Tài liệu Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (penaeus monodon) sử dụng phương pháp phân tích thư viện cdnaest

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN TRUNG THÀNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THƢ VIỆN cDNA/EST Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60 42 01 14 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. KIM THỊ PHƢƠNG OANH Hà Nội - 12/2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Kim Thị Phương Oanh, Trưởng phòng Hệ gen học Môi trường, Viện Nghiên cứu hệ gen, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin cảm ơn tới PGS. TS. Nông Văn Hải, Trưởng phòng Hệ gen học người, Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, đã tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự chỉ bảo chuyên môn nhiệt tình của các cán bộ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc vừa qua. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Trần Trung Thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong việc thực hiện đề tài đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Ký tên Trần Trung Thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................III DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ IV DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ V MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA TÔM SÚ ......................................................3 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố .......................................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh học ....................................................................................3 1.1.2.1. Đặc điểm sinh trƣởng và sinh sản .....................................................3 1.1.2.2. Chu kỳ sống.......................................................................................3 1.1.2.3. Tập tính dinh dƣỡng ..........................................................................5 1.1.2.4. Điều kiện môi trƣờng sống................................................................5 1.2. TÌNH HÌNH NUÔI TRỒNG TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI VÀ .....................6 VIỆT NAM ..............................................................................................................6 1.2.1. Diện tích, sản lƣợng của tôm trên thế giới và Việt Nam ..........................6 1.2.2. Giá trị kinh tế của tôm sú..........................................................................7 1.2.3. Những thách thức của nghề nuôi trồng tôm sú .........................................9 1.2.3.1. Vấn đề dịch bệnh ...............................................................................9 1.2.3.2. Vấn đề chọn giống ..........................................................................11 1.2.3.3. Gia hóa tôm sú.................................................................................13 1.3. CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG TÔM SÚ .................17 1.3.1. Chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh .........................................................17 1.3.2. Phát triển các chỉ thị phân tử ..................................................................19 1.3.3. Nghiên cứu chức năng của những gen liên quan tới một số tính trạng quan trọng ..........................................................................................................27 1.4. XU HƢỚNG PHÁT TRIỂN VÀ TRIỂN VỌNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG TÔM SÚ ...............................................................33 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .....................................................35 2.1. VẬT LIỆU ..................................................................................................35 2.1.1. Thu thập mẫu ..........................................................................................35 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................35 2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................36 2.2. PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................37 2.2.1. Tách chiết RNA tôm sú ..........................................................................39 2.2.2. Tinh sạch mRNA ....................................................................................40 2.2.3. Tạo thƣ viện cDNA/EST tôm sú từ các mô sử dụng plasmid vector với các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu ...............................................................................43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.3.1. Tổng hợp cDNA có chứa trình tự attB1 và attB2 (DNA recombination sites) ở hai đầu .......................................................................43 2.2.3.2. Phân đoạn cDNA theo kích thƣớc...................................................46 2.2.3.3. Tinh sạch cDNA ..............................................................................48 2.2.3.4. Đƣa cDNA vào vector (pDONR222) bằng phản ứng tái tổ hợp giữa các điểm attB và attP ......................................................................................49 2.2.3.5. Biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn ...............................................51 2.2.3.6. Kiểm tra thƣ viện cDNA/EST bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn…………………………………………………………………………..52 2.2.4. Xác định trình tự cDNA/EST ................................................................54 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích dữ liệu trình tự ..................................................55 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................57 3.1. TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ TÔM SÚ..................................................57 3.2. TẠO THƢ VIỆN CDNA/ EST ...................................................................58 3.3. KIỂM TRA THƢ VIỆN CDNA/ EST BẰNG PHẢN ỨNG CẮT ENZYME GIỚI HẠN .............................................................................................................59 3.3.1. Tách chiết plasmid tái tổ hợp..................................................................59 3.3.2. Cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ........................................60 3.3.3. Số liệu thống kê các thƣ viện cDNA/EST tôm sú đã tạo lập .................62 3.4. GIẢI MÃ CÁC CDNA/EST TỪ CÁC THƢ VIỆN ĐÃ TẠO LẬP ............63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................80 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................81 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa AFLP AHPNS ddNTPs DEPC DNA dNTPs DO EDTA EMS EST EtBr GAS GAV HPV IHHNV IMNV LAMP Mab MAS MBV MCS mtDNA OD ORF Pab PCR pH QTL RACE RAPD RFLP RNA RT-PCR SNP WSSV YHV amino acid Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn DNA) Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Diethyl pyrocarbonate Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleoside triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Dissolve oxygen Ethylenediaminetetraacetic acid Early Mortality Syndrome Expressed sequence tag (Đoạn trình tự gen biểu hiện) Ethidium bromide Gene Assisted Selection Gill associated virus Hepatopanceatic parvovirus Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus Infectiuos meonecrosis virus Loop-mediated isothermal amplification Monoclonal antibodies Marker Assisted Selection Monodon baculovirus Multiple cloning site (Vùng cắt gắn đa vị trên vector) Mitochondrial DNA (DNA ty thể) Optical Density (Mật độ quang học) Open Reading Frame (Khung đọc mở ) Polyclonal antibodies Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Potential hydrogen Quantitative trait locus Rapid Amplification of cDNA Ends (khuếch đại các đầu 5„ và 3„ của cDNA) Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên) Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn DNA cắt bằng enzyme giới hạn) Ribonucleic acid Reverse transcriptase-PCR (PCR bằng enzyme phiên mã ngƣợc) Single-nucleotide polymorphism (Đa hình các nucleotide đơn) White spot syndrome virus (virus gây bệnh đốm trắng) Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Chƣơng I Hình 1. 