Tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn phân tích hoocmon clenbuterol trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khối phổ(gc ms)

§Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM ––––––––––––––––––––––––––––––– BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN PHÂN TÍCH HOOCMON CLENBUTEROL TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHỐI PHỔ (GC/MS” Chủ nhiệm Đề tài: PHẠM VĂN THÀNH 7313 23/4/2009 Hà Nội, 12-2008 1 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ PhÇn I: Tæng quan 1.1 C¬ së ph¸p lý cña ®Ò tµi : §Ò tµi thùc hiÖn theo Hîp ®ång nghiªn cøu khoa häc vµ ph¸t triÓn c«ng nghÖ sè 89.08.RD/H§-KHCN ký ngµy 28 th¸ng 01 n¨m 2008 gi÷a Bé C«ng Th−¬ng vµ ViÖn C«ng nghiÖp thùc phÈm.(Phô lôc kÌm theo). 1.2 TÝnh cÊp thiÕt vµ môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi.Clenbuterol thuéc nhãm β- agonist, cã c«ng thøc hãa häc C12H18Cl2N2O ®−îc sö dông réng r·i nh− lµ mét chÊt t¨ng träng, nã ®−îc bæ sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i (T¡CN) lîn, gµ, bß....nh»m kÝch thÝch sinh tr−ëng, t¨ng tû lÖ n¹c, nh»m gi¶m chi phÝ thøc ¨n. Tuy nhiªn, l−îng Clenbuterol tån d− trong vËt nu«i cã t¸c ®éng xÊu ®Õn søc khoÎ con ng−êi nh−: lµm rèi lo¹n nhÞp tim, run c¬, co th¾t phÕ qu¶n, phï nÒ, liÖt c¬, t¨ng huyÕt ¸p. C¸c n−íc Ch©u ©u tõ 1988 ®· cÊm ®−a Clenbuterol vµo thøc ¨n ch¨n nu«i, Mü cÊm n¨m 1991. ë ViÖt nam, tõ n¨m 2002 theo quyÕt ®Þnh sè 54/Q§-BNN cña Bé tr−ëng Bé NN& PTNT ký ngµy 20/06/2002 ®· cÊm s¶n xuÊt, nhËp khÈu, l−u th«ng vµ sö dông Clenbuterol trong s¶n xuÊt vµ kinh doanh thøc ¨n ch¨n nu«i. MÆc dï vËy, viÖc sö dông Clenbuterol trén vµo thøc ¨n ch¨n nu«i ch−a ph¶i ®· hÕt do nh÷ng mèi “lîi” tõ t¸c dông cña Clenbutarol ®em l¹i. Nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu cña ViÖn Khoa häc Kü thuËt N«ng nghiÖp miÒn Nam cho thÊy, trong 83 mÉu thøc ¨n hçn hîp vµ ®Ëm ®Æc cña 12 c«ng ty cã 9 mÉu d−¬ng tÝnh ( chiÐm 10,8%). KÕt qu¶ thö nhanh trªn 80 mÉu thÞt cã 05 mÉu d−¬ng tÝnh ( ChiÕm 6,25%). KÕt qu¶ cña Chi côc Thó y thµnh phè HCM còng cho thÊy, trong 334 mÉu kh¶ nghi cã tån d− Clenbuterol cao th× cã 52 mÉu d−¬ng tÝnh (chiÕm 15.57%). GÇn ®©y nhÊt, cuèi n¨m 2006, ®Çu n¨m 2007 Côc Ch¨n nu«i ®· cïng víi c¸c Së NN-PTNN cña 64 tØnh, thµnh phè tæ chøc lÊy mÉu T¡CN t¹i c¸c ®¹i 2 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------lý, c¸c trang tr¹i ch¨n nu«i vµ c¬ së s¶n xuÊt T¡CN ®Ó kiÓm tra; ®· nhËn ®ù¬c kÕt qu¶ 114 mÉu ph©n tÝch cã 19 mÉu d−¬ng tÝnh ( chiÕm 6,4%). Râ rµng, kiÓm so¸t hµm l−îng Clenbuterol trong thøc ¨n ch¨n nu«i vµ trong thùc phÈm lµ viÖc ph¶i lµm th−êng xuyªn. Nh»m gãp phÇn gi¶i quyÕt yªu cÇu cÊp thiÕt cña x· héi vµ c«ng t¸c kiÓm so¸t VSAT thùc phÈm , chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi : “Nghiªn cøu x©y dùng ph−¬ng ph¸p chuÈn ph©n tÝch hocmon Clenbuterol trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS) “. Môc tiªu cña ®Ò tµi lµ : X©y dùng qui tr×nh chuÈn ®Ó ph©n tÝch Clenbuterol trong c¸c mÉu thùc phÈm cã ®é chÝnh x¸c cao b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS). 1.3 §èi t−îng, ph¹m vi vµ néi dung nghiªn cøu. Tõ ®Æc tÝnh vµ môc ®Ých sö dông Clenbuterol, dÔ dµng nhËn thÊy c¸c s¶n phÈm thùc phÈm cã kh¶ n¨ng chøa d− l−îng Clenbuterol kh«ng thÓ nµo kh¸c lµ thÞt gia sóc vµ c¸c s¶n phÈm tõ thÞt. Tuy nhiªn nguån cung t¹o d− l−îng chÊt ®éc h¹i nµy l¹i xuÊt ph¸t tõ thøc ¨n ch¨n nu«i, v× vËy kiÓm so¸t tËn gèc ®Ó phßng ngõa vµ tr¸nh rñi ro lµ rÊt cÇn thiÕt. V× lý do ®ã, chóng t«i tiÕn hµnh x©y dùng qui tr×nh ph©n tÝch Clenbuterol b»ng s¾c ký khÝ khèi phæ cho hai ®èi t−îng lµ thøc ¨n ch¨n nu«i vµ thÞt ®éng vËt. Nh÷ng néi dung chÝnh cña ®Ò tµi nghiªn cøu bao gåm : a. Nghiªn cứu lựa