Tài liệu Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại hà giang cao bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------- PHẠM THỊ PHƯƠNG LAN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Pasteurella multocida TRONG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI HÀ GIANG, CAO BẰNG VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Thái Nguyên, năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------- PHẠM THỊ PHƯƠNG LAN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Pasteurella multocida TRONG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI HÀ GIANG, CAO BẰNG VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y Mã số: 9.64.01.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Bình 2. TS. Nguyễn Ngọc Nhiên Thái Nguyên, năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả trong luận án này là trung thực, không trùng lặp với những kết quả đã được công bố và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2017 Tác giả Phạm Thị Phương Lan ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân, của các thầy, các cô, các bạn đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo và các thầy, cô của Đại học Thái Nguyên, phòng Đào tạo, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm; Bộ môn vi trùng - Viện Thú y; Bộ môn vi trùng – Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Chi cục Thú y tỉnh Cao Bằng và Chi cục Thú y tỉnh Hà Giang đã hết sức tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm và thực hiện luận văn này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Xuân Bình trường Đại học Nông Lâm và TS. Nguyễn Ngọc Nhiên Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các thày cô giáo, các anh, chị, em – Viện Thú y Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện thí nghiệm, đóng góp những ý kiến quý báu, cùng những kinh nghiệm nghiên cứu để tôi hoàn thiện đề tài nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn./. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2017 Tác giả Phạm Thị Phương Lan iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................................ii MỤC LỤC ...............................................................................................................................iii DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT.........................................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH...................................................................................................... x MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 4 1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida ...................................................................... 4 1.1.1. Phân loại vi khuẩn .................................................................................... 4 1.1.3. Đặc tính sinh hóa ...................................................................................... 7 1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida ....................................... 7 1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra ................................... 18 1.2.1. Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ................................................... 18 1.2.2. Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................... 18 1.2.3. Đặc điểm dịch tễ học .............................................................................. 19 1.2.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ........... 23 1.2.5. Chẩn đoán bệnh ...................................................................................... 25 1.2.6. Phòng và trị bệnh tụ huyết trùng............................................................. 32 1.3. Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ............................................................... 35 1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................ 35 1.3.2. Ở Việt Nam ............................................................................................. 38 1.4. Một số kết luận qua phân tích tổng quan....................................................... 40 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................42 2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ..................................................................... 42 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 42 2.1.2. Nguyên vật liệu ....................................................................................... 42 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 44 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 44 2.2.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng ...................................................................................... 44 2.2.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được....................... 45 iv 2.2.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng............................................................. 45 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 46 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ........ 46 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................. 49 2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn P. multocida ........................................ 49 2.3.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của P. multocida ...... 51 2.3.5. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng bằng kỹ thuật PCR.......... 51 2.3.6. Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng ....... 52 2.3.7. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng đối với chuột nhắt trắng (Carter và cs, 1995) [77]. .................................................................................. 53 2.3.8. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được (Nguyễn Thanh Hà, 1991) [10]. ......... 53 2.3.9. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin .............. 54 2.3.10. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò trước khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA (Indirect Haemaglunation Test). ............... 55 2.3.11. Phương pháp xác định hiệu lực bảo hộ đối với trâu, bò trước và sau khi tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng (Bain và cs, 1982) [61]. ..................................................................................... 56 2.3.12. Phương pháp đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình (Lê văn Tạo, Dương thế Long, 1996) [42] ......................................................................................... 58 2.3.13. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 58 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..........................................59 3.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng từ năm 2011 - 2015 .............................................................. 59 3.1.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng tại tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ........................................................................................... 59 3.1.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ......................................................... 61 v 3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ trong năm tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ...................................................................... 63 3.1.4. Mức độ dịch và hệ số năm dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ...................................................................... 66 3.1.5. Thời điểm phát dịch, mùa dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ...................................................................... 67 3.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ............................... 70 3.2.1. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ...................................................................... 70 3.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng ......................................................... 72 3.2.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P. mutocida phân lập được................................................................................ 73 3.2.4. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản ứng PCR .......................................................................................... 76 3.2.5. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được . 78 3.2.6. Xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida .............................................. 83 3.2.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược ................................... 85 3.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng. ............................................................................ 88 3.3.1. Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin trong vùng thường xuyên xảy ra dịch tụ huyết trùng địa phương .............. 88 3.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng chủng P52 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp. ...... 94 3.3.3. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò được tiêm phòng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng. ........................ 108 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................................................124 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................127 vi DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT AGPT DNA BHI CFU CSY CBPT7 cs DNT ELISA FAO GMT HE HS HGXB5 HSND : Agar Gel Precipitin Test (Phản ứng kết tủa trên thạch) : Deoxyribonucleic acid : Brain Heart Infusion (Môi trường thạch BHI) : Colony forming units (Đơn vị khuẩn lạc) : Casein-sucrose-yeast (Môi trường thạch CSY) : Chủng P. multocida phân lập tại Cao Bằng : Cộng sự : Dermonecrotic toxin (Độc tố gây hoại tử) : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phương pháp ELISA) : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) : Geometic Mean Titer (Hiệu giá trung bình) : Hemtoxylin Eosin (Phương pháp nhuộm HE) : Haemorrhagic septicaemia (Nhiễm trùng huyết, xuất huyết) : Chủng P. multocida phân lập tại Hà Giang : Hệ số năm dịch : Hệ số tháng dịch : Indirect Haemaglunation Tets (Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp) : Lethal Dose 50 – Liều gây chết 50% : Microscopic Agglutination Test (Xét nghiệm huyết thanh học MAT) : National Committee for Clinical Laboratory Standards (Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét ngiệm) OMP : Outer membrane protein (Protenin màng ngoài) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân gen) PMPT : Passive Mouse Protection Test (Phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột) P. multocida : Pasteurella multocida REP-PCR : Repetitive extragenic palindrome (Nhân các đoạn gen lặp lại bằng kỹ thuật PCR) RR : Relative Risk (nguy cơ tương đối RR) SDS : Sodium dodicyl sulphate TEM : Transport enrichment medium (Môi trường vận chuyển) TSI : Triple Sugar Iron (Môi trường 3 đường) THT : Tụ huyết trùng HSTD IHA LD50 MAT NCCLS vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự tương quan giữa các type của Roberts và Carter................................ 14 Bảng 1.2. Hệ thống phân loại serotype P. multocida ............................................... 16 Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi dùng để xác định serotype B của vi khuẩn P. multocida ............................................................................................. 51 Bảng 2.2. Thành phần các chất trong phản ứng PCR .............................................. 52 Bảng 2.3. Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (NCCLS – 2014) [126] .................................................................... 54 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò trước khi tiêm phòng vắc xin .................................................................................. 57 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò sau khi tiêm phòng vắc xin .................................................................................. 58 Bảng 3.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ............................. 59 Bảng 3.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu, bò ..................................................................................................... 61 Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ .................... 63 Bảng 3.4. Hệ số năm dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng ........... 66 Bảng 3.5. Hệ số tháng dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ............................................................................................ 68 Bảng 3.6. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe .......... 70 Bảng 3.7. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng .......................................................................... 72 Bảng 3.8. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P. mutocida phân lập được .......................................................... 74 Bảng 3.9. Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ..................................................................... 75 Bảng 3.10. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản ứng PCR ........................................................................ 77 Bảng 3.11. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ...... 79 Bảng 3.12. Dung quang khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được...... 81 Bảng 3.13. LD50 của vi khuẩn P. multocida ........................................................... 84 viii Bảng 3.14. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của ................ 86 Bảng 3.15. Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng tụ huyết trùng trong huyết thanh của trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin ................................... 88 Bảng 3.16. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò chưa tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng ..................... 90 Bảng 3.17. Điều tra tình hình tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng ............................................................................ 92 Bảng 3.18. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời điểm 1 tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ...................... 95 Bảng 3.19. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời điểm 3 tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ...................... 99 Bảng 3.20. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời điểm 6 tháng sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng ................................. 101 Bảng 3.21. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò đối với từng loại vắc xin tại các thời điểm 1, 3, và 6 tháng sau tiêm phòng ....................................................................................... 103 Bảng 3.22. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu ...................................................... 106 Bảng 3.23. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò đối với vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu tại thời điểm 9 và 12 tháng sau tiêm phòng ....................................................................... 107 Bảng 3.24. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau tiêm 1 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng. ............. 109 Bảng 3.25. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau tiêm 3 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng. ............. 111 Bảng 3.26. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau tiêm 6 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng .............. 113 Bảng 3.27. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu đối với trâu, bò sau tiêm 9 và 12 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng ............................................................................................... 115 Bảng 3.28. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1, 3 và 6 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng ................. 117 ix Bảng 3.29. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 9 và 12 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng ................. 118 Bảng 3.30. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng keo phèn chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1, 3 và 6 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng .............. 120 x DANH M1FỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn P.multocida (Viện Thú y Quốc gia)............ 50 Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò tại tỉnh Cao Bằng ....................................................................................... 62 Hình 3.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò tại tỉnh Hà Giang ....................................................................................... 62 Hình 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông – Xuân và Hè – Thu tại tỉnh Hà Giang ........................................................ 65 Hình 3.4. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông – Xuân và Hè – Thu tại tỉnh Cao Bằng ....................................................... 65 Hình 3.5. Diễn biến tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng.................................................................................... 69 Hình 3.6. Thử phản ứng lên men đường .................................................................. 76 Hình 3.7. Phản ứng sinh Indol ................................................................................. 76 Hình 3.8. Phản ứng PCR xác định serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ........................................................................... 78 Hình 3.9. Thử độc lực trên chuột ............................................................................. 80 Hình 3.10. Dung quang khuẩn lạc chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ........................................................................................................... 82 Hình 3.11. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn P. multocida phân lập được ............................................................................................ 87 Hình 3.12. Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Cao Bằng ................. 102 Hình 3.13. Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Hà Giang ................. 102 Hình 3.14. Tỷ lệ trâu, bò được bảo hộ sau tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin keo phèn chủng P52 ................................................................................ 