1. Chu kỳ sống của tôm ..................................................................................4 Chƣơng II Hình 2. 1. Sơ đồ quy trình tạo ngân hàng cDNA tôm sử dụng plasmid vector với các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu…………………………………………………………… 38 Hình 2. 2. Dụng cụ nghiền mẫu (Homogenizer)…………………………………...39 Hình 2. 3. Sơ đồ nguyên lý quá trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số…………. 41 Hình 2. 4. Sơ đồ nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA………………………... 43 Hình 2. 5. Đánh dấu đĩa thạch agarose 1% dùng để xác định nồng độ cDNA……. 48 Hình 2. 6. Bản đồ vector pDONR222…………………………………………….. 50 Hình 2. 7. Nguyên lý của quá trình đƣa cDNA vào vector pDONR222………….. 50 Hình 2. 8. Sơ đồ phân tích dữ liệu trình tự nucleotide cDNA/EST……………….. 56 Chƣơng III Hình 3. 1. Điện di đồ các mẫu RNA tổng số tách chiết từ các mô khác nhau ..........57 Hình 3. 2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn ...........................59 Hình 3. 3. Master plate ..............................................................................................59 Hình 3. 4. Một số hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp tác từ các dòng tế bào trong thƣ viện cDNA/EST tôm sú ......................................................................60 Hình 3. 5. Điện di đồ kiểm tra kích thƣớc cDNA đã đƣợc đƣa vào vector pDONR222 ...............................................................................................................61 Hình 3. 6. Thống kê thành phần và phân loại các trình tự cDNA/EST ....................75 Hình 3. 7. So sánh (alignment) trình tự amino acid của protein antimicrobial peptide ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố ..................................................76 Hình 3. 8. So sánh (alignment) trình tự nucleotide gen hemocyanin của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố .....................................................................................77 Hình 3. 9. So sánh (alignment) trình tự amino acid của protein hemocyanin ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố .............................................................................78 Hình 3. 10. So sánh (alignment) trình tự amino acid của protein c-type lectin ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố .........................................................................79 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Chƣơng I Bảng 1. 1. Một số chƣơng trình gia hóa tôm sú trên thế giới [63] ............................16 Chƣơng III Bảng 3. 1. Các mẫu mô tôm sú sử dụng trong nghiên cứu .......................................57 Bảng 3. 2. Kết quả kiểm tra nồng độ một số mẫu RNA tổng số bằng phƣơng pháp đo quang phổ (độ pha loãng 100 lần) ........................................................................58 Bảng 3. 3. Bảng thống kê số lƣợng dòng tế bào phân tích ở các thƣ viện cDNA/.EST từ các mẫu mô tôm sú ...........................................................................62 Bảng 3. 4. Bảng phân tích kết quả tìm kiếm trình tự tƣơng đồng của các protein suy diễn (Kết quả BLASTP) ............................................................................................64 Bảng 3. 