chọn điều kiện t¸ch, làm sạch và làm giàu mẫu Clenbuterol t¸ch chiết từ mẫu. b. X¸c định điều kỉện ph©n tÝch Clenbuterol trªn m¸y GC/MS. c. X¸c định hiÖu suÊt thu håi mÉu, kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn cña ph−¬ng ph¸p d. ¸p dung ph−¬ng ph¸p ®· x©y dựng để kh¶o s¸t một số mẫu thịt và sản phẩm thực phẩm kh¸c trªn địa bàn Hà Nội; so s¸nh kÕt qu¶ kiÓm tra víi mét sè phßng thÝ nghiÖm kh¸c. 3 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------1.4 Tæng quan t×nh h×nh nghiªn cøu trong vµ ngoµi n−íc. 1.4.1 Nghiªn cøu øng dông ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS). Sù kÕt hîp gi÷a ph−¬ng ph¸p s¾c ký vµ ph−¬ng ph¸p khèi phæ (GC/MS) t¹o nªn mét ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch ®Æc biÖt cã hiÖu qu¶ trong lÜnh vùc ho¸ ph©n tÝch. Hai thiÕt bÞ nµy cã kh¶ n¨ng bæ sung vµ hç trî cho nhau trong qu¸ tr×nh ph©n tÝch (GC: t¸ch, MS: ph¸t hiÖn), v× vËy ph−¬ng ph¸p nµy ®−îc sö dông rÊt h÷u hiÖu cho qu¸ tr×nh kh¶o s¸t, ®Þnh l−îng c¸c chÊt [13]. Hai kü thuËt trªn ghÐp nèi víi nhau cã thÓ t¸ch vµ ®Þnh l−îng c¸c chÊt cã nång ®é 10-8 gram hoÆc nhá h¬n n÷a, ®©y lµ nång ®é rÊt khã ph¸t hiÖn ë c¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch c«ng cô. Ngoµi ra, víi sù kÕt nèi nµy, nh÷ng mÉu kh«ng bÒn trong thêi gian b¶o qu¶n còng cã thÓ ®−îc ph©n tÝch mét c¸ch thuËn lîi, ®Æc biÖt lµ viÖc ph©n tÝch c¸c hçn hîp phøc t¹p. Nhê ®ã, cã thÓ tiÕt kiÖm kh¸ nhiÒu thêi gian thùc nghiÖm v× ph©n lËp mÉu theo nguyªn t¾c ®iÒu chÕ tr−íc khi ®−a vµo khèi phæ do vËy gi¶m nhÑ yªu cÇu kü thuËt ®èi víi c¸c kü thuËt viªn. S¬ ®å hÖ s¾c ký khÝ khèi phæ cã thÓ m« t¶ tãm t¾t nh− sau: VÒ c¬ b¶n, thiÕt bÞ s¾c ký sö dông cét nhåi hoÆc cét mao qu¶n cã thÓ ghÐp nèi thiÕt bÞ khèi phæ lo¹i héi tô chïm tia ®¬n hoÆc kÐp [2], [17]. Cã nhiÒu gi¶i ph¸p kü thuËt kh¸c nhau ®Ó thùc hiÖn viÖc ghÐp nèi trong hÖ thèng. Víi thiÕt bÞ hiÖn ®¹i ngµy nay toµn bé dßng khÝ tho¸t ra (khÝ mang vµ mÉu) tõ cét 4 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------nhåi hoÆc cét mao qu¶n ®−îc chuyÓn th¼ng vµo bé phËn chiÕt khÝ mang trung gian, sau ®ã ®−îc ®−a trùc tiÕp vµo nguån ion ho¸ mÉu. ThiÕt bÞ chiÕt khÝ mang trung gian cã thÓ cã nh÷ng cÊu tróc kh¸c nhau, nh−ng khi lµm viÖc chóng ph¶i tu©n theo mét nguyªn lý chung lµ khuÕch t¸n qua hÖ thèng lç xèp hoÆc khÕch t¸n trong mét thiÕt bÞ t¸ch khuÕch t¸n ph©n tö. S¾c ký ®å ®−îc ghi l¹i tõ tÝn hiÖu cña dßng ion tæng céng. Nh÷ng s¾c ®å thu ®−îc tõ tÝn hiÖu dßng ion ho¸ vµ detector ion ho¸ ngän löa nãi chung t−¬ng tù nhau. S¾c ký khèi phæ ®· ®−îc sö dông réng r·i, ®Æc biÖt nã cã thÓ gióp ph¸t hiÖn c¸c cÊu tö trong hçn hîp phøc t¹p. NhiÒu c¶i tiÕn quan träng ®· ®−îc ¸p dông, ®Æc biÖt trong ph©n tÝch c¸c hîp chÊt sinh ho¸. Ngoµi ra c¸c ch−¬ng tr×nh xö lý sè liÖu khi ghÐp nèi víi m¸y tÝnh khiÕn qu¸ tr×nh ph©n tÝch trë nªn ®¬n gi¶n h¬n vµ cho phÐp thu ®−îc nh÷ng kÕt qu¶ ®¸ng tin cËy. Phæ khèi ®−îc sö dông nh− mét detector ®Æc biÖt, cã ®é nh¹y cao. Trong tr−êng hîp nµy, c¸c thiÕt bÞ sÏ cho c¸c gi¸ trÞ sè khèi kh¸c nhau vµ dßng ion ®¸p øng ®−îc tËp hîp vµ ghi l¹i d−íi d¹ng mét s¾c ®å (ph©n m¶nh khèi). Qu¸ tr×nh nµy cho phÐp x¸c ®Þnh ®−îc c¶ c¸c mÉu cã nång ®é rÊt nhá (tíi 10-10g). VÒ nguyªn t¾c ho¹t ®éng cña detector khèi phæ, khi cho mét chÊt ë tr¹ng th¸i khÝ va ch¹m víi mét dßng electron th× ph©n tö chÊt cã thÓ bÞ t¸ch ra mét hoÆc hai electron ®Ó trë thµnh c¸c ion d−¬ng mang ®iÖn tÝch 1 hoÆc 2; còng cã thÓ qu¸ tr×nh va ch¹m nµy lµm ph©n tö chÊt tiÕp nhËn thªm electron ®Ó trë thµnh ion ©m, gäi lµ ion ho¸ ph©n tö. Khi va ch¹m m¹nh h¬n th× ph©n tö cßn cã thÓ bÞ ph¸ vì ra thµnh nhiÒu phÇn kh¸c nhau mang ®iÖn tÝch d−¬ng hay ©m. Sù ph¸ vì nµy hoµn toµn phô thuéc vµo n¨ng l−îng va ch¹m, dÉn ®Õn c¸c c¸ch ph¸ vì ph©n tö kh¸c nhau. C¸c ion nµy sÏ ®−îc t¸ch vµ ®o khèi l−îng sau ®ã ghi trªn s¾c phæ ®å. VÒ kü thuËt ph©n tÝch khèi phæ ph¶i tu©n thñ c¸c b−íc gåm: 5 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------Ho¸ khÝ chÊt mÉu: mÉu ®−îc dÉn vµo b×nh chøa, ë ®ã ¸p suÊt cã thÓ gi¶m tíi 10-6 mmHg, sau ®ã dßng khÝ nµy ®−îc dÉn vµo buång ion ho¸ ®Ó s¶n ra c¸c ion, l−îng mÉu cã thÓ ghi nhËn ®−îc rÊt nhá 10-13 g/gi©y. Ion ho¸ mÉu, cã thÓ sö dông c¸c ph−¬ng ph¸p: - Ion ho¸ nhê c¸c tia hay c¸c phÇn tö mang n¨ng l−îng (electron, photon, h¹t nh©n). - Ion ho¸ nhê ®iÖn tr−êng m¹nh. - Ion ho¸ nhê sù phßng ®iÖn. - Ion ho¸ nhê sù phßng ®iÖn. - Ion ho¸ nhê sù ®èt nãng (nguån nhiÖt Lazer). - Ion ho¸ nhê t−¬ng t¸c ion (ion ho¸ häc). Trªn thùc tÕ hiÖn nay, ng−êi ta sö dông ph−¬ng ph¸p ion ho¸ qua sù va ch¹m electron. Ph−¬ng ph¸p va ch¹m electron lµ dßng khÝ ®−îc dÉn ®i qua mét dßng electron th¼ng gãc víi nã, tuú thuéc n¨ng l−îng cña dßng electron nµy lín hay nhá mµ c¸c ion ®−îc s¶n ra nhiÒu hay Ýt (nh×n chung n¨ng l−îng nµy kho¶ng 70ev). T¸ch c¸c ion theo khèi l−îng, vÒ nguyªn t¾c viÖc t¸ch nµy dùa trªn sù kh¸c nhau vÒ khèi l−îng cña ion h¬n lµ sù kh¸c nhau vÒ ®iÖn tÝch. Tr−íc tiªn ng−êi ta t¨ng tèc ®é cho c¸c ion, nhê cho qua mét ®iÖn tr−êng m¹nh, vËn tèc cña c¸c ion ®−îc tÝnh theo c«ng thøc : V = 2eU m Trong ®ã : 6 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ e : §iÖn tÝch ion. - U : ThÕ t¨ng tèc. - m : Khèi l−îng. - V : VËn tèc. Tèc ®é nµy ë trong m¸y ph©n tÝch ®¹t 100km/s. Sau khi t¨ng tèc, c¸c ion ®−îc bay qua mét tõ tr−êng, ®−êng bay cña chóng sÏ bÞ lÖch kh¸c nhau do t¸c dông cña tõ tr−êng víi b¸n kÝnh lÖch R ®−îc tÝnh theo c«ng thøc: m 2U R2 = ----- x-----e H2 Trong ®ã: - R : B¸n kÝnh lÖch. - m: Khèi l−îng ion. - e: §iÖn tÝch ion. - H: C−êng ®é tõ tr−êng. Mét −u ®iÓm cña sù kÕt hîp GC/MS lµ cã thÓ ®−îc ¸p dông mét c¸ch h÷u hiÖu cho viÖc nghiªn cøu vµ ph©n tÝch c¸c chÊt ®ång vÞ bÒn. Nhê nh÷ng −u ®iÓm ®ã mµ kü thuËt ph©n tÝch GC/MS ngµy cµng ®−îc øng dông réng r·i, cã thÓ kÓ ra mét sè øng dông ph©n tÝch sau: - Ph©n tÝch c¸c hîp chÊt chøa nhãm sunfua: ¸p dông trong viÖc kiÓm so¸t « nhiÔm m«i tr−êng ®Æc biÖt lµ « nhiÔm bÈn dÇu trong n−íc biÓn vµ « nhiÔm nguån cung cÊp thøc ¨n cho con ng−êi tõ c¸ biÓn. C¸c hîp chÊt chøa sunfua cã thÓ coi lµ th−íc ®o ®¸nh gi¸ sù « nhiÔm trong c¸ vµ c¸ håi. Trong c¸c nghiªn cøu ng−êi ta nhËn thÊy C3H17 - naphtalen ë gi¸ trÞ m/z 170 vµ C3H7 - banzothiophen ë gi¸ trÞ m/z 176, alkyl benothiophen C10H10S m/z 7 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------162 vµ alkyl naphtalen C12H12 m/z 160. Ng−êi ta còng ph¸t hiÖn ra 5 ®ång ph©n cña alkyl benzothiophen. - Ph©n tÝch c¸c hîp chÊt h÷u c¬ cã trong n−íc ngÇm: rÊt nhiÒu thùc nghiÖm ®É ®−îc tiÕn hµnh ®Ó ph©n tÝch l−îng vÕt cña c¸c hîp chÊt h÷u c¬ tån t¹i trong n−íc. Kh¶ n¨ng øng dông cña ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ - khèi phæ ®èi víi viÖc ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l−îng c¸c hîp chÊt h÷u c¬ ®éc h¹i trong c¸c mÉu n−íc th¶i sinh ho¹t, n−íc th¶i c«ng nghiÖp ngµy cµng nhiÒu. Tuy nhiªn viÖc ph©n tÝch c¸c hîp chÊt h÷u c¬ chøa trong n−íc t−¬ng ®èi khã kh¨n bëi chóng thay ®æi rÊt nhanh vµ ë nång ®é rÊt nhá. V× lý do ®ã ®Çu tiªn ng−êi ta ph¶i sö dông khèi phæ ký ®Ó c¾t nhá c¸c cÊu tö, sau ®ã tõ s¾c ký khèi phæ ®å nµy kÕt hîp víi c¸c ion m¶nh ®−îc thÓ hiÖn trªn c¸c pic, cïng sè liÖu thêi gian l−u cña cét ®Ó x¸c ®Þnh thµnh phÇn vµ nång ®é cña chóng. - Ph©n tÝch c¸c cÊu tö polyclorua: trong ph©n tÝch naphtalen clorua b»ng s¾c ký khÝ – khèi phæ, ng−êi ta sö dông ph−¬ng ph¸p so s¸nh c−êng ®é pic (intensity matching method). Trong ph−¬ng ph¸p nµy, c¸c ®ång ph©n tù nhiªn cña c¸c thµnh