Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex pcr phát hiện nhanh và đồng thời staphylococus aureus và salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã Số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN VĂN DUY Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Văn Duy. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Học viên Phạm Văn Phúc Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Công nghệ gen, Viện CNSH&CNTP, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; TS. Nguyễn Đắc Trung, phó trưởng khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên; ThS. Nguyễn Thị Lan Hương, cán bộ Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên; ThS. Đỗ Bích Duệ, cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã cung cấp các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; các cán bộ Bộ môn Vi sinh, Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên; các cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Tôi x . Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2013 Học viên Phạm Văn Phúc Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU......................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài .............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: ....................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài .......................................................................... 2 4.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................................... 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella ................ 3 1.1.1. Trên thế giới .............................................................................................................. 3 1.1.2. Ở Việt Nam ............................................................................................................... 6 1.2. Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus ........................ 7 1.2.1. Salmonella typhi ....................................................................................................... 7 1.2.1.1. Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi ................................................. 7 1.2.1.2. Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi ............................................... 10 1.2.1.3. Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi ............................................. 11 1.2.1.4. Đặc tính sinh học của Salmonella typhi ............................................... 12 1.2.1.5. Đặc tính gây bệnh của Salmonella typhi .............................................. 14 1.2.2. Staphylococcus aureus ........................................................................................... 15 1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus ...................................... 15 1.2.2.2. Cấu trúc di truyền của Staphylococcus aureus...................................... 18 1.2.2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus .................................... 18 1.2.2.4. Đặc tính sinh học Staphylococcus aureus ............................................. 19 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 1.2.2.5. Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus ....................................... 22 1.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi ..... 24 1.3.1. Các phương pháp vi sinh .......................................................................... 24 1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử .......................................................... 25 1.4. Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR ....................................................... 27 1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật multiplex PCR ................................................................ 27 1.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh……………………………………………………………………………….28 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 31 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 31 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................... 31 2.2.2. Thời gian nghiên cứu............................................................................................... 31 2.3. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................... 31 2.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài ........................................................................... 31 2.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài ................................................................................. 32 2.3.3. Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................................... 33 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 33 2.4.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi ................................................................................ 33 2.4.1.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Staphylococcus aureus .......... 33 2.4.1.2. Thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng bằng phản ứng PCR.............................................................................................................. 34 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA................................................................................. 35 2.4.2.1. Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sốc nhiệt .................................................. 35 2.4.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn bằng hóa chất .............................................. 36 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.4.2.3. Định lượng, kiểm tra chất lượng tách chiết DNA ................................. 37 2.4.3. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi ............................................................................................................ 38 2.4.4. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR ........... 39 2.4.5. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của multiplex PCR....................................... 39 Chƣơng 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ............................................................. 40 3.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi.................................................................... 40 3.2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR ........................................ 43 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn ...................................... 43 3.2.2. Nghiên cứu nồng độ DNA tối thiểu của các phản ứng PCR đơn phát hiện riêng rẽ Staphylococcus aureus và Salmonella typhi ............................................................... 