5. Bảng phân tích kết quả tìm kiếm trình tự tƣơng đồng của các các trình tự EST (Kết quả BLASTN) ...........................................................................................70 Bảng 3. 6. Chú giải chức năng các protein theo GO .................................................73 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Tôm sú (Penaeus monodon) thuộc giống Penaeus, họ Penaeidae là loài có đặc điểm sinh trƣởng nhanh, đƣợc nuôi rộng rãi nhất trên thế giới. Nghề nuôi tôm là một thế mạnh của thuỷ sản, các chuyên gia ngành thủy sản đánh giá, tôm sú là đối tƣợng xuất khẩu chủ lực ở nƣớc ta. Duy trì sự ổn định của nghề nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nguồn tôm khỏe mạnh và sự kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành. Tuy nhiên, việc chọn và tạo giống tôm sú vẫn còn nhiều khó khăn, nguồn tôm giống chủ yếu là đánh bắt tự nhiên. Nền tảng cho các chƣơng trình chọn giống là những nghiên cứu về gen và hệ gen. Nghiên cứu về hệ gen sẽ cung cấp những thông tin di truyền về các gen liên quan đến tính trạng sinh trƣởng, sinh sản, kháng bệnh và chống chịu với các điều kiện tự nhiên. Có nhiều phƣơng pháp nhằm tiếp cận nghiên cứu hệ gen tôm sú trong đó, phƣơng pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Expressed Sequence Tag, EST) là một trong các phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm tập trung nghiên cứu các gen chức năng. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của tôm sú đã đạt đƣợc một số kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trƣởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh. Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu cơ bản về genome tôm sú, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus monodon) sử dụng phương pháp phân tích thư viện cDNA/EST”. Nghiên cứu đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu giải trình tự một phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu genome tôm sú (P.monodon)” thuộc chƣơng trình “Phát triển và Ứng dụng Công nghệ sinh học ngành Thủy sản”, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng thƣ viện cDNA/EST của tôm sú tự nhiên/nuôi tại Việt Nam. - Xác định trình tự cDNA/EST. - Chú giải chức năng một số gen thu thập đƣợc từ thƣ viện cDNA/EST. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nội dung luận văn: - Thu thập mẫu, tách chiết RNA tổng số bằng phƣơng pháp sử dụng TRIzol (Invitrogen), tinh chế mRNA sử dụng bộ kit “ PolyAtract® mRNA Isolation Systems III” (Promega). - Xây dựng thƣ viện cDNA/EST tôm sú từ các mô sử dụng plasmid vector với các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu sử dụng bộ kit “CloneMiner™ cDNA Library Contruction Kit” (Invitrogen). - Giải mã trình tự nucleotide của các cDNA/EST trên máy ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) và phân tích trình tự thu đƣợc. - Chú giải trình tự nucleotide của các cDNA/EST thu đƣợc bằng các công cụ tin sinh học. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA TÔM SÚ 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố Tôm sú (Penaeus monodon) có tên tiếng Anh là Giant tiger prawn hay Black tiger shrimp thuộc giống Penaeus, họ Tôm he (Penaeidae), bộ phụ Natantia, bộ mƣời chân (Decapoda), lớp giáp xác (Crustacea), ngành chân khớp (Arthropoda). Tôm sú phân bố rộng rãi ở các thủy vực thuộc vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, phân bố tập trung ở vùng Ấn Độ - Thái Bình Dƣơng, Đông và Đông Bắc Châu Phi, Pakistan đến Nhật Bản, Nam Châu Phi đến Bắc Australia. Đặc biệt phân bố hầu hết ở Vùng Đông Nam Á nhƣ Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin và Việt Nam. Ở Việt Nam, tôm sú phân bố tự nhiên ở tất cả các tỉnh ven biển, nhƣng tập trung nhiều nhất ở các vùng Duyên Hải Miền Trung và Nam Bộ. 1.1.2. Đặc điểm sinh học 1.1.2.1. Đặc điểm sinh trƣởng và sinh sản Tôm sú có đặc điểm sinh trƣởng rất nhanh, khoảng 4-5 tháng là tôm đạt đƣợc mức trƣởng thành, đạt trọng lƣợng khoảng 28 gram [15]. Ngoài tự nhiên, khi đến tuổi trƣởng thành thì tôm di cƣ ra biển, bắt cặp, giao vỹ. Khi giao vỹ xong tôm cái sẽ tìm bãi đẻ. Bãi đẻ của tôm thƣờng xa bờ, nƣớc sâu, sạch, độ mặn trên 30 ‰. Khi tôm tìm đƣợc bãi đẻ phù hợp, tôm sẽ đẻ trứng. Sức sinh sản của tôm thƣờng từ 200.000-1.200.000 trứng/ tôm cái. Mùa vụ sinh sản của tôm là từ tháng 2 đến tháng 5 và tháng 7 đến tháng 9. 