121 1 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam ngành chăn nuôi trâu, bò luôn giữ vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài cung cấp thịt, sữa là 2 loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phục vụ cho nhu cầu đời sống của người tiêu dùng, còn cung cấp sức kéo, phân bón cho trồng trọt. Bên cạnh đó, chăn nuôi trâu, bò cũng là nguồn cung cấp các sản phẩm phụ như: da, lông, phủ tạng ... cho ngành nông nghiệp chế biến. Theo thông báo của Cục thống kê (2015) [173] tính tới thời điểm 01/10/2015, đàn trâu cả nước có 2,5 triệu con, tăng 0,1% so với cùng thời điểm năm trước; đàn bò có 5,4 triệu con, tăng 2,5%, riêng đàn bò sữa đạt 275,3 nghìn con, tăng 21%. Song song với sự phát triển của ngành chăn nuôi trâu, bò, công tác phòng chống dịch bệnh được đặc biệt coi trọng, trước tiên phải nói đến bệnh tụ huyết trùng. Đây là một trong những bệnh truyền nhiễm thường được đánh giá là nguy hiểm đối với trâu, bò hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới. Bệnh gây ốm và chết nhiều trâu, bò làm ảnh hưởng đến sản xuất, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi. Báo cáo tại Hội nghị phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2014 [1] và hội nghị tổng kết năm 2015 và triển khai nhiệm vụ năm 2016 [2] của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết, trong năm 2014 có 26 tỉnh thành có bệnh tụ huyết trùng với 7.682 trâu, bò mắc bệnh, năm 2015 cũng có 26 tỉnh thành báo cáo có bệnh với 7.278 trâu, bò mắc. Chính vì vậy bệnh này luôn được xác định là đối tượng nghiên cứu của ngành Thú y trong những năm qua và những năm tiếp theo. Một số tỉnh miền núi phía Bắc, trong đó có Hà Giang, Cao Bằng, có diện tích tự nhiên rộng chủ yếu là rừng núi, đây là điều kiện thuận lợi để phát triển chăn nuôi gia súc, đặc biệt là chăn nuôi trâu, bò. Hiện nay, tổng đàn trâu, bò tỉnh Hà Giang trên 265.000 con và tỉnh Cao Bằng trên 228.000 con. Trâu, bò là nguồn sức kéo quan trọng và nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi. Nhưng do có những đặc thù riêng về địa lý, kinh tế xã hội và tập quán chăn nuôi, việc áp dụng kỹ thuật và phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi còn hạn chế, đây chính là những nhân tố tạo nên sự tồn tại và phát sinh nhiều ổ dịch tụ huyết trùng, gây thiệt hại trong chăn nuôi. Theo các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kết quả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3]; năm 2008 tỉnh Hà Giang có 276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng, tỉnh Cao Bằng năm 2008 có 455 trâu, bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng. Để khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, sản xuất, sử dụng để tiêm phòng cho đàn 2 gia súc, nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra ở nhiều địa phương, do đó mục tiêu khống chế, thanh toán bệnh tụ huyết trùng ở từng tỉnh và trong cả nước vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Ở tỉnh Hà Giang và Cao Bằng hàng năm công tác tiêm phòng được triển khai 2 lần/năm, nhưng do một số địa phương chưa quan tâm nhiều đến công tác tiêm phòng, tuyên truyền vận động chưa tốt, một số người dân chưa thực sự hưởng ứng việc tiêm phòng, số trâu, bò tiêm đủ 2 mũi không đạt nên tỷ lệ tiêm phòng thấp, vì vậy dịch bệnh tụ huyết trùng vẫn thường xuyên xảy ra. Việc phân lập xác định vi khuẩn Pasteurella để làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng vắc xin phù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh là cần thiết. Vì vậy việc lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phù hợp cho địa phương có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả công tác kiểm soát, khống chế bệnh. Mục tiêu của đề tài Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng và tình trạng mang trùng vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng. Xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học và yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò trên thực địa. Đánh giá mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được, từ đó đề xuất giải pháp, lựa chọn vắc xin phòng bệnh hiệu quả. Ý nghĩa khoa học của đề tài Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ, serotype kháng nguyên, yếu tố độc lực, và sự lưu hành của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang, Cao Bằng. Bổ sung tư liệu khoa học về hiệu lực bảo hộ của vắc xin khi thử thách với chủng vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc phân lập được; làm tiền đề cho việc tuyển chọn chủng vi khuẩn Pasteurella multocida thích hợp, ổn định kháng nguyên cho việc phát triển vắc xin nội địa để phòng bệnh tụ huyết trùng tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Việc đánh giá tình trạng mang khuẩn P. multocida ở trâu, bò khỏe là cơ sở cho việc điều chỉnh chiến lược phòng bệnh tụ huyết trùng tại hai tỉnh Hà Giang, Cao Bằng. Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ 3 huyết trùng tại thực địa là cơ sở thực tiễn để các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu thay đổi công nghệ chế tạo vắc xin theo hướng tăng cường sự an toàn, đồng thời kéo dài thời gian bảo hộ, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh, góp phần nâng cao hơn nữa hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu, bò. Kết quả đề xuất lựa chọn vắc xin phòng bệnh thích hợp tại địa phương giúp cho cơ quan thú y và người chăn nuôi tại Hà Giang, Cao Bằng nói riêng và các tỉnh miền núi phía Bắc nói chung rà soát, điều chỉnh kế hoạch sử dụng vắc xin thích hợp, đạt tỷ lệ miễn dịch bảo hộ cao ở trâu, bò sau khi tiêm phòng. Những đóng góp mới của đề tài Sử dụng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ trâu bò mắc bệnh tại thực địa để xác định độ dài đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắc xin phòng bệnh đã cho thấy sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi khuẩn sản xuất vắc xin thương mại với chủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng phân lập được. Xác định được vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò đạt hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện các tỉnh miền núi phía Bắc. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida 1.1.1. Phân loại vi khuẩn Theo phân loại của Bergey’s (1994) [63], vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae, giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida. 1.1.2. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Pasteurella multocida (P. multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86]. P. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen. Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P. multocida có thể thấy khi nhuộm bằng xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45]. Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹ thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực. Vi khuẩn P. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể. Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs (1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P. multocida. Môi trường này gồm có 17 thành phần, trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không 5 sinh độc tố như lúc đầu. Warner S. (1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM (Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng. Môi trường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm khác, cũng như các loại nấm. Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P. multocida từ gia súc mắc bệnh. Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của P. multocida là môi trường dextrose-starch agar và caseinsucrose-yeast (CSY). Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sử dụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P. multocida. Vi khuẩn P. multocida phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môi trường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton, hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129]. Vi khuẩn P. multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI. Trong môi trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P. multocida mọc tốt, làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô. Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael và cs, 2002) [112]. Theo Seleim (2005) [150], để vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích tăng trưởng. Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra, 2006) [155]. Hussain và cs (2012) [97] nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn P. multocida trên các nguồn cacbon khác nhau, sử dụng đường glucose, maltose, galactose, sucrose như nguồn carbon để tăng sinh khối tế bào vi khuẩn P. multocida tăng hiệu quả sản xuất vắc xin. Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng Đạt, 1994) [8]. Môi trường này được bổ sung thêm 0,8% sucrose và 2% tụy đệm đã làm tăng hiệu suất phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Phạm Quang Thái, 2004) [43]. Nguyễn Mạnh Thắng và cs (2008) [49] cũng kết luận rằng, môi trường Hottinger thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn P. multocida trong hệ thống lên men kín từng mẻ vắc xin. 6 P. multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc. Theo Namioka và Murata (1961) [121], trên môi trường thạch huyết thanh P. multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc: + Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và vi khuẩn có độc lực mạnh. + Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, vi khuẩn có độc lực trung bình. + Khuẩn lạc R (Rough): có rìa xù xì, thường không có dung quang, vi khuẩn có độc lực yếu. Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu, khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường. Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng. Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán. Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xung quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng. Khuẩn lạc dạng S có dung quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M không có đặc điểm nói trên. Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P. multocida có liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966) [94]. Theo De Alwis (1999) [86], tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau: + Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent). 7 + Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong. Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của vi khuẩn P. mutocida. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P. multocida có tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990) [156]. Rimler (1992) [141] cho rằng, khuẩn lạc của vi khuẩn P. multocida tập trung ở hai dạng chính. Khuẩn lạc dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc dung quang màu xanh. Dung quang của khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày của vi khuẩn. Vi khuẩn có dung quang sắc cầu vồng đứng riêng hoặc từng đôi, có vỏ nhày và rất độc, thường gây bệnh thể cấp tính. Vi khuẩn, có dạng khuẩn lạc dung quang màu xanh kém độc hơn, thường gặp ở những đàn gia súc bị dịch địa phương. 1.1.3. Đặc tính sinh hóa P. multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose. Dương tính với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase. Phản ứng urease âm tính, không mọc trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010 [3]; Lê Văn Dương, 2012 [6]). Mitra và cs (2013) [113] cho biết, vi khuẩn P. multocida dương tính với phản ứng Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose, galactose, fructose và mannitol. Azmat và cs (2013) [59] nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn P. multocida phân lập tại Pakistan cho thấy, vi khuẩn dương tính với oxydase, catalase, sinh Indol. Phản ứng với TSI cũng dương tính, lên men đường xylose, không lên men đường mantose, phản ứng nitrate dương tính, âm tính với phản ứng urease và citrate, vi khuẩn không di động. 1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida 1.1.4.1. Yếu tố độc lực Kháng nguyên Kháng nguyên P. multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin. Cho đến 8 nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P. multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP (outer membrane protein). - Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O. Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price và Smith (1966) [134] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ. Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide. Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên protein đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố miễn dịch quan trọng. Vai trò của polysaccharit trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ kém. Theo Bain và cs (1982) [61], những polysaccharide tinh khiết không tạo được sự bảo hộ đối với chuột, thỏ và bò khi thử thách cường độc. Thành phần polysaccharide chính trong kháng nguyên serotype A là axit hyaluronic (Rosner và cs, 1992) [143]. Ngược lại với kháng nguyên serotype A, kháng nguyên polysaccharide serotype B bao gồm arabinose, mannose, đường galactose với những mối liên kết chưa rõ ràng (Boyce và cs, 2000) [67]. - Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P. multocida có kháng nguyên thân là phức hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch. Namioka và Murata (1964) [122] là những người đầu tiên phát triển kỹ thuật định type kháng nguyên thân. Sau khi bộc lộ kháng nguyên thân bằng xử lý tế bào vi khuẩn với acide HCl và cho ngưng kết với kháng huyết thanh thỏ. Sử dụng kỹ thuật này các tác giả đã xác định được 11 kháng nguyên thân. Price và Smith (1966) [134] dùng phương pháp điện di miễn dịch trên máy lắc Mikle đã tách được 16 kháng nguyên O và kí hiệu từ 1 - 16. Sau khi nhuộm đỏ thiazine, xử lý nhiệt và enzyme, tác giả xác định được 6 trong 16 kháng nguyên O là protein. Tiếp đến Heddleston và cs (1972) [95], đã sử dụng phản ứng kết tủa trên thạch để định loại kháng nguyên thân. Để thực hiện phản ứng này, tác giả đem tế bào vi khuẩn xử lý ở nhiệt độ 100 °C/1 giờ, sau đó thu lấy huyễn dịch, kháng huyết thanh được chuẩn bị qua gà, bằng phương pháp này đã phát hiện có 16 kháng nguyên thân.