45 3.2.3. Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi ............................................................................................... 47 3.2.4. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các chủng vi khuẩn thuần ……………………………………………………………………………..53 3.2.5. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các phương pháp tách chiết DNA khác nhau .................................................................................................................. 54 3.3. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. ................................ 56 3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. .............................................. 57 Chƣơng 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ......................................................... 60 4.1. Kết luận........................................................................................................ 60 4.2. Kiến nghị ..................................................................................................... 61 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 62 DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ ATTP An toàn thực phẩm ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol CFU Colony Forming Unit - Đơn vị đo khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate NĐTP Ngộ độc thực phẩm OD Optical Density - Giá trị mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp KauffmannWhite. ................................................................................................. 8 Bảng 1.2. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci ........... 22 Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 32 Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 32 Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu............................................... 33 Bảng 3.1. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. ......................................................................................................... 44 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc tế bào vi khuẩn S. typhi .......................................................... 9 Hình 1.2. Hình thái Staphylococcus aureus........................................................ 16 Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 42 Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu .................................................................................. 43 Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR (đường chạy 1-6) và sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi BS1-BS2 (đường chạy 712) sử dụng DNA khuôn ở các nồng độ khác nhau ........................................... 45 Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại của các phản ứng PCR phát hiện riêng rẽ S. typhi (đường chạy 1-12) và S. aureus (đường chạy 13-24) ở các điều kiện hàm lượng MgCl2 và nhiệt độ gắn mồi khác nhau. ....................... 48 Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR với cặp mồi BS1BS2 và NucF-NucR ở nồng độ 0,6 µM sử dụng khuôn là hỗn hợp 1,8 ng/µl DNA tổng số của S. typhi và 2,0 ng/µl DNA tổng số của S. aureus. .................. 49 Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các nồng độ mồi khác nhau........................................................................................ 51 Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR trên các chủng Salmonella typhi và Staphylococcus aureus ....................................................... 54 Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR khi sử dụng 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau ............................................ 55 Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi và S. aureus .................................... 57 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ x Hình 3.10. Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR trên các chủng vi khuẩn kiểm định. ..................................................................... 58 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong những năm trở lại đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm (ATTP) đang là mối quan tâm đặc biệt ở nước ta và nhiều nơi trên thế giới. Thực tế hiện nay thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, gia cầm bán ở các chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lượng. Chính vì vậy con người có thể bị nhiễm vi sinh vật thông qua thức ăn sống hoặc nấu chưa chín như thịt, gia cầm, trứng và các sản phẩm sữa [54]. Điều đó cũng lý giải vì sao mà hàng năm có rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy ra. Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm có xu hướng ngày càng tăng [37]. Trung bình cứ 1.000 dân có 175 người bị NĐTP mỗi năm và chi phí cho 1 ca NĐTP mất 1.531 đôla Mỹ (FDA 2006). Ở Việt Nam theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) từ đầu tháng 4/2012 đến hết tháng 12/2012 cả nước đã xảy ra 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập viện và đã có 04 trường hợp tử vong. Phần lớn các vụ NĐTP xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật. Đặc biệt vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhi) và tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là thủ phạm chính gây ra các vụ NĐTP. Để phát hiện Salmonella typhi và Staphylococcus aureus, phương pháp chủ yếu hiện nay vẫn được sử dụng là phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường đặc hiệu. Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra sinh hóa tốn nhiều thời gian (từ 4 đến 5 ngày theo ISO 6579:2003) [37], [44], [54]. Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân góp phần giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và gây ảnh hưởng đến công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm trong cộng đồng. Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gen đặc hiệu cho các loài vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Staphylococcus và Salmonella đã được hiểu biết khá đầy đủ. Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu loài. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, multiplex PCR, ELISA, DNA arrays… Trong đó multiplex PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, cho phép phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh chỉ trong một phép phân tích [7], [44]. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu và được sự chấp thuận của Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Xây dựng được kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. 