Tài liệu Nghiên cứu vacxin phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, có hồng mỹ nuôi công nghiệp

BOÄ NOÂNG NGHIEÄP VAØ PTNT VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN II ---------------*--------------- BAÙO CAÙO TOÅNG KEÁT ÑEÀ TAØI: NGHIEÂN CÖÙU VACXIN PHOØNG BEÄNH NHIEÃM KHUAÅN CHO CAÙ TRA, CAÙ BASA, CAÙ MUÙ, CAÙ GIOØ, CAÙ HOÀNG MYÕ NUOÂI COÂNG NGHIEÄP CHUÛ NHIEÄM ÑEÀ TAØI: ThS. NGUYEÃN MAÏNH THAÉNG 7620 05/01/2010 Thaønh phoá Hoà Chí Minh Thaùng 12 – 2009 BOÄ NOÂNG NGHIEÄP VAØ PTNT VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN II ---------------*--------------- BAÙO CAÙO TOÅNG KEÁT ÑEÀ TAØI: NGHIEÂN CÖÙU VACXIN PHOØNG BEÄNH NHIEÃM KHUAÅN CHO CAÙ TRA, CAÙ BASA, CAÙ MUÙ, CAÙ GIOØ, CAÙ HOÀNG MYÕ NUOÂI COÂNG NGHIEÄP Chuû nhieäm ñeà taøi: ThS. Nguyeãn Maïnh Thaéng Danh saùch nhöõng ngöôøi thöïc hieän chính: 1. ThS. Nguyeãn Dieãm Thö 2. ThS. Nguyeãn Thò Moäng Hoaøng 3. ThS. Nguyeãn Thò Hieàn 4. KS. Nguyeãn Thò Hoàng Vaân 5. CN. Hoaøng Thanh Lòch Thaønh phoá Hoà Chí Minh Thaùng 12 - 2009 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Baûng Trang Baûng 1.1: Moät soá loaïi vacxin ñang ñöôïc söû duïng treân theá giôùi 21 Baûng 3.1: Keát quaû phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån 41 Baûng 3.2: Ñoäc löïc cuûa vi khuaån E.ictaluri treân caù tra vaø caù basa 46 Baûng 3.3. Keát quaû chaïy PCR caùc maãu vi khuaån 50 Baûng 3.4: Toång hôïp soá löôïng caù tra cheát 53 Baûng 3.5: Toång hôïp soá löôïng caù basa cheát 53 Baûng 3.6: Tính lieàu LD50 cuûa vi khuaån E.ictaluri ñoái vôùi caù tra 55 Baûng 3.7: Tính lieàu LD50 cuûa vi khuaån E.ictaluri ñoái vôùi caù basa 56 Baûng 3.8: Tyû leä baûo hoä ôû caùc lieàu tieâm vi khuaån voâ hoaït ñoái vôùi caù tra 57 Baûng 3.9: Tyû leä baûo hoä ôû caùc lieàu tieâm vi khuaån voâ hoaït ñoái vôùi caù basa 57 Baûng 3.10: Soá löôïng caù tra cheát theo thôøi gian 58 Baûng 3.11: Soá löôïng caù basa cheát theo thôøi gian 58 Baûng 3.12: Hieäu giaù khaùng theå cuûa caù tra sau khi tieâm canh khuaån voâ hoaït lieàu 108CFU/con 60 Baûng 3.13: Hieäu giaù khaùng theå cuûa caù basa sau khi tieâm canh khuaån voâ hoaït lieàu 108CFU/con 60 Baûng 3.14: Hieäu giaù khaùng theå ôû caù tra soáng soùt sau khi coâng cöôøng ñoäc 62 Baûng 3.15: Hieäu giaù khaùng theå ôû caù basa soáng soùt sau khi coâng cöôøng ñoäc 62 Baûng 3.16: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån E.ictaluri trong caùc loaïi moâi tröôøng khi nuoâi caáy ñoäng khoâng suïc khí 63 Baûng 3.17: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån E.ictaluri trong moâi tröôøng Hottinger caûi tieán khi nuoâi caáy leân men 65 Baûng 3.18: Ñoä an toaøn cuûa vacxin ñoái vôùi caù tra 67 Baûng 3.19: Ñoä an toaøn cuûa vacxin ñoái vôùi caù basa 67 Baûng 3.20: Ñoä an toaøn cuûa vacxin pheøn chua phoøng beänh gan thaän coù muû ñoái vôùi caù tra vaø caù basa 70 Baûng 3.21: Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin cho caù tra 71 Baûng 3.22: Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin cho caù basa 72 Baûng 3.23: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa vacxin khi tieâm cho caù tra vaø caù basa 72 Bảng 3.24: Tyû leä baûo boä cuûa vacxin cho caù tra sau khi tieâm 2 thaùng 73 Baûng 3.25: Tyû leä baûo boä cuûa vacxin cho caù basa sau khi tieâm 2 thaùng 74 Baûng 3.26: Thôøi gian caù tra cheát sau khi coâng cöôøng ñoäc (Tieâm vacxin 2 thaùng) 74 Baûng 3.27: Thôøi gian caù basa cheát sau khi coâng cöôøng ñoäc (Tieâm vacxin 2 thaùng) 75 Bảng 3.28: Tyû leä baûo boä cuûa vacxin cho caù tra sau khi tieâm 3 thaùng 76 Bảng 3.29: Tyû leä baûo boä cuûa vacxin cho caù basa sau khi tieâm 3 thaùng 76 Baûng 3.30: Hieäu löïc cuûa vacxin sau khi baûo quaûn 3 thaùng 77 Baûng 3.31: Hieäu löïc cuûa vacxin sau khi baûo quaûn 4 thaùng 78 Baûng 3.32: Hieäu löïc cuûa vacxin sau khi baûo quaûn 6 thaùng 79 Baûng 3.33: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä sau thôøi gian baûo quaûn vacxin 79 Baûng 3.34: Hieäu giaù khaùng theå cuûa caù sau khi tieâm vacxin ngoaøi thöïc ñòa 82 Baûng 3.35: Ñaëc tính sinh hoaù cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus vaø Vibrio parahaemolyticus. 