1.1.2.2. Chu kỳ sống Vòng đời của tôm sú chia làm 5 thời kỳ: thời kỳ phát triển phôi, ấu trùng phù du (Larvae), hậu ấu trùng phù du (Post larvae), ấu niên hay tiền trƣởng thành (Juvenile), và trƣởng thành (Adults) [3] (Hình 1.1) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Căn cứ vào đặc điểm, cấu tạo hình thái ngoài và tập tính ăn mồi ngƣời ta chia thời kỳ ấu trùng phù du làm 3 giai đoạn: ấu trùng không đốt (Nauplli), ấu thể Zoea, ấu thể Mysis: o Nauplli: Có 6 lần lột vỏ nên chia làm 6 giai đoạn N1-N6, các Nauplli có tập tính trôi nổi, hƣớng quang. Chúng tự sống bằng noãn hoàng không cần ăn. o Zoea: Có 3 lần lột vỏ nên chia làm 3 giai đoạn Z1-Z3, các Zoea có tính ăn lọc, thụ động. Tuy nhiên, Zoea vẫn còn sử dụng noãn hoàn trong khi bắt đầu ăn ngoài. Zoea có tính hƣớng quang mạnh. o Mysis: Có 3 lần lột vỏ nên chia làm 3 giai đoạn M1-M3, các Mysis bơi hƣớng xuống sâu, đuôi đi trƣớc đầu đi sau. Giai đoạn hậu ấu trùng (Postlarvae): phần phụ bơi lội và cơ quan tiêu hóa phát triển hoàn chỉnh, thời kỳ này bắt đầu đặc trƣng của sự chín bộ phận sinh dục. Giai đoạn ấu niên (Juvenile): thời kỳ này bộ phận sinh dục đã chín hoàn toàn, tôm sống ở ngoài khơi [4, 7]. (http://oceanworld.tamu.edu) Hình 1. 1. Chu kỳ sống của tôm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.1.2.3. Tập tính dinh dƣỡng Tôm sú là loài ăn tạp, thích ăn các động vật sống và di chuyển chậm nhƣ là giun nhiều tơ, động vật hai mảnh vỏ, côn trùng. Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thủy triều rút. Tôm sú nuôi trong ao, hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối. Tôm bắt mồi bằng càng, sau đó đẩy thức ăn vào miệng, thời gian tiêu hóa thức ăn là 4-5 giờ trong dạ dày.Tập tính ăn và loại thức ăn của tôm sú thay đổi theo từng giai đoạn phát triển. - Giai đoạn ấu trùng: Do tập tính sống trôi nổi bắt mồi thụ động bằng các râu và phụ bộ nên thức ăn phải phù hợp với cỡ miệng. Tôm sú giai đoạn ấu trùng sống trong tự nhiên thức ăn là các loại tảo, luân trùng, mùn bã hữu cơ. - Giai đoạn trƣởng thành: Tôm sú có tập tính sống đáy nên thức ăn là giáp xác sống đáy, giun nhiều tơ, các loại động vật hai mảnh vỏ, các loại ấu trùng của động vật sống đáy, … 1.1.2.4. - Điều kiện môi trƣờng sống Nhiệt độ: Tôm sú là loài rộng nhiệt có thể sống ở nhiệt độ từ 18oC-35oC. Tối ƣu là 28oC-30oC. Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 25oC hay lớn hơn 33oC thì tôm giảm ăn từ 30-50% [6]. - Độ mặn: Tôm sú là loài rộng muối, tùy vào từng giai đoạn phát triển khác nhau mà thích ứng với độ mặn khác nhau. Với điều kiện đƣợc thuần hóa thì tôm có thể tồn tại và phát tiển ở độ mặn từ 0-40 ‰, nhƣng thích hợp nhất ở độ mặn từ 15-25 ‰ [13]. - DO (mật độ oxy hòa tan): Tôm sú có khả năng sinh tồn và phát triển trong khoảng DO từ 2 mg/L trở lên, DO thấp làm cho tôm hô hấp và bắt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ mồi kém. Nếu DO < 2 mg/L thì tôm sẽ bị chết ngạt. DO thích hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển của tôm là > 5 mg/L. - pH: Tôm sú có thể sống trong môi trƣờng nƣớc có pH dao động từ 6,5 – 9,5. pH thích hợp cho sự phát triển tối ƣu của tôm là 7,5 – 8,5 và pH dao động trong ngày không quá 0,5 đơn vị. - Ánh sáng: Tôm sú là loài ƣu tối nên tạo điều kiện bóng mát cho tôm nuôi. - Độ kiềm, NH3, H2S: Độ kiềm từ 80 – 120 mg/L, NH3 < 0,1 mg/L, H2S < 0,03 mg/L [9] 1.2. TÌNH HÌNH NUÔI