3. Nội dung nghiên cứu * Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR. * Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR. * Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. * Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm. Tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển bộ kít phát hiện nhanh hai loài vi khuẩn gây bệnh này trong mẫu thực phẩm. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 Kết quả nghiên cứu sẽ tạo tiền đề phát triển bộ kít phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm góp phần giám sát chất lượng ATTP. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella 1.1.1. Trên thế giới Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng một loại thức ăn [63]. Ngộ độc thực phẩm có những triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy…hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc [63]. Thực phẩm nhiễm các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở cả các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát triển [44]. Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm. Các triệu chứng lâm sàng khá đa dạng, từ mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy cơ tử vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống của bệnh nhân. Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng. Thể hiện, mỗi năm ở Mỹ có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện và 5 nghìn ca tử vong. Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm [51]. Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm các mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc. Trong số Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh. Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virút, trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% số ca bệnh tử vong ở người. Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất và phân phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt đã làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao. Số ca mắc các bệnh do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [51]. Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh trực tiếp từ thực phẩm vẫn chưa được phát hiện đầy đủ. Tại Mỹ, chỉ có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong do nhiễm độc thực phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân [51]. Trong số các nguyên nhân đã được xác định, có một số mầm bệnh có khả năng gây nhiễm trùng, nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica. Tụ cầu vàng gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm và hàng năm Mỹ mất khoảng 1,5 tỉ đô la cho những vụ ngộ độc do tụ cầu [57]. Ngoài vấn đề viện phí còn phải mất nhiều thời gian làm việc cũng như sản phẩm lao động của người bệnh, và cả việc phải loại bỏ những sản phẩm bị nhiễm. Vụ ngộ độc lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan do phomai. Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt bò bị nhiễm vi sinh vật. Thịt bò bị nhiễm tụ cầu vàng cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm 1907. Năm 1914 ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã gây ra ngộ độc ở người. Năm 1930, Dark lại xác định được vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh giáng sinh [50]. Cách đây vài thập niên, các vụ ngộ độc do tụ cầu chiếm 25% các vụ ngộ độc thực phẩm ở Mỹ [57]. Từ năm 1988 đến 1992, S. aureus gây ra 5,1% trong Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 số các vụ ngộ độc ở Châu Âu [57]. Từ năm 1988 đến 1996, ở Đức xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng gây ra và vào năm 2000 lại xảy ra một vụ dịch làm 297 người bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu vàng [14]. Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng tại một trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng [74] . Ở Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu vàng [28]. Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm [28]. Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc [2]. Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S. aureus cao là Indonesia và Philippines. Ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc S. aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 1478 người bị ngộ độc ở vùng Kansai. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có nhiễm S. aureus của tập đoàn Snow. Còn ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ NĐTP ở trẻ em vì uống sữa bị nhiễm S. aureus [2]. Ngày 1/1/2006 tại Allanta đã xảy ra một đợt truyền nhiễm vi khuẩn Salmonella có liên quan tới thực phẩm đã làm ngã bệnh 172 người ở 18 tiểu bang, 11 người phải vào bệnh viện. Thực phẩm bị nghi nhiễm Salmonella gồm: rau diếp và cà chua ở các tiệm ăn và siêu thị. Ngày 26/12/2007 Ban kiểm dịch và an toàn thực phẩm của Bộ Nông nghiệp Mỹ (FSIS) phát hiện vi khuẩn Salmonella trong thịt bò tươi ở các cửa hàng và các kho chứa tại các siêu thị ở Arinoza, California, Hawaii, Nevada và New Mexico. Đã làm 38 trường hợp bị mắc bệnh [9]. Ngày 9/7/2008 tại Mỹ đã có trên 1000 người bị ngã bệnh vì vi khuẩn Salmonella, được xem là con số lớn nhất từ 10 năm qua tại Mỹ vì NĐTP. Thủ phạm chính bị nghi ngờ là cà chua, ớt đỏ và ngò tươi. Tốc độ nhiễm trung Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 bình là 25-40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang. Tại Canada cũng có 4 trường hợp [9]. 1.1.2. Ở Việt Nam Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng để lại hậu quả không nhỏ. Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu đô la. Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong [3]. Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40 - 45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là vi khuẩn Staphylococcus aureus và vi khuẩn Salmonella typhi [8]. Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), patê (83,3%). Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [10]. Qua các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) [6], [8]. Điển hình là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh vào ngày 27/7/2006 trong chuyến đi thực tế đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa). Vụ ngộ độc làm tất cả 105 người phải vào bệnh viện để cấp cứu. Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, lại để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tố enterotoxin [4]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 Theo thống kê của Cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm năm 2002, trong tổng số 269 vụ ngộ độc theo dõi từ năm 1983-1989 có 5756 người mắc, tử vong 156 (2,7%) mà nguyên nhân chủ yếu là do Salmonella. Ngày 16/5/2005 vụ ngộ độc kem Tràng Tiền làm 13 người gia đình chị Ngô Mai Lan phải vào viện Bạch Mai. Nguyên nhân chính là do trong kem nhiễm vi khuẩn Salmonella [9]. Tình trạng ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn mà còn diễn ra phổ biến ở nhiều địa phương khác trên cả nước [73