87 Baûng 3.36: Ñoäc löïc cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus chuûng CM vaø CG 90 Baûng 3.37: Ñoäc löïc cuûa vi khuaån Vibrio parahaemolyticus chuûng CM1 vaø CG1 90 Baûng 3.38: Xaùc ñònh lieàu LD50 cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus ñoái vôùi caù muù vaø caù gioø 93 Baûng 3.39: Xaùc ñònh lieàu LD50 cuûa V. parahaemolyticus ñoái vôùi caù muù vaø caù gioø 94 Baûng 3.40: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus trong moâi tröôøng TSB vaø Hottinger 96 Baûng 3.41: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Vibrio parahaemolyticus trong moâi tröôøng TSB vaø Hottinger 98 Baûng 3.42: Ñoä an toaøn cuûa vacxin pheøn chua phoøng beänh Vibriosis ñoái vôùi caù muù vaø caù gioø 103 Baûng 3.43: Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin cho caù muù vaø caù gioø 104 Baûng 3.44: Hieäu giaù khaùng theå cuûa caù muù vaø caù gioø sau khi coâng cöôøng ñoäc 105 Baûng 3.45: Tyû leä baûo boä cuûa vacxin cho caù muù vaø caù gioø sau khi tieâm 2 thaùng 106 Bảng 3.46: Tyû leä baûo boä cuûa vacxin cho caù muù vaø caù gioø sau khi tieâm 3 thaùng 108 Baûng 3.47: Ñoä daøi mieãn dòch cuûa vacxin ñoái vôùi caù muù vaø caù gioø 109 Baûng 3.48: Hieäu löïc cuûa vacxin treân caù muù vaø caù gioø sau khi baûo quaûn 4 thaùng 112 Baûng 3.49: Hieäu löïc cuûa vacxin treân caù muù vaø caù gioø sau khi baûo quaûn 6 thaùng 113 Baûng 3.50: So saùnh hieäu löïc vacxin treân caù muù vaø caù gioø sau 4 vaø 6 thaùng baûo quaûn 113 Baûng 3.51. Hieäu giaù khaùng theå cuûa caù muù vaø caù gioø sau khi tieâm vacxin ngoaøi thöïc ñòa 109 Baûng 3.52: Ñaëc tính sinh hoaù cuûa vi khuaån Streptococcus iniae chuûng HM07 121 Baûng 3.53: Kieåm tra ñoäc löïc cuûa vi khuaån S. iniae chuûng HM07 treân caù hoàng myõ 124 Baûng 3.54: Toång hôïp caù hoàng myõ cheát ôû caùc loâ thí nghieäm 125 Baûng 3.55: Lieàu LD50 cuûa vi khuaån S.iniae chuûng HM07 ñoái vôùi caù hoàng myõ 125 Baûng 3.56: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Streptococcus iniae chuûng HM07 trong moâi tröôøng TSB vaø Hottinger 126 Baûng 3.57: Ñoä an toaøn cuûa vacxin pheøn chua phoøng beänh do vi khuaån Streptococcus gaây ra cho caù hoàng myõ 130 Baûng 3.58: Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua cho caù hoàng myõ 131 Baûng 3.59: Tyû leä baûo hoä cho caù hoàng myõ sau 2 thaùng tieâm vacxin 132 Baûng 3.60: Tyû leä baûo hoä cho caù hoàng myõ sau 3 thaùng tieâm vacxin 133 Baûng 3.61: Cheânh leäch TLBH sau khi tieâm vacxin 21 ngaøy, 2 thaùng vaø 3 thaùng 134 Baûng 3.62: Hieäu löïc cuûa vacxin treân caù hoàng myõ sau 4 vaø 6 thaùng baûo quaûn 136 Baûng 3.63: So saùnh hieäu löïc vacxin treân caù hoàng myõ sau 4 vaø 6 thaùng baûo quaûn 136 DANH MUÏC CAÙC HÌNH AÛNH Hình Trang Hình 3.1: Vi khuaån Edwardsiella ictaluri döôùi kính hieån vi 43 Hình 3.2: Vi khuaån Edwardsiella ictaluri treân moâi tröôøng thaïch maùu 44 Hình 3.3: Ñaëc tính sinh hoaù cuûa Edwardsiella ictaluri treân API 20E 45 Hình 3.4: Heä thoáng nuoâi caù thí nghieäm taïi Trung taâm Quoác gia gioáng Thuûy saûn nam boä (Caùi Beø, Tieàn giang) 49 Hình 3.5: Moå khaùm caù tröôùc khi tieâm 49 Hình 3.6: Saûn phaåm PCR ñieän di treân gel agarose 1,5% cuûa vi khuaån 51 Hình 3.7: Saûn phaåm PCR ñieän di cuûa maãu moâ thu ngoaøi thöïc ñòa 52 Hình 3.8: Caù cheát sau khi coâng vi khuaån soáng 54 Hình 3.9: Moå khaùm caù cheát 54 Hình 3.10: Kieåm tra ñaëc tính sinh hoaù cuûa vi khuaån Vibrio baèng boä kit API 20E 89 Hình 3.11: Heä thoáng nuoâi caù thí nghieäm taïi Trung taâm quoác gia gioáng Haûi saûn Nam Boä (Vuõng Taøu) 92 Hình 3.12: Moå khaùm caù muù tröôùc khi laøm thí nghieäm Hình 3.13: Caù gioø ñöôïc nuoâi laøm thí nghieäm 92 93 DANH MUÏC CAÙC ÑOÀ THÒ Ñoà thò Trang Ñoà thò 3.1: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Edwardsiella ictaluri trong caùc loaïi moâi tröôøng khi nuoâi caáy