phÇn chøa c¸c nguyªn tö clo hoÆc brom trong ph©n tö còng cã thÓ ®−îc x¸c ®Þnh ®Ó kh¼ng ®Þnh sù cã mÆt cña hîp chÊt polyclorua - Ph©n tÝch nitrosamin: nitrosamin lµ mét trong nh÷ng chÊt g©y ung th−, sù tån t¹i cña nã trong m«i tr−êng rÊt nguy hiÓm ®èi víi ®êi sèng con ng−êi. Møc ®é ®éc h¹i cña nitrosamin rÊt cao, v× vËy nã thu hót ®−îc sù chó ý cña rÊt nhiÒu nhµ khoa häc. Cã thÓ sö dông nhiÒu ph−¬ng ph¸p ®Ó x¸c ®Þnh nitrosamin nh− GC, LC...Tuy nhiªn ®èi víi chÊt nµy th× GC/MS vÉn lµ ph−¬ng ph¸p kh«ng thÓ thiÕu v× sö dông GC/MS ta cã thÓ x¸c ®Þnh ®−îc cÊu tróc ho¸ cña c¸c thµnh phÇn N- nitroso, ®©y lµ −u ®iÓm lín cña ph−¬ng ph¸p. 8 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ Ngoµi c¸c nghiªn cøu, øng dông trªn, hiÖn nay ph−¬ng ph¸p GC/MS cßn ®−îc sö dông rÊt nhiÒu trong ph©n tÝch d− l−îng c¸c chÊt b¶o vÖ thùc vËt, c¸c chÊt kÝch thÝch, c¸c ho¸ chÊt ®éc dÔ bay h¬i... ë trong n−íc, viÖc tiÕp cËn víi c¸c kü thuËt ph©n tÝch míi, ®Æc biÖt lµ kü thuËt s¾c ký kh¸ phæ biÕn tõ kho¶ng nh÷ng n¨m 90, ®©y lµ thêi kú mét sè phßng thÝ nghiÖm cña c¸c tr−êng ®¹i häc, c¸c ViÖn nghiªn cøu ®−îc trang bÞ c¸c hÖ thèng s¾c ký hiÖn ®¹i. Víi s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS) tuy ch−a nhiÒu nh−ng b¾t ®Çu cã c¸c nghiªn cøu øng dông cña c¸c tr−êng ®¹i häc nh− §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn víi nghiªn cøu: “ Ph©n tÝch c¸c hîp chÊt h÷u c¬ dÔ bay h¬i trong n−íc b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ, dïng kü thuËt lÊy mÉu bay h¬i”; “ Nghiªn cøu x¸c ®Þnh PANs trong khÝ th¶i nhµ m¸y giÊy B·i B»ng”, cña t¸c gi¶ Ph¹m Hïng ViÖt vµ céng sù; “Nghiªn cøu x¸c ®Þnh Chloramphenicol trong mÉu sinh häc b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ – khèi phæ”, cña t¸c gi¶ Vò C«ng S¸u... tuy nhiªn ch−a cã c«ng bè trong n−íc nµo vÒ nghiªn cøu øng dông GC/MS ®Ó x¸c ®Þnh Clenbuterol trong thùc phÈm. 1.4.2 Nghiªn cøu x¸c ®Þnh Clenbuterol. Clenbuterol, 4-amino – alpha- tert-butylaminomethyl – 3,5 – dichlorobenzyl alcohol, lµ mét beta- agonist cã c«ng thøc hãa häc C12H18Cl2N2O; ph©n tö l−îng 277,18 trong ®ã C: 52,00%, H: 6,54%, Cl: 25,58%, N: 10,11%, O: 5,77%. OH Cl H N H2N Cl ë ViÖt Nam, hiÖn nay ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh Clenbuterol chñ yÕu dùa vµo ph−¬ng ph¸p Eliza, nh−ng ph−¬ng ph¸p nµy cho ®é tin cËy ch−a cao nªn kÕt 9 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------qu¶ kiÓm nghiÖm ®ang cßn g©y nhiÒu tranh c·i. §Ó x¸c ®Þnh hµm l−îng Clenbuterol trong c¸c mÉu T¡CN Bé NN&PTNN ®· ph¶i göi mÉu thö sang Singapore ®Ó kiÓm tra. ViÖc lµm nµy ®· g©y mÊt nhiÒu chi phÝ vÒ tiÒn cña vµ thêi gian. HiÖn nay, trªn thÕ giíi c¸c ph−¬ng ph¸p dïng ph¸t hiÖn Clenbuterol gåm: ph−¬ng ph¸p Eliza, S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC), S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao khèi phæ (LC/MS), S¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS )... trong c¸c ph−¬ng ph¸p nªu trªn, ph−¬ng ph¸p Eliza cã −u ®iÓm ph¸t hiÖn nhanh, mang tÝnh sµng läc c¸c mÉu thö nh−ng cã ®é tin cËy vµ ®é chÝnh x¸c kh«ng cao. §Ó ®Þnh l−îng chÝnh x¸c hµm l−îng Clebuterol, ng−êi ta th−êng sö dông ph−¬ng ph¸p HPLC/MS hoÆc GC/MS. Tuy nhiªn ph−¬ng ph¸p HPLC/MS cã ®é nhËy thÊp h¬n, chi phÝ ®¾t h¬n so víi ph−¬ng ph¸p GC/MS; v× vËy xu h−íng x¸c ®Þnh d− l−îng Clenbuterol b»ng ph−¬ng ph¸p GC/MS ngµy cµng ®−îc quan t©m ë nhiÒu n−íc. Theo c¸c t¹p chÝ ph©n tÝch chuyªn ngµnh, nh÷ng ph−¬ng ph¸p ph¸t hÞªn Clenbuterol vµ beta- agonists kh¸c trong c¸c mÉu sinh häc ®· ®−îc c«ng bè trªn thÕ giíi cã thÓ thÊy: nh÷ng ph−¬ng ph¸p nµy ph¸t hiÖn ë nhiÒu møc ®é kh¸c nhau, tõ ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch enzyme (EIA- enzyme immunoassays), s¾c ký b¶n máng (TLC- thin layer chromatography) tíi s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC- high performance liquid chromatography) vµ s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS – gas chromatography- mass spectrometry) [9]. (Girault and Fourtillan, 1990; Blanchflower et. al., 1993; Wilson et. al., 1994; Kingston et al., 1995; Batjoens et al., 1996; Gigosos et al, 1996; Abou- Basha and AboulEnen, 1996; Sangiorgi and Curatolo, 1997). Do cã sù trïng hîp vÒ c¸c ph¶n øng cña beta- agonists vµ mét sè steroit, c¸c ph−¬ng ph¸p EIA vµ RIA (radio immunoassay) kh«ng x¸c ®Þnh ®Çy ®ñ, chÝnh x¸c sù hiÖn diÖn cña c¸c betaagonists trong c¸c mÉu sinh häc; do ®ã cÇn thiÕt ph¶i sö dông ph−¬ng ph¸p cã tÝnh ®Æc hiÖu cao. HPLC vµ GC ®¸p øng ®−îc ®iÒu nµy nh−ng l¹i kh«ng x¸c 10 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------®Þnh ®−îc cÊu tróc vµ c¸c th«ng tin ®Çy ®ñ ®Ó kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n Clenbuterol. Kh¾c phôc thiÕu sãt nµy, mét kü thuËt cã ®é nh¹y, sù chän läc, ph¸t hiÖn cao cã thÓ kh¼ng ®Þnh kÕt qu¶ ®ã lµ ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS- gas chromatography- mass spectrometry). ViÖc nghiªn cøu øng dông ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ (GC/MS) ®Ó ph©n tÝch vµ ®Þnh l−îng Clenbuterol ®· ®−îc nhiÒu nhµ khoa häc trªn thÕ giíi quan t©m ngay tõ kho¶ng nh÷ng n¨m 1993 – 1996 (Blanchflower et al., 1993; Garcia- Regueiro et. al., 1993; Kingston et. al., 1995; Batijoens et. al., 1996). Ngoµi ra còng ®· cã nh÷ng c«ng bè vÒ nghiªn cøu øng dông GC-MS-MS ®Ó x¸c ®Þnh Clenbuterol nh−ng ch−a nhiÒu. Mét h−íng kh¸c lµ øng dông s¾c ký láng cao ¸p (HPLC) ®Ó x¸c ®Þnh Clenbuterol còng ®· ®−îc quan t©m. T¸c gi¶ E. Ciranni Signoretti, C. D’Arpino vµ F. Latorre ®· nghiªn cøu ph¸t hiÖn Clen buterol trong n−íc ngät (Journal of Chromatography, 473; 301-304) [5]. ë Trung quèc, Ýt khi cã viÖc vi ph¹m ph¸p luËt khi sö dông Clenbuterol vµo thøc ¨n ch¨n nu«i v× th−êng ®−îc thay thÕ b»ng Ractopamine. Tuy nhiªn viÖc kiÓm so¸t ®ång thêi c¶ Ractopamine vµ Clenbuterol trong thøc ¨n ch¨n nu«i ®−îc c¸c c¬ quan chøc n¨ng cña ChÝnh phñ qu¶n lý nghiªm ngÆt. ViÖc ph¸t hiÖn Clenbuterol vµ Ractopamine hy®rochlorie trong thøc ¨n ch¨n nu«i vµ thÞt ®éng vËt ®−îc sö dông ph−¬ng ph¸p HPLC víi detector ®iÖn ho¸ (Turberg et. al., 1994), kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn lµ 1mg/kg. N¨m 2005, Zhang vµ céng sù ®· ph¸t triÓn ph−¬ng ph¸p, sö dông detector huúnh quang ®Ó ph¸t hiÖn Ractopamine trong thøc ¨n ch¨n nu«i. Víi nghiªn cøu nµy t¸c gi¶ ®· ®−a giíi h¹n ph¸t hiÖn lªn 0,5 mg/kg. Khi sö dông kü thuËt LC-UV ®Ó ph¸t hiÖn Clenbuterol, Chang cã thÓ t×m ra Clenbuterol ë giíi h¹n 0,05 mg/kg. Ngoµi c¸c nghiªn cøu trªn, mét vµ t¸c gi¶ trªn thÕ giíi cßn sö dông ph−¬ng ph¸p S¾c ký khÝ – quang phæ hång ngo¹i chuyÓn ho¸ fourier ®Ó kh¼ng ®Þnh sù 11 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------cã mÆt cña c¸c beta- agonists trong mÉu (T.Visser, M J Vredenbreg and A.PJM Jong), c¸c c«ng bè nµy cho thÊy khi sö dông kü thuËt nµy kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn c¸c beta – agonists kh¸ cao [22]. Ngoµi c¸c nghiªn cøu lùa chän c¸c ph−¬ng ph¸p ®Ó ph¸t hiÖn Clenbuterol nãi riªng, c¸c beta- agonists nãi chung, c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi (Milagro Reig, Natalia Batlle, Jose Luis navarro, Fidel Toldra) còng rÊt quan t©m ®Õn c¸c nghiªn cøu lµm æn ®Þnh chóng trong qu¸ tr×nh ph©n tÝch [16]. ChiÕt t¸ch, xö lý vµ lµm s¹ch mÉu lu«n lµ vÊn ®Ò quan t©m ®èi víi c¸c nhµ ph©n tÝch. Trong nghiªn cøu x¸c ®Þnh d− l−îng Clenbuterol, mét sè t¸c gi¶ ®· ®Ò cËp ®Õn xö lý mÉu n−íc tiÓu b»ng chiÕt pha r¾n (SPE) ( Christin Berggren, Sami Bayoudh, David