonằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [11]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. 8 1.2.1.3. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Cho đến nay các tác giả đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6]. 1.2.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống invitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Mẫu sau khi được vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp, tỷ lệsống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [7]. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc độ nhân nhanh cao [7]. 1.2.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng (auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác như là nước dừa, dịch chiết nấm men.. .vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp nhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú ý, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hóa [7]. 1.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, được coi là then chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi 9 trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như: nước dừa, dịch chiết nấm men,.. kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [ 7]. Tùy thuộc vào vào đối tượng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính. 1.2.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh Khi các chồi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta bổ sung các vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin là nhóm hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D thường sử dụng để tạo rễ cho chồi. 1.2.2.5. Giai đoạn đưa cây ra đất Đây là giai đoạn cuối cùng quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Trong giai đoạn này cây con được chuyển từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên, do đó cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp (nhiệt độ và độ ẩm) để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất. 1.2.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công của nuôi cấy mô thế bào thực vật. Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [21]. 10
- Xem thêm -