tónh 64 Ñoà thò 3.2: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Edwardsiella ictaluri trong moâi tröôøng Hottinger khi nuoâi caáy leân men 65 Ñoà thò 3.3: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin caù tra sau moät thôøi gian baûo quaûn 80 Ñoà thò 3.4: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin caù basa sau moät thôøi gian baûo quaûn 80 Ñoà thò 3.5: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus trong moâi tröôøng TSB vaø Hottinger 97 Ñoà thò 3.6: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus trong moâi tröôøng Hottinger khi nuoâi caáy leân men 97 Ñoà thò 3.7: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Vibrio paraheamolyticus trong moâi tröôøng TSB vaø Hottinger 99 Ñoà thò 3.8: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Vibrio paraheamolyticus trong moâi tröôøng Hottinger khi nuoâi caáy leân men 99 Ñoà thò 3.9: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä sau moät thôøi gian tieâm vacxin cuûa 3 loâ vacxin ñoái vôùi caù muù 111 Ñoà thò 3.10: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä sau moät thôøi gian tieâm vacxin cuûa 3 loâ vacxin ñoái vôùi caù gioø 111 Ñoà thò 3.11: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin caù muù sau moät thôøi gian baûo quaûn 114 Ñoà thò 3.12: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin caù gioø sau moät thôøi gian baûo quaûn 115 Ñoà thò 3.13: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Streptococcus khi nuoâi caáy ñoäng khoâng suïc khí trong moâi tröôøng TSB vaø Hottinger 127 Ñoà thò 3.14: Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Streptococcus trong moâi tröôøng Hottinger khi nuoâi caáy leân men 128 Ñoà thò 3.15: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä sau moät thôøi gian tieâm vacxin cuûa 3 loâ vacxin Ñoà thò 3.16: Cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin caù hoàng myõ 135 137 TOÙM TAÉT Qua ñieàu tra, thu thaäp maãu beänh phaåm caù bò beänh ñieån hình taïi caùc trang traïi nuoâi caù. Töø caùc maãu caù tra, caù basa bò beänh gan thaän coù muû phaân laäp ñöôïc vi khuaån Edwardsiella ictaluri. Töø caùc maãu caù muù, caù gioø bò beänh lôû loeùt phaân laäp ñöôïc vi khuaån Vibrio alginolyticus vaø Vibrio parahaemolyticus. Töø caùc maãu caù hoàng myõ bò beänh lôû loeùt phaân laäp ñöôïc vi khuaån Streptococcus iniae . Caùc vi khuaån phaân laäp ñöôïc nghieân cöùu veà ñaëc tính sinh hoaù, ñaëc tính nuoâi caáy. Söû duïng caùc chuûng vi khuaån naøy ñeå gaây nhieãm thöïc nghieäm, khaûo saùt ñoäc löïc vaø ñaëc tính sinh mieãn dòch cuûa chuùng. Choïn caùc phaân laäp coù ñoäc löïc cao vaø phaùt trieån toát trong moâi tröôøng nhaân taïo ñeå tieán haønh nghieân cöùu thöû nghieäm vacxin phoøng beänh. Vacxin ñöôïc saûn xuaát thöû nghieäm phoøng caùc beänh nhieãm khuaån cho caùc loaøi caù ñaõ neâu ôû treân laø vacxin voâ hoaït toaøn teá baøo ñöôïc dieät baèng formol vôùi lieàu 0,4%. Chaát boå trôï söû duïng laø dung dòch pheøn chua. Tyû leä cuoái cuøng cuûa chaát boå trôï trong vacxin laø 0,4%. Moâi tröôøng Hottinger caûi tieán thích hôïp ñeå nuoâi caáy caùc loaïi vi khuaån trong heä thoáng leân men taïo canh khuaån duøng laøm vacxin. Noàng ñoä muoái trong moâi tröôøng tuøy thuoäc vaøo ñaëc tính cuûa töøng loaïi vi khuaån gaây beänh cho caù. Ñoái vôi caùc vi khuaån gaây beänh cho caù nöôùc maën ñoøi hoûi moâi tröôøng nuoâi caáy coù noàng ñoä muoái cao hôn so vôùi vi khuaån gaây beänh cho caù nöôùc ngoït. Söû duïng lieàu vacxin tieâm cho caù laø 0,2ml/con. Löôïng khaùng nguyeân trong 1 lieàu vacxin vi khuaån voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh gan thaän coù muû cho caù tra vaø caù basa laø 3.109 teá baøo vi khuaån. Löôïng khaùng nguyeân trong 1 lieàu vacxin vi khuaån voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriolosis cho caù muù, caù gioø vaø vacxin vi khuaån voâ hoaït phoøng beänh do Streptococcus ôû caù hoàng myõ laø 2.109 teá baøo vi khuaån. Vacxin an toaøn khi tieâm cho caù vôùi lieàu khaùng nguyeân gaáp ñoâi lieàu söû duïng. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin thöû nghieäm cho caù tra ôû 3 loâ khaûo saùt khi coâng cöôøng ñoäc vôùi lieàu 20LD50 dao ñoäng töø 65% ñeán 76,7%. Cheânh leäch tyû leä baûo hoä giöõa nhoùm caù ñöôïc tieâm vacxin vôùi nhoùm caù ñoái chöùng ôû 3 loâ vacxin khaûo saùt noùi treân dao ñoäng trong khoaûng töø 48,4% ñeán 56,6%. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin thöû nghieäm cho caù basa ôû 3 loâ khaûo saùt khi coâng cöôøng ñoäc vôùi lieàu 20LD50 dao ñoäng töø 68,3% ñeán 73,3%. Cheânh leäch tyû leä baûo hoä giöõa nhoùm caù ñöôïc tieâm vacxin vôùi nhoùm caù ñoái chöùng ôû 3 loâ vacxin khaûo saùt noùi treân dao ñoäng trong khoaûng töø 46,6% ñeán 53,3%. Mieãn dòch cuûa vacxin vi khuaån voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh gan thaän coù muû cho caù tra vaø caù basa keùo daøi ñöôïc ít nhaát laø 3 thaùng. Ñoái vôùi caù tra, sau 3 thaùng tieâm vacxin cheânh leäch tyû leä baûo hoä khi coâng cöôøng ñoäc vôùi lieàu 20LD50 dao ñoäng töø 48,7% ñeán 51,3%. Ñoái vôùi caù basa, cheânh leäch tyû leä baûo hoä sau 3 thaùng tieâm vacxin dao ñoäng töø 39,7% ñeán 53,8%. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin thöû nghieäm cho caù muù ôû 3 loâ khaûo saùt khi coâng cöôøng ñoäc vôùi lieàu 20LD50 dao ñoäng töø 70% ñeán 80,0%. Tuy nhieân, cheânh leäch tyû leä baûo hoä giöõa nhoùm caù ñöôïc tieâm vacxin vôùi nhoùm caù ñoái chöùng ôû 3 loâ vacxin khaûo saùt noùi treân chæ dao ñoäng trong khoaûng töø 35,0% ñeán 40,0%. Tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin thöû nghieäm cho caù muù cuõng coù tyû leä baûo hoä vaø cheânh leäch tyû leä baûo hoä töông töï nhö vacxin ñoái vôùi caù gioø. Sau 3 thaùng tieâm vacxin, tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin khaûo saùt ñoái vôùi caù muù dao ñoäng töø 65% ñeán 70%. Cheânh leäch tyû leä baûo hoä dao ñoäng töø 35% ñeán 40%. Sau 3 thaùng tieâm vacxin, tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin khaûo saùt ñoái vôùi caù gioø dao ñoäng töø 70% ñeán 80%. Cheânh leäch tyû leä baûo hoä töông töï nhö ñoái vôùi vacxin cho caù muù, dao ñoäng töø 35% ñeán 40%. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin thöû nghieäm cho caù hoàng myõ ôû 3 loâ khaûo saùt khi coâng cöôøng ñoäc vôùi lieàu 20LD50 dao ñoäng töø 65% ñeán 75,0%. Tuy nhieân, cheânh leäch tyû leä baûo hoä giöõa nhoùm caù ñöôïc tieâm vacxin vaø nhoùm caù ñoái chöùng chæ ñaït töø 25% ñeán 30%. Sau 3 thaùng tieâm vacxin, tyû leä baûo hoä cuûa 3 loâ vacxin khaûo saùt ñoái vôùi caù hoàng myõ dao ñoäng töø 55% ñeán 80%. Cheânh leäch tyû leä baûo hoä giöõa nhoùm caù ñöôïc tieâm vacxin vaø nhoùm caù ñoái chöùng dao ñoäng töø 25% ñeán 35%. Khi baûo quaûn caùc loaïi vacxin vi khuaån voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh cho caù tra, caù basa, caù muù, caù gioø, caù hoàng myõ ôû nhieät ñoä töø 2-80C thì ñoä daøi baûo quaûn cuûa vacxin keùo daøi ñöôïc ít nhaát laø 6 thaùng. Sau 6 thaùng baûo quaûn ôû ñieàu kieän nhö treân cheânh leäch tyû leä baûo hoä giöõa nhoùm caù thí nghieäm vaø nhoùm caù ñoái chöùng töông ñöông vôùi vôùi cheânh leäch tyû leä baûo hoä cuûa vacxin khi môùi saûn xuaát. Thöû nghieäm söû duïng vacxin ngoaøi thöïc ñòa cho thaáy caùc loaïi vacxin ñeàu an toaøn cho caù. Taát caû caùc caù ñöôïc tieâm vacxin ñeàu bình thöôøng, khoâng coù baát kyø trieäu chöùng laâm saøng naøo khaùc bieät coù theå nhaän thaáy so vôùi nhoùm caù ñoái chöùng. Trong thöû nghieäm ngoaøi thöïc ñòa khoâng duøng phöông phaùp coâng cöôøng ñoäc ñeå kieåm tra hieäu löïc mieãn dòch cuûa vacxin maø chæ duøng phöông phaùp ngöng keát ñeå kieåm tra haøm löôïng khaùng theå cuûa caù sau khi tieâm vacxin. Keát quaû kieåm tra haøm löôïng khaùng theå cho thaáy hieäu giaù khaùng theå ôû caù sau khi tieâm vacxin thöû nghieäm ngoaøi thöïc ñòa töông ñöông vôùi hieäu giaù khaùng theå cuûa caù sau khi tieâm vacxin trong ñieàu kieän phoøng thí nghieäm. MUÏC LUÏC Trang Danh muïc caùc baûng Danh muïc