Sherington, Kees Ensing – Department of Analytical Chemistry and Toxicology, University Centre for Pharmacy, Antonius Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen, Netherlands; Department of Pure and Applied Chemistry, University of Strathclyde), hay trong c¸c mÉu thøc ¨n gia sóc vµ chÕ phÈm sinh häc (Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara Rizzo, Vittorio Crescenzi, Giancarlo Masci- laboratorio Medicina Veterinaria, Viale Regina Elena 299, 1-00161 Rome, Italy; Department of Chemistry, University of Rome, Italy). C¸c nghiªn cøu nµy ®Òu cho thÊy khi sö dông kü thuËt chiÕt pha r¾n (SPE), c¸c mÉu ph©n tÝch ®−îc lµm s¹ch vµ lµm giÇu lªn rÊt nhiÒu [4]. 1.5 C¸c ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh Clenbuterol: HiÖn nay c¸c ph−¬ng ph¸p c¬ b¶n ®−îc sö dông ®Ó x¸c ®Þnh d− l−îng Clenbuterol gåm cã: ph−¬ng ph¸p EIA, ph−¬ng ph¸p HPLC, ph−¬ng ph¸p GC, ( më réng cã ph−¬ng ph¸p LC – MS, vµ ph−¬ng ph¸p GC- MS) [8] [9] [18] [24]. - Ph−¬ng ph¸p EIA hay ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) lµ ph−¬ng ph¸p thö nghiÖm miÔn dÞch, g¾n enzyme theo ph−¬ng ph¸p c¹nh tranh trùc tiÕp. Dung dÞch chiÕt xuÊt tõ mÉu ®−îc trén víi conjugate (kÕt 12 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------g¾n). Hçn hîp ®−îc chuyÓn vµo c¸c giÕng phñ kh¸ng thÓ, t¹i ®ã chÊt cÇn ph©n tÝch vµ conjugate c¹nh tranh nhau ®Ó g¾n kÕt víi kh¸ng thÓ. Ph−¬ng ph¸p nµy sö dông kit thö ®−îc chÕ t¹o s½n, −u ®iÓm lµ ®¬n gi¶n, dÔ thao t¸c, cho kÕt qu¶ nhanh (chØ trong vßng 1 giê); tuy nhiªn ®é chÝnh x¸c kh«ng thËt cao, ®Ó kh¼ng ®Þnh kÕt qu¶ vÉn ph¶i sö dông kÕt hîp víi ph−¬ng ph¸p kh¸c. - Ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC), vÒ nguyªn t¾c, kü thuËt t¸ch b»ng HPLC gièng víi s¾c ký cét truyÒn thèng, tuy nhiªn HPLC dïng b¬m cao ¸p, cét nhåi nhá; c¸c cÊu tö ph¸t hiÖn b»ng c¸c detector cã ®é nhËy cao. øng dông ph−¬ng ph¸p nµy, cã thÓ sö dông detector UV hoÆc detector ®iÖn ho¸, khèi phæ (LC-MS) ®Ó ph¸t hiÖn Clenbuterol; c¸c cét t¸ch cã thÓ lµ C8 hoÆc C18 víi kÝch th−íc: 250 x 4,5mm, 5um hoÆc 150 x 3,9 mm, 5um; 150 x 2,1mm, 5um; 150 x 2,1mm, 3um; 50 x 2,1mm, 1,7um. - Ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ (GC): Ph−¬ng ph¸p nµy liªn quan ®Õn sù t−¬ng t¸c gi÷a pha h¬i vµ pha láng nªn khã ph¸t hiÖn c¸c chÊt kh«ng bay h¬i. Cã hai lo¹i s¾c ký khÝ lµ s¾c ký khÝ – láng (pha tÜnh lµ chÊt láng) vµ s¾c ký khÝ r¾n (pha tÜnh lµ chÊt r¾n). MÉu ®−îc b¬m vµo buång b¬m mÉu cã nhiÖt ®é cao ®ñ ®Ó mÉu cã thÓ ho¸ h¬i, khÝ mang sÏ kÐo c¸c cÊu tö ph©n tÝch qua cét. T¹i ®©y sÏ cã sù t−¬ng t¸c víi pha tÜnh dÉn ®Õn thêi gian l−u cña c¸c cÊu tö sÏ kh¸c nhau. C¸c cÊu tö sÏ lÇn l−ît ra khái cét vµ ®i vµo detector. Detector sÏ cho tÝn hiÖu khi cã mÆt mét chÊt hoÆc mét nhãm chøc nµo ®ã. TÝn hiÖu cña detector sÏ lµm biÕn ®æi tÝn hiÖu ®iÖn tû lÖ víi l−îng cÊu tö. TÝn hiÖu ®−îc khuyÕch ®¹i vµ ghi l¹i thµnh s¾c ký ®å. ViÖc ph¸t hiÖn ®−îc sö dông nhiÒu víi viÖc kÕt hîp quang phæ hång ngo¹i (gas chromatography – fourier transform infrared spectrometry), hay khèi phæ (MS) [22]. 13 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ PhÇn II : Thùc nghiÖm 2.1 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. 