TRỒNG TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1. Diện tích, sản lƣợng của tôm trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới: Nghề nuôi tôm sú phát triển rất nhanh trên thế giới. Hiện nay, loài này đƣợc nuôi ở hơn 22 quốc gia, giữ vai trò rất lớn trong việc cải thiện đời sống của các cộng đồng dân cƣ ven biển và tạo nguồn thu nhập đáng kể [2]. Trên thế giới có hai khu vực nuôi tôm lớn là Tây bán cầu gồm các nƣớc Châu Mỹ La Tinh và Đông bán cầu gồm các nƣớc Nam Á và Đông Nam Á. Theo Nguyễn Văn Hảo thì năm 1997 ở khu vực Tây bán cầu, sản lƣợng tôm nuôi của Ecuador đạt 130.000 tấn chiếm 66% tổng sản lƣợng tôm nuôi của khu vực. Khu vực Đông bán cầu thì sản lƣợng tôm nuôi là 462.000 tấn chiếm 70% tôm nuôi trên thế giới. Trong đó, Thái Lan là nƣớc đứng đầu, kế đến là Indenesia, Trung Quốc, Banglades và Việt Nam [3, 8]. Năm 2000, sản lƣợng tôm sú nuôi đạt 571,5 nghìn tấn, chiếm 52,3 % tổng sản lƣợng các loại tôm nuôi [37]. Theo thống kê của FAO, sản lƣợng tôm nuôi thế giới năm 2011 sản lƣợng tôm đạt 3,85 triệu tấn, trong đó có gần 3 triệu tấn tôm chân trắng (78%) và hơn 850 nghìn tấn tôm sú (22%) [36]. Ở Việt Nam Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Việt Nam có bờ biển dài trên 3.260 km. với nhiều cửa sông, đầm, phá rất thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản. Đặc biệt vùng đất bãi bồi ven biển, đất ngập nƣớc ven biển bị xâm nhập mặn, thuận lợi cho việc nuôi tôm. Miền Bắc diện tích nuôi tôm không lớn do ở đây có nhiệt độ thấp kéo dài. Khu vực Miền Trung và Khu vực phía Nam do điều kiện địa lý bờ biển uốn khúc, dốc, nền đáy cát, nƣớc biển trong, sạch do chƣa bị ô nhiễm nên thuận lợi cho việc phát triển sản xuất giống tôm sú. [8]. Theo số liệu của Tổng cục Thủy sản, năm 2011, Việt Nam vƣơn lên dẫn đầu thế giới về sản xuất tôm sú với sản lƣợng 300 nghìn tấn. Ấn Độ và Indonesia xếp thứ 2 và 3 với sản lƣợng lần lƣợt là 187,9 nghìn tấn và 126,2 nghìn tấn. Trong năm 2012, cả nƣớc có 30 tỉnh thành nuôi tôm nƣớc lợ đã thả nuôi 657.523 ha, đạt sản lƣợng 476.424 tấn, tăng 0,2% diện tích và giảm 3,9% sản lƣợng. Trong đó diện tích nuôi tôm sú 619.355 ha, sản lƣợng 298.607 tấn, giảm 7,1% diện tích và 6,5% sản lƣợng; tôm chân trắng 38.169 ha, tăng 15,5%, sản lƣợng 177.817 tấn, tăng 3,2% so với năm 2011. Diện tích tôm sú chiếm 94,1% diện tích nuôi tôm và 62,7% sản lƣợng, tôm chân trắng chiếm 5,9% diện tích và 27,3% sản lƣợng. Khu vực ĐBSCL chiếm diện tích và sản lƣợng lớn nhất với 595.723 ha và 358.477 tấn, trong đó tôm sú là 579.997 ha và 280.647 tấn, tôm chân trắng 15.727 ha và 77.830 tấn [14]. Tôm sú đƣợc xác định là sản phẩm chủ lực trong cơ cấu sản xuất và xuất khẩu tôm của Việt Nam. Chính vì vậy, cùng với vị trí dẫn đầu thế giới hiện nay về sản lƣợng tôm sú, Việt Nam cần phát huy hơn nữa thế mạnh của loài tôm này với nguồn cung ổn định, giá bán cạnh tranh và chất lƣợng sản phẩm tốt. 1.2.2. Giá trị kinh tế của tôm sú Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, có thể dễ dàng nhận thấy từ năm 1990 đến nay mặt hàng tôm, và cá đông lạnh vẫn là các mặt hàng chủ lực xuất khẩu. Tuy nhiên, có một sự thay đổi khá lớn về cơ cấu tỷ trọng theo hai loại mặt hàng này. Cụ thể mặt hàng tôm có xu hƣớng tăng nhẹ trong thời gian gần đây và chủ yếu vẫn là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ mặt hàng tôm sú. Trong khi đó, mặt hàng các tra, các ba sa có mức độ gia tăng nhanh chóng. Mặc dù vậy nhƣng tôm vẫn là mặt hàng chiếm ƣu thế, dù cho tôm chiếm một khối lƣợng trong tỉ trọng xuất khẩu không cao song lại có giá trị xuất khẩu rất lớn. Việt Nam hiện nay với 470 doanh nghiệp chế biến thủy sản đông lạnh thì 346 cơ sở đạt tiêu chuẩn ngành về an toàn vệ sinh thực phẩm, trong đó 245 doanh nghiệp đƣợc phép xuất khẩu sang EU, 34 doanh nghiệp đƣợc xuất vào Mỹ và Canada. Tuy nhiên, tính đến tháng 10/ 2012, số doanh nghiệp xuất khẩu