caùc hình aûnh Danh muïc caùc ñoà thò Toùm taét ÑAËT VAÁN ÑEÀ Chöông 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1.1. Beänh nhieãm khuaån cuûa caù basa, caù tra, caù muù, caù gioø, caù hoàng myõ 1.1.1. Beänh nhieãm khuaån treân caù tra 1 2 1.1.1.1. Beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng cuûa caù tra 2 1.1.1.2. Beänh xuaát huyeát treân caù tra 2 1.1.2. Beänh nhieãm khuaån treân caù basa 2 1.1.2.1. Beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng cuûa caù basa 2 1.1.2.2. Beänh xuaát huyeát treân caù basa 3 1.1.3. Beänh nhieãm khuaån treân caù muù 3 1.1.4. Beänh nhieãm khuaån treân caù gioø 3 1.1.5. Beänh nhieãm khuaån treân caù hoàng myõ 3 1.2. Toång quan veà vacxin vaø mieãn dòch 4 1.2.1. Lòch söû phaùt trieån cuûa vacxin 4 1.2.2. Lôïi ích cuûa vieäc duøng vacxin 4 1.2.3. Vacxin vaø nguyeân lyù taùc duïng 4 1.2.4. Tieâu chuaån cuûa vacxin 5 1.2.5. Mieãn dòch ôû caù xöông 5 1.2.5.1. Heä thoáng mieãn dòch töï nhieân ôû caù xöông 9 1.2.5.2. Heä thoáng mieãn dòch tieáp thu ôû caù xöông 10 1.2.6. Phöông phaùp söû duïng vacxin ôû caù 10 1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng ñaùp öùng mieãn dòch ôû caù 13 1.2.8. Söû duïng vacxin trong nuoâi troàng thuûy saûn 14 1.2.8.1. Söû duïng vacxin trong nuoâi troàng thuûy saûn treân theá giôùi 16 2.2.8.2. Söû duïng vacxin trong nuoâi troàng thuûy saûn taïi Vieät Nam 17 Chöông 2: NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 17 2.1. Ñoái töôïng vaø ñòa ñieåm nghieân cöùu 23 2.2. Vaät lieäu vaø duïng cuï thí nghieäm 2.3. Noäi dung nghieân cöùu 25 2.4. Phöông phaùp nghieân cöùu 25 Chöông 3: KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU 25 3.1. Caùch tieáp caän ñeå xaùc ñònh höôùng nghieân cöùu 25 3.2. Nghieân cöùu cheá taïo vacxin phoøng beänh gan thaän coù muû cho caù tra vaø caù basa 39 3.2.1. Phaân laäp vi khuaån 3.2.2. Kết quả gây bệnh thực nghiệm 39 3.2.3. Xaùc ñònh lieàu LD50 cuûa vi khuaån ñoái vôùi caù tra, caù basa 40 3.2.4. Xaùc ñònh ñaëc tính sinh mieãn dòch vaø lieàu khaùng nguyeân thích 45 hôïp cuûa vi khuaån Edwardsiellla ictaluri ñoái vôùi caù tra vaø caù basa 52 3.2.5. Khaûo saùt söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Edwardsiella ictaluri trong moät soá moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy 56 3.2.5.1. Nuoâi caáy ñoäng khoâng suïc khí 3.2.5.2. Nuoâi caáy leân men 63 3.2.6. Choïn chaát boå trôï 63 3.2.7. Kieåm tra voâ truøng, an toaøn vaø hieäu löïc cuûa vacxin 64 3.2.7.1. Kieåm tra voâ truøng vacxin 66 3.2.7.2. Kieåm tra ñoä an toaøn cuûa vacxin 69 3.2.7.3. Kieåm tra hieäu löïc mieãn dòch cuûa vacxin vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh gan thaän coù muû caù tra, caù basa 69 70 3.2.8. Khaûo saùt ñoä daøi mieãn dòch cuûa vacxin pheøn chua phoøng beänh gan thaän coù muû caù tra, caù basa. 71 3.2.8.1. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin sau khi tieâm 2 thaùng 3.2.8.2. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin sau khi tieâm 3 thaùng 73 3.2.9. Khaûo saùt ñoä daøi baûo quaûn cuûa vacxin pheøn chua 73 phoøng beänh gan thaän coù muû caù tra, caù basa 75 3.2.10. Thöû nghieäm vacxin ngoaøi thöïc ñòa 3.3. Nghieân cöùu cheá taïo vacxin phoøng beänh Vibriosis cho caù muù, caù gioø 77 3.3.1. Phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån 81 3.3.2. Gaây nhieãm thöïc nghieäm vaø xaùc ñònh lieàu LD50 cuûa vi khuaån Vibrio 86 alginolyticus vaø Vibrio parahaemolyticus ñoái vôùi caù muù vaø caù gioø 86 3.3.3. Kieåm tra ñaëc tính nuoâi caáy cuûa vi khuaån Vibrio alginolyticus vaø Vibrio parahaemolyticus 89 3.3.4. Cheá taïo vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriosis cho caù muù vaø caù gioø 95 3.3.4.1. Cheá taïo vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriosis cho caù muù 100 3.3.4.2. Cheá taïo vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriosis cho caù gioø 101 3.3.5. Kieåm tra voâ truøng, an toaøn vaø hieäu löïc cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriosis cho caù muù vaø caù gioø 101 3.3.5.1. Kieåm tra voâ truøng vacxin 3.3.5.2. Kieåm tra ñoä an toaøn cuûa vacxin 102 3.3.5.3. Kieåm tra hieäu löïc cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua 102 phoøng beänh Vibriosis cho caù muù vaø caù gioø 102 3.3.6. Khaûo saùt ñoä daøi mieãn dòch cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriosis cho caù muù vaø caù gioø 103 3.3.6.1. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin sau khi tieâm 2 thaùng 3.3.6.2. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin sau khi tieâm 3 thaùng 3.3.7. Khaûo saùt ñoä daøi baûo quaûn cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh Vibriosis cho caù muù vaø caù gioø 106 106 108 3.3.8. Thöû nghieäm vacxin ngoaøi thöïc ñòa 3.4. Nghieân cöùu cheá taïo vacxin phoøng beänh do vi khuaån Streptococcus gaây ra cho caù hoàng myõ 112 115 3.4.1. Thu maãu vaø phaân laäp vi khuaån gaây beänh cho caù hoàng myõ. 3.4.2. Gaây nhieãm thöïc nghieäm vaø xaùc ñònh lieàu LD50 cuûa 120 vi khuaån Streptococcus iniae treân caù hoàng myõ 121 3.4.2.1. Gaây nhieãm thöïc nghieäm 3.4.2.2. Xaùc ñònh lieàu LD50 cuûa vi khuaån Streptococcus iniae 3.4.3. Khaûo saùt söï phaùt trieån cuûa vi khuaån Streptococus iniae trong moät soá moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy 123 123 124 3.4.4. Cheá taïo vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh do Streptococus iniae gaây ra cho caù hoàng myõ 126 3.4.5. Kieåm tra voâ truøng, an toaøn vaø hieäu löïc cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh do Streptococus iniae gaây ra cho caù hoàng myõ 129 3.4.5.1. Kieåm tra voâ truøng vacxin 3.4.5.2. Kieåm tra ñoä an toaøn cuûa vacxin 129 3.4.5.3. Kieåm tra hieäu löïc cuûa vacxin 129 3.4.6. Khaûo saùt ñoä daøi mieãn dòch cuûa vacxin voâ hoaït pheøn chua phoøng beänh do vi khuaån Streptococcus iniae gaây ra cho caù hoàng myõ 130 131 3.4.6.1. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin sau khi tieâm 2 thaùng 3.4.6.2. Tyû leä baûo hoä cuûa vacxin sau khi tieâm 3 thaùng. 132 3.4.7. Khaûo saùt ñoä daøi baûo quaûn cuûa vacxin 132 Chöông 4: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 133 4.1. Keát luaän 135 4.2. Ñeà nghò 142 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 142 CAÙC PHUÏ LUÏC 143 144 152 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Ngheà nuoâi troàng thuûy saûn ôû nöôùc ta ñang ngaøy moät phaùt trieån vaø ñaõ trôû thaønh moät ngaønh thu ngoaïi teä chuû löïc, ñaëc bieät laø caù bieån vaø caùc loaøi caù nöôùc ngoït coù giaù trò kinh teá cao nhö caù tra, caù basa . . . Nhu caàu tieâu thuï trong nöôùc vaø xuaát khaåu ngaøy caøng cao. Ñeå taïo ra nhieàu saûn phaåm thì phaûi nuoâi coâng nghieäp taäp trung, tuy nhieân khi nuoâi coâng nghieäp taäp trung vôùi maät ñoä cao thì laïi taïo ñieàu kieän cho caùc beänh nhieãm khuaån coù ñieàu kieän phaùt trieån vaø laây lan maïnh. Vieäc duøng khaùng sinh ñeå ñieàu trò beänh ñoøi hoûi nhieàu toán keùm, hieäu quaû khoâng cao vaø löôïng toàn dö khaùng sinh aûnh höôûng ñeán chaát löôïng cuûa saûn phaåm. Ñeå haïn cheá caùc thieät haïi do beänh nhieãm khuaån gaây ra ôû caùc loaøi caù vaø naâng cao chaát löôïng saûn phaåm thì bieän phaùp duøng vacxin phoøng beänh laø kinh teá vaø cho hieäu quaû cao nhaát. Vôùi mong muoán goùp phaàn vaøo vieäc oån ñònh ngheà nuoâi troàng thuyû saûn vaø do nhu caàu caáp thieát cuûa thöïc teá chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi ”Nghieân cöùu vacxin phoøng beänh nhieãm khuaån cho caù Basa, caù Tra, caù Muù, caù Gioø, caù Hoàng Myõ nuoâi coâng nghieäp”. Ñeà taøi naøy ñaõ ñöôïc Boä Thuûy saûn vaø nay laø Boä NN vaø PTNT chaáp thuaän vaø caáp kinh phí thöïc hieän trong 3 naêm, töø thaùng 1/2006 ñeán thaùng 12/2008. 