2.1.1 Kü thuËt chuÈn bÞ mÉu ph©n tÝch. 1.Nguyªn t¾c chung Tuú ®èi t−îng ph©n tÝch, môc ®Ých ph©n tÝch, ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch mµ qui tr×nh ph©n tÝch cã c¸c b−íc cô thÓ kh¸c nhau. Tuy nhiªn, nh×n chung c¸c b−íc c¬ b¶n cña qu¸ tr×nh ph©n tÝch mét mÉu bao gåm c¸c b−íc sau: NghiÒn nhá mÉu §ång ho¸ ChiÕt t¸ch Lµm s¹ch Lµm giÇu mÉu Ph©n tÝch. 2. Xö lý vµ chiÕt t¸ch mÉu: + S¶n phÈm tõ ®éng vËt: (CÇn ph¸ vì c¸c biÓu b× ®éng vËt) - Thuû ph©n b»ng enzim - NghiÒn nhá, ®ång ho¸ 14 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ ChiÕt b»ng dung m«i - Sö dông c¸c chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt. + S¶n phÈm dÇu lipit ( b¬, phomat, dÇu bÐo...) CÇn ph¸ vì mµng polypeptit trong chÊt bÐo vµ dÇu mì - Dïng dung m«i ph©n cùc. - Dung dÞch axit, kiÒm, chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt. + S¶n phÈm rau qu¶: CÇn ph¸ vì tÕ bµo thùc vËt b»ng nghiÒn, ®ång ho¸ sau ®ã chiÕt b»ng dung m«i thÝch hîp 3.Lµm s¹ch, lµm giÇu mÉu - Lo¹i bá c¸c t¹p chÊt g©y nhiÔu. - N©ng cao ®é tinh khiÕt, ®é ®Ëm ®Æc cña chÊt cÇn ph©n tÝch. - §¶m b¶o an toµn cho cét ph©n tÝch ( HPLC,GC) 4. C¸c ph−¬ng ph¸p chiÕt t¸ch mÉu ChiÕt láng- láng: Nguyªn t¾c: dùa trªn c¬ së sù hoµ tan ( hoÆc ph©n bè ) kh¸c nhau cña chÊt trong hai dung m«i kh«ng trén lÉn vµo nhau. VÝ dô: ChÊt X khi chiÕt ®−îc ph©n bè vµo hai dung m«i A, B kh«ng trén lÉn vµo nhau, hÖ sè ph©n bè K pb ®−îc x¸c ®Þnh: Kpb = Cx ( A )/ Cx ( B ) Trong ®ã: Cx ( A ) lµ nång ®é chÊt X trong A Cx ( B ) lµ nång ®é chÊt X trong B NÕu K > 99/1 th× coi nh− chÊt X ®· chuyÓn hÕt vµo A C¸c ®iÒu kiÖn ®Ó chiÕt: 15 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ Dung m«i chiÕt ph¶i cã ®é tinh khiÕt cao. - Dung m«i hoµ tan tèt chÊt chiÕt nh−ng kh«ng tèt víi c¸c chÊt kh¸c trong mÉu. - HÖ sè ph©n bè lín. - C©n b»ng chiÕt ®¹t nhanh - Sù ph©n líp khi chiÕt ph¶i râ rµng. ChiÕt láng - r¾n: - Dïng t¸ch c¸c chÊt ph©n tÝch ra khái mÉu r¾n b»ng dung m«i thÝch hîp. - ChÊt ph©n tÝch th−êng n»m ë thµnh nang nhá hoÆc ph©n t¸n trong mÉu. - Dung m«i chiÕt ph¶i lùa chon phï hîp. Vi chiÕt pha r¾n Dùa trªn sù c©n b»ng hÊp phô cña chÊt ph©n tÝch trªn bÒ mÆt mét sîi nhá ®Æc biÖt phñ pha tÜnh. C¸c pha tÜnh cã thÓ ®−îc pha trén víi c¸c chÊt h¸p phô sau ®ã cho nhóng vµo dung dÞch hoÆc kh«ng gian h¬i ®Ó hÊp l−u c¸c chÊt cÇn ph©n tÝch. ¦u ®iÓm: - §¬n gi¶n. - L−îng mÉu Ýt. - TiÕt kiÖm thêi gian. - Kh«ng dung m«i Vi chiÕt pha láng 16 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------Dùa trªn sù c©n b»ng ph©n bè cña chÊt ph©n tÝch trong m«i tr−êng vµ giät dung m«i chiÕt. Cã hai ph−¬ng ph¸p: - Vi chiÕt pha láng tÜnh. - Vi chiÕt pha láng ®éng. ChiÕt pha r¾n - ChiÕt pha r¾n lµ kü thuËt chuÈn bÞ mÉu nh»m lµm s¹ch vµ lµm giµu mÉu tr−íc khi ph©n tÝch. - TiÖn Ých: Tèn Ýt dung m«i, tiÕt kiÖm thêi gian, lo¹i c¸c chÊt g©y nhiÔu tèt h¬n, cho ®é thu håi chÊt ph©n tÝch cao vµ s¹ch. Ng−êi ta chia ra: + D¹ng hÊp phô: ë d¹ng nµy kh«ng cã sù liªn kÕt pha nh−ng dùa vµo c¸c nhãm chøc n¨ng cã mÆt trong chÊt nhåi cét. §iÓn h×nh cña d¹ng nµy lµ dïng pha th−êng. + D¹ng ph©n bè cã liªn kÕt pha: T−¬ng t¸c ë ®©y cã sù hÊp phô bÒ mÆt cïng víi liªn kÕt céng kÕt cña c¸c nhãm chøc n¨ng ho¸ häc ( ®©y lµ t−¬ng t¸c chÝnh). Cã thÓ chia ra: - Pha th−êng: Pha tÜnh ph©n cùc, cho phÐp c¸c chÊt t¹p nhiÔm kh«ng ph©n cùc ®i qua vµ gi÷ l¹i c¸c cÊu tö cÇn ph©n tÝch ph©n cùc Dïng t¸ch c¸c chÊt tõ dung m«i kh«ng ph©n cùc lªn bÒ mÆt chÊt ph©n cùc. ( Silica pha th−êng, Florisil pha th−êng... ) - Pha ng−îc: Pha tÜnh kh«ng ph©n cùc, sÏ gi÷ l¹i chÊt ph©n tÝch kh«ng ph©n cùc, cho phÐp chÊt ph©n cùc ®i qua. 17 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------Dïng t¸ch c¸c chÊt ph©n tÝch khái mét pha ®éng ph©n cùc vµo mét chÊt kh«ng ph©n cùc ( chÊt hÊp phô ). ( C8- C18 ) - CÆp ®«i ion: Pha tÜnh kh«ng ph©n cùc, viÖc l−u gi÷ vµ röa gi¶i c¸c chÊt gÇn theo kiÓu c¬ chÕ pha ng−îc. - Trao ®æi ion: Trªn bÒ mÆt chÊt hÊp phô cã chøa nhãm ion chøc n¨ng. Cã thÓ dïng chóng nh− kiÓu pha th−êng hoÆc pha ng−îc, c¸c chÊt ph©n tÝch trao ®æi ion víi chÊt nhåi cét vµ ®−îc t¸ch gi÷ trªn cét. Lùa chän kÝch cì vµ khèi l−îng chÊt nhåi cét: ViÖc lùa chän nµy ¶nh h−ëng trùc tiÕp ®Õn viÖc t¸ch, lµm s¹ch vµ hiÖu suÊt thu håi mÉu. Kh¶ n¨ng thu håi