tôm chỉ còn khoảng 70 doanh nghiệp. Dịch bệnh, thiếu vốn và nhu cầu từ thị trƣờng thế giới sụt giảm đang là những yếu tố căn bản khiến nhiều doanh nghiệp chế biến và xuất khẩu tôm phải ngừng tham gia xuất khẩu [14] Theo số liệu của Hải quan, năm 2007 các loài thủy sản Việt Nam đã đƣợc xuất khẩu sang 135 thị trƣờng thế giới với khối lƣợng trên 661 nghìn tấn, tăng 13%, đạt giá trị 2.709 tỷ USD, tăng 13,8 % so với cùng kỳ 2006. Trong khi EU duy trì mức tăng khá cao trong năm 2007 thì thị trƣờng Nhật lại giảm khá mạnh và thị trƣờng Mỹ chỉ tăng ở mức độ khiêm tốn và không ổn định. Thị trƣờng Nga là một điển hình về sự biến động gây ảnh hƣởng nhiều đến kết quả tổng xuất khẩu của thủy sản Việt Nam [1]. Theo các số liệu thống kê, trong năm 2012 cả nƣớc có 1.529 cơ sở sản xuất tôm sú giống, sản xuất đƣợc hơn 37 tỷ con giống và có 185 cơ sở sản xuất tôm chân trắng giống với gần 30 tỷ con giống. Việt Nam xuất khẩu tôm sang 92 thị trƣờng, với tổng giá trị ƣớc tính đạt 2,25 tỷ USD, giảm khoảng 6,3% so với năm 2011. Tỷ trọng xuất khẩu tôm sú của Việt Nam đã có thay đổi trên các thị trƣờng thế giới. Thị trƣờng lớn nhất là Nhật Bản, theo sau là Mỹ, Châu Âu và một số nƣớc Châu Á khác. Theo thông tin từ Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2013 tôm là mặt hàng giữ vị trí “quán quân” trong nhóm hàng thủy sản xuất khẩu. Dự kiến xuất khẩu tôm năm 2013 đạt khoảng 2,8 tỷ USD, tăng 27% Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ so với năm 2012. Trong đó, tôm thẻ chân trắng chiếm tỷ trọng khoảng 48,7 % tổng giá trị xuất khẩu tôm [14]. Đối với thị trƣờng tiêu thụ nội địa chúng ta chƣa có một thị trƣờng đúng nghĩa cho ngành thủy sản. Dẫu biết thị trƣờng nội địa có nhiều tiềm lực với số dân khoảng 90 triệu ngƣời, đặc biệt dân số nƣớc ta là dân số trẻ và đang dần hình thành lối sống đô thị hóa. Tuy nhiên, do thói quen ăn uống của ngƣời dân vốn quen với thức ăn chế biến từ thủy sản đánh bắt tự nhiên và tƣơi, sống. Bên cạnh đó là chi phí cho bảo quản và quảng bá thƣơng hiệu của các doanh nghiệp vẫn đang ở mức khá cao. Chính vì vậy, tỉ lệ phần trăm tiêu thụ của thị trƣờng nội địa trong các năm qua hầu hết chỉ giao động xung quanh biên độ 5-10% doanh số của các công ty chế biến thủy sản [1]. 1.2.3. Những thách thức của nghề nuôi trồng tôm sú 1.2.3.1. Vấn đề dịch bệnh Các vấn đề dịch bệnh chính ở các trại sản xuất tôm giống có liên quan đến nhiễm khuẩn, nấm và virus. Trong đó, những thiệt hại nghiêm trọng nhất chủ yếu gây ra do virus. Kiểm tra sàng lọc các mầm bệnh trong suốt giai đoạn ấu trùng và kiểm tra nghiêm ngặt các biện pháp an toàn sinh học trong quá trình sản xuất có thể tránh tôm chết hàng loạt và tránh suy giảm hiệu suất nuôi. Tôm nuôi phải chịu đựng các điều kiện nuôi khá khác biệt so với môi trƣờng biển tự nhiên của chúng. Dịch bệnh xảy ra không chỉ do sự hiện hữu của các mầm bệnh đã đƣợc biết đến trong hệ thống nuôi trồng, mà còn do tác động của các yếu tố môi trƣờng, dinh dƣỡng, quản lý, di truyền hoặc sinh lý dƣới mức tối ƣu. Nhiều loại mầm bệnh thƣờng hiện hữu trong môi trƣờng ao nuôi tôm. Từ đó mà nhiều loại bệnh viêm nhiễm có thể xảy ra, và có thể che giấu nguyên nhân chính của bệnh. Do sự phức tạp của hệ sinh thái mầm bệnh trên tôm nên cần thiết xem xét kỹ vật chủ, mầm bệnh và môi trƣờng nhằm ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh [46] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nghề nuôi tôm hiện đang phải đƣơng đầu với nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi, nhất là bệnh do virus gây ra nhƣ bệnh đốm trắng (White spot syndromes virus - WSSV), hội chứng Taura (Taura syndrome virus - TSV), bệnh đầu vàng (Yellow head virus - YHV), bệnh mang (Gill associated virus - GAV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus - IHHNV), bệnh gan tụy (Hepatopanceatic parvovirus - HPV), bệnh còi (Monodon baculovirus - MBV), bệnh hoại tử cơ/đục cơ (Infectiuos meonecrosis virus - IMNV). Theo cơ quan Quốc tế về Dịch bệnh Động vật (năm 1995), WSSV, IHHNV, YHV, IMNV là các virus gây bệnh cực kỳ nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm, vì các tác nhân này có khả năng lây rất nhanh, có hệ ký chủ rộng [33], tỷ lệ tôm chết khi bị nhiễm bệnh có thể lên đến 80 - 100% [25, 48]. Ở Việt Nam năm 2011, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn đã ban hành thông tƣ số 83/2011/TT - BNNPTNT về việc công bố các dịch bệnh nguy hiểm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng; bao gồm hội chứng Taura và bệnh hoại tử cơ ở tôm chân trắng; bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô gây hại trên cả tôm sú và tôm chân trắng. Trong 4 tháng đầu năm 2012, tình hình tôm chết tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long diễn biến hết sức phức tạp. Diện tích nuôi tôm bị thiệt hại tại Cà Mau đã lên đến 555 ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng), tại Bạc Liêu là 1.270 ha và tại Sóc Trăng là 1.400 ha (gồm 500 ha tôm thẻ chân trắng và hơn 900 ha tôm sú nghịch vụ) (theo báo cáo tháng 4/2012 của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Cà Mau, tỉnh Bạc Liêu và tỉnh Sóc Trăng). Từ số liệu thu đƣợc thì năm 2012 cả nƣớc có khoảng 100.766 ha diện tích nuôi tôm nƣớc lợ bị thiệt hại do dịch bệnh tôm chết sớm (EMS) (trong đó 91.174 ha nuôi tôm sú và 7.068 ha nuôi tôm thẻ chân trắng). Theo điều tra, khảo sát và nghiên cứu của Tổng cục Thủy sản, chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) chiếm 45,7% diện tích thiệt hại và xảy ra chủ yếu trên diện tích nuôi tôm công nghiệp. Phần còn lại là do bệnh đốm trắng và đầu vàng [14, 57]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Điều đáng mừng là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính vừa đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu đã tìm đƣợc nguyên nhân và có các biện pháp phòng chống. Ngày 9-5-2013, Cục Thú y đã ban hành Công văn 737 về việc thông báo tác nhân gây Hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm nuôi. Kết quả nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus gây ra. Vi khuẩn này đã bị nhiễm bởi một loại thể thực khuẩn (Phage) sống ký sinh nên sinh ra độc tố cực mạnh gây Hội chứng AHPNS cho tôm nuôi [30]. Trên thế giới, ở các nƣớc có nghề nuôi trồng tôm sú khác cũng có nguy cơ bùng phát dịch bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng [54]. Bệnh đốm trắng là một ví dụ điển hình về tốc độ lây lan của bệnh; đầu tiên bệnh đốm trắng đƣợc phát hiện tại Đài loan vào năm 1992, WSSV đã nhanh chóng lan truyền rộng rãi trên hầu khắp các quốc gia Châu Á và ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản xuất của các quốc gia này [44]. Trong năm 2011 Trung Quốc chịu thiệt hại 1,7 triệu tấn (giá trị khoảng 3,3 tỷ USD) trong đó, gây ra bởi thảm họa tự nhiên (1,2 triệu tấn), dịch bệnh (295.000 tấn) và ô nhiễm môi trƣờng (123.000 tấn). Dịch bệnh cũng đã ảnh hƣởng lớn tới sản lƣợng tôm nuôi tại Mozambique trong năm 2011 [35]. 1.2.3.2. Vấn đề chọn giống Trên quy mô toàn cầu, vấn đề lựa chọn giống là một yêu cầu bắt buộc và có ý nghĩa vô cùng quan trọng, dẫn tới giảm thiểu thiệt hại trong nuôi trồng thủy sản. Các chƣơng trình chọn giống chủ yếu tập trung vào các tính trạng: tốc độ sinh trƣởng, năng suất của tôm nuôi, khả năng sinh sản, khả năng kháng bệnh, và khả năng sống sót của ấu trùng. Phƣơng pháp chọn giống truyền thống thƣờng thông qua các kỹ thuật chọn lọc cá thể và các phƣơng pháp lai. Trong khi chọn lọc cá thể là một biện pháp nâng cao chất lƣợng giống, một phƣơng pháp khác là lai giữa các dòng tôm có nguồn gốc khác nhau về mặt địa lý cũng có thể nâng cao tốc độ tăng trƣởng của tôm nhờ vào ƣu thế lai ở thế hệ con. Phƣơng pháp lai có thể cho kết quả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/