1 Chöông 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1.1. Beänh nhieãm khuaån cuûa caù tra, caù basa, caù muù, caù gioø, caù hoàng myõ 1.1.1. Beänh nhieãm khuaån treân caù tra (Pangasius hypophthamus) 1.1.1.1. Beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng cuûa caù tra Beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng ôû caù tra ñöôïc phaùt hieän laàn ñaàu taïi caùc trang traïi nuoâi caù coâng nghieäp oû Caàn Thô vaø Ñoàng Thaùp vaøo naêm 1999. Beänh ñöôïc moâ taû vôùi bieåu hieän laø caùc ñieåm hoaïi töû maøu traéng ñuïc chuû yeáu ôû gan, thaän, laùch cuûa caù tra, ñöôøng kính dao ñoäng töø 1 – 2,5mm, coù khi leân tôùi 3 mm. Beänh gaây cheát haøng loaït, laây lan treân dieän roäng vaø tæ leä cheát raát cao (30 -80%), beänh coù theå xaûy ra töø giai ñoaïn caù höông ñeán giai ñoaïn caù thòt vaø giaûm daàn sau giai ñoaïn 5 thaùng tuoåi. Daáu hieäu bieåu hieän beân ngoaøi nhö: bôi lôø ñôø quanh bôø, xuaát huyeát, loài maét, boû aên, … Nhöõng ñoám traéng thöôøng xuaát hieän ñaàu tieân vaø nhieàu ôû gan, thaän. Khi caù beäânh naëng, nhöõng toå chöùc naøy bò huyû hoaïi hoaøn toaøn. Vì vaäy khi beänh ñaõ xaûy ra vieäc duøng thuoác ñeå ñieàu trò chæ coù taùc duïng ñoái vôùi nhöõng con bò beänh nheï, tuy nhieân vieäc ñieàu trò cho hieäu quaû thaáp vaø thôøi gian bình phuïc laâu. Taùc nhaân gaây beänh ñöôïc bieát laø Edwardsiella ictaluri (Crumlish, 2002), Hafnia alvei vaø Plesiomonas shigelloides (Traàn Thò Minh Taâm vaø coäng söï, 2002), 1.1.1.2. Beänh xuaát huyeát treân caù tra Beänh xuaát huyeát treân caù tra thöôøng do moät soá vi khuaån gaây ra nhö: Aeromonas hydrophila, A. sobria, Pseudomonas sp, E. ictaluri vaø Streptococcus sp (Nguyeãn Vaên Haûo vaø coäng söï, 1996; Crumlish vaø coäng söï, 2002). Beänh xaûy ra treân taát caû caùc loaïi caù nuoâi beø ôû giai ñoaïn caù gioáng vaø caù thòt. Tyû leä cheát töø 30 -70%. Treân thaân caù beänh xuaát hieän nhöõng ñieåm xuaát huyeát nhoû li ti, beänh naëng caùc goác vaây xuaát huyeát, buïng caù tröông to chöùa ñaày hôi, trong xoang buïng chöùa nhieàu dòch maøu hoàng hoaëc maøu vaøng, thaønh ruoät xuaát huyeát. 2 1.1.2. Beänh nhieãm khuaån treân caù basa (Pangasius bocourti) 1.1.2.1. Beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng cuûa caù basa Beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng caù basa gioáng nhö beänh hoaïi töû cô quan noäi taïng caù tra veà caû trieäu chöùng beänh tích laãn nguyeân nhaân gaây beänh. 1.1.2.2. Beänh xuaát huyeát treân caù basa Beänh do caùc chuûng vi khuaån Aeromonas hydrophyla, Aeromonas salmonicida vaø Streptococcus sp gaây neân. Tyû leä gaây cheát khoaûng 60%. Caù beänh vôùi caùc beänh tích nhö vaønh moâi treân, döôùi bò xuaát huyeát, haàu heát caùc goác vaây bò xuaát huyeát. Khi beänh naëng, vaønh maét bò xuaát huyeát, maét loài ñuïc, buïng tröôùng to, gan xuaát huyeát, thuøy gan söng to, maøu taùi, laùch söng to, maøu ñen saäm. Daï daøy, ñoaïn ruoät ñaàu vaø giöõa xuaát huyeát, thaønh ruoät moûng, xoang buïng chöùa dòch maøu hoàng. 1.1.3. Beänh nhieãm khuaån treân caù muù (Epinephelus sp.) Nhoùm vi khuaån chính gaây beänh treân caù muù thuoäc gioáng Vibrio sp., trong ñoù taùc nhaân gaây beänh quan troïng laø V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi. Taïi Trung Quoác, vi khuaån Vibrio alginolyticus laø taùc nhaân beänh gaây thieät haïi naëng neà cho ngheà nuoâi caù muù (Qin vaø Pan, 1996; Zhu vaø coäng söï, 2000). Ngoaøi ra coøn coù caùc taùc nhaân vi khuaån khaùc nhö Pseudomonas sp., Pasteurella sp., Plexibacter sp. (Melba G., 2000) vaø Streptococcus sp. (Leong, 2001). Tyû leä cheát do vi khuaån gaây ra töø 20 – 60% vôùi nhöõng trieäu chöùng xuaát huyeát, lôû loeùt naëng ôû vuøng da, vaây vaø ñuoâi (Nash vaø coäng söï., 1987), coøn toån thaát do Streptococcus vaøo khoaûng 18% (Leong, 2001). Söï hieän dieän cuûa Flexibacter coù khaû naêng do ñieàu kieän nuoâi keùm, khi bò beänh do vi khuaån naøy, caù bieåu hieän maát thaêng baèng, coù nhöõng vuøng hoaïi töû ñoû treân thaân, tyû leä cheát cao coù theå leân ñeán 80% (Danayadol vaø coäng söï, 1996). Ngoaøi ra nhöõng thaát thoaùt gaây ra do vi khuaån khaùc vaøo khoaûng 12,7%. Beänh nhieãm khuaån thöôøng ñi keøm vôùi quaûn lyù moâi tröôøng nuoâi keùm vaø thöôøng gaây thieät haïi nghieâm troïng cho caù muù ôû giai ñoaïn öông (Baliao vaø coäng söï, 2000). 