mÉu kÐm th−êng xÈy ra khi kÝch th−íc vµ khèi l−îng chÊt nhåi trong èng kh«ng thÝch hîp. Sù qu¸ lín cña líp chÊt nhåi sÏ dÉn ®Õn sù röa gi¶i kh«ng hoµn toµn, ng−îc l¹i líp chÊt nhåi qu¸ nhá sÏ khiÕn cho viÖc l−u gi÷ mÉu kh«ng tèt. Tr−êng hîp ch−a biÕt ch¾c ch¾n cã thÓ ¸p dông ph−¬ng ph¸p lùa chän tèi −u: b¾t ®Çu b»ng mét l−îng chÊt nhåi trung b×nh ( 200mg hoÆc 500 mg). NÕu quan s¸t thÊy kh¶ n¨ng l−u gi÷ mÉu hoµn toµn th× cã thÓ giam bít l−îng chÊt nhåi vµ dung dÞch röa gi¶i. Ng−îc l¹i, nÕu qu¸ tr×nh l−u mÉu kh«ng hoµn toµn th× ph¶i t¨ng l−îng chÊt nhåi vµ dung dÞch röa gi¶i. 2.1.2 X¸c ®Þnh kh¶ n¨ng thu håi mÉu, LOD vµ LOQ. Nghiªn cøu kh¶ n¨ng thu håi mÉu b»ng c¸ch bæ sung mét l−îng mÉu chuÈn biÕt tr−íc vµo mÉu sau ®ã tiÕn hµnh c¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch ®· lùa chän ®Ó ®¸nh gi¸ • X¸c ®Þnh hiÖu suÊt thu håi 18 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ R(%) = m1 − m2 x100 m0 Trong ®ã : m1 : l−îng chÊt x¸c ®Þnh ®−îc trong mÉu tù t¹o (µg). m2 : L−îng chÊt x¸c ®Þnh ®−îc trong mÉu tr¾ng (µg). m0 : L−îng chÊt chuÈn trong hçn hîp dïng ®Ó cho vµo mÉu tù t¹o (µg) . R : §é thu håi (%). • X¸c ®Þnh giíi h¹n ph¸t hiÖn (LOD) vµ giíi h¹n x¸c ®Þnh (LOD). Giíi h¹n ph¸t hiÖn LOD (Limit of detection) lµ l−îng nhá nhÊt cña chÊt ph©n tÝch cã thÓ ph¸t hiÖn ®−îc ®¶m b¶o sù kh¸c biÖt víi mÉu tr¾ng tíi 95%; th«ng th−êng lÊy gÊp 3 lÇn ®é lÖch chuÈn cña tÝn hiÖu nhiÔu. Gi¸ trÞ LOD ®−îc tÝnh : LOD = 3 (N/S)xC Trong ®ã : N : §é nhiÔu trung b×nh ®−êng nÒn S : ChiÒu cao pic cña chÊt cÇn ph©n tÝch C: Nång ®é chÊt Giíi h¹n x¸c ®Þnh LOQ (Limit of quantification) lµ l−îng ná nhÊt cña chÊt cÇn ph©n tÝch cã trong mÉu thö cã thÓ ®Þnh l−îng ®−îc trong ®iÒu kiÖn tiÕn hµnh phÐp thö. Th«ng th−êng LOQ ®−îc lÊy tõ 3 ®Õn 5 lÇn LOD. 2.1.3. T¹o sù æn ®Þnh, phï hîp cho chÊt ph©n tÝch §Ó ®¶m b¶o tÝnh æn ®Þnh vµ phï hîp cho ®iÒu kiÖn ph©n tÝch, chÊt cÇn ph©n tÝch sÏ ®−îc chuyÓn ®æi nhê t¹o dÉn xuÊt. Nguyªn t¾c chung, ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ lµm viÖc dùa vµo viÖc mÉu ph¶i ®−îc chuyÓn thµnh d¹ng h¬i trong ®iÒu kiÖn thùc nghiÖm. Mét sè chÊt ë d¹ng b×nh th−êng cã thÓ kh«ng 19 §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -----------------------------------------------------------------------------------------------ph©n tÝch ®−îc b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ.Tuy nhiªn, c¸c hîp chÊt nµy cã thÓ sö dông ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ ®Ó ph©n tÝch nÕu chóng ®−îc chuyÓn ho¸ thµnh c¸c dÉn xuÊt t−¬ng øng dÔ bay h¬i. DÉn xuÊt ho¸, ngoµi viÖc lµm t¨ng kh¶ n¨ng bay h¬i cña c¸c cÊu tö cÇn ph©n tÝch, cßn lµm chuyÓn ho¸ nh÷ng nhãm ph©n cùc cña c¸c cÊu tö thµnh nh÷ng nhãm kh«ng ph©n cùc t−¬ng øng, nh− vËy h¹n chÕ kh¶ n¨ng hÊp phô m¹nh trong qu¸ tr×nh s¾c ký do t−¬ng t¸c cña c¸c nhãm ph©n cùc g©y ra. 2.1.4 Ph−¬ng ph¸p ngo¹i chuÈn. Ph−¬ng ph¸p nµy tiÕn hµnh b»ng c¸ch lËp ®−êng chuÈn víi c¸c nång ®é mÉu kh¸c nhau vµ diÖn tÝch pic t−¬ng øng cña c¸c nång ®é cÊu tö cÇn x¸c ®Þnh. 2.1.5 Ph−¬ng ph¸p néi chuÈn. Ng−êi ta thªm vµo mÉu mét l−îng x¸c ®Þnh cña chÊt ®−îc chän lµm néi chuÈn. ChÊt néi chuÈn cã thÓ lµ chÊt l¹, còng cã thÓ lµ mét cÊu tö nµo ®ã cã s½n trªn s¾c ®å. NÕu lµ chÊt l¹ th× thêi gian l−u cña nã ph¶i g¾n víi thêi gian l−u cña cÊu tö cÇn ph©n tÝch. 2.1.6 Ph−¬ng ph¸p tù néi chuÈn. Ph−¬ng ph¸p tù néi chuÈn lµ ph−¬ng ph¸p sö dông chÝnh cÊu tö cÇn ph©n tÝch bæ sung thªm vµo mÉu. Sau ®ã so s¸nh s¾c ký ®å cña mÉu tr−íc vµ sau khi bæ sung mÉu chuÈn. 2.2 Trang thiÕt bÞ, dông cô vµ hãa chÊt nghiªn cøu chÝnh ThiÕt bÞ, dông cô - S¾c ký khÝ khè phæ GCMS Agilent Gas Chromatograph Mass Spectrometer Agilent 6890 - Bé c« quay ch©n kh«ng IKA- HB4 Rotary Evaporators IKA-HB4 20