3 1.1.4. Beänh nhieãm khuaån treân caù gioø (Rachycentron canadum) Caù gioø thöôøng bò beänh Vibriosis (Rajan vaø coäng söï, 2001). ÔÛ Ñaøi Loan, vaøo naêm 2001, V. alginolyticus ñöôïc cho laø taùc nhaân gaây dòch beänh naëng neà treân caù gioø gioáng töø 8 -10g, thaân caù saãm laïi, hoaïi töû ôû vuøng buïng, moät soá caù coù hieän töôïng bò toån thöông ôû maét (Liu vaø coäng söï, 2004). Beân caïnh ñoù beänh Pasteurellosis, gaây bôûi Photobacterium damselae subsp. piscicida, cuõng thöôøng gaëp ôû caù gioø nuoâi loàng beø, ñaëc bieät vaøo muøa xuaân, tyû leä gaây cheát khoaûng 30% (Tung vaø coäng söï, 2000; Lopez vaø coäng söï, 2002), gaây beänh caáp tính ôû caù con. Khi bò beänh, thaân caù thöôøng chuyeån sang maøu ñen, ngoaøi ra khoâng coù bieåu hieän naøo roõ reät (Liu vaø coäng söï, 2003). 1.1.5. Beänh nhieãm khuaån treân caù hoàng myõ (Red drum) Taùc nhaân vi khuaån nguy hieåm nhaát ñöôïc bieát ñeán hieän nay treân caù hoàng myõ laø chuûng vi khuaån Streptococcus iniae. Caù beänh vôùi caùc trieäu chöùng laâm saøng nhö lôø ñôø, maét loài vaø maát phöông höôùng. Da bò toån thöông, daàn daàn daãn ñeán hoaïi töû. Beänh laâu ngaøy trôû thaønh maõn tính vôùi caùc daáu hieäu hoaïi töû treân da (Eldar vaø coäng söï, 1999). 1.2. Toång quan veà vacxin vaø mieãn dòch 1.2.1. Lòch söû phaùt trieån cuûa vacxin Ngöôøi ñeà xöôùng vaø söû duïng vacxin ñaàu tieân treân theá giôùi laø moät baùc só ngöôøi Anh teân laø Edward Jenner. Loaïi vacxin ñaàu tieân laø loaïi virut ñaäu boø duøng ñeå chuûng cho ngöôøi (beù Jame Phipps, 8 tuoåi) ñeå choáng laïi beänh ñaäu ra ñôøi vaøo naêm 1796. Vaøo cuoái theá kyû 19, nhaø khoa hoïc ngöôøi Phaùp Louis Pasteur thoâng qua caùc coâng trình nghieân cöùu vaø thaønh coâng röïc rôõ cuûa mình môùi thöïc söï laø ngöôøi môû ñaàu cho kyû nguyeân duøng vacxin vôùi muïc ñích phoøng beänh. Naêm 1881 Luis Pasteur ñaõ phaân laäp vaø nuoâi caáy ñöôïc vi khuaån Pasteurella multocida gaây beänh tuï huyeát truøng treân gaø, oâng laøm giaûm ñoäc löïc baèng caùch nuoâi caáy 4 laâu (7 ngaøy), roài duøng canh truøng naøy tieâm cho gaø, keát quaû laø gaø khoâng cheát sau khi coâng cöôøng ñoäc (Rimler vaø Glisson, 1997). Naêm 1890 Von Behring vaø Kitasato coù nhöõng nghieân cöùu ñaàu tieân veà vacxin giaûi ñoäc toá. Nhaø baùc hoïc Phaùp Ramon G laø ngöôøi ñaët neàn moùng cho nhöõng nghieân cöùu veà chaát boå trôï vacxin. Töø nhöõng naêm 1929 – 1930 oâng ñaõ tieán haønh nhieàu thí nghieäm so saùnh hoaït tính kích thích mieãn dòch khoâng ñaëc hieäu cuûa caùc chaát boå trôï vaø nhaän thaáy raèng: khi moät khaùng nguyeân ñöôïc tieâm cuøng vôùi moät chaát boå trôï ñeàu cho mieãn dòch cao hôn khi tieâm khaùng nguyeân rieâng moät mình. 1.2.2. Lôïi ích cuûa vieäc duøng vacxin - Nhieàu beänh khoâng theå trò baèng thuoác khaùng sinh hay khoâng kinh teá khi duøng thuoác. - Coù theå loaïi tröø maàm beänh. - Vacxin laø caùch phoøng beänh chuû ñoäng vaø hieäu quaû nhaát. - Do tính khaùng thuoác ngaøy caøng taêng cuûa vi khuaån gaây beänh. - Yeâu caàu veà chaát löôïng thöïc phaåm cuûa con ngöôøi ngaøy caøng cao. 1.2.3. Vacxin vaø nguyeân lyù taùc duïng Vacxin laø nhöõng cheá phaåm sinh hoïc chöùa khaùng nguyeân duøng ñeå kích thích heä thoáng mieãn dòch cuûa cô theå ñoäng vaät hoaït ñoäng. Sau khi duøng vacxin moät thôøi gian, thì tuøy thuoäc vaøo tính chaát vaø phöông phaùp söû duïng vacxin, caùc khaùng theå hoaëc teá baøo mieãn dòch ñöôïc taïo thaønh, coù theå baûo veä ñoäng vaät khoûi taùc ñoäng gaây beänh cuûa vi sinh vaät cuøng loaïi vôùi vacxin. Treân theá giôùi coù raát nhieàu loaïi vacxin khaùc nhau: Vacxin voâ hoaït, vacxin nhöôïc ñoäc, vacxin giaûi ñoäc toá, vacxin bieán ñoåi gen, vacxin taùi toå hôïp, vacxin DNA… Hieän nay treân thò tröôøng coù hai loaïi vacxin chính ñöôïc söû duïng roäng raõi: vacxin voâ hoaït vaø vacxin soáng nhöôïc ñoäc. Vacxin giaûi ñoäc toá chæ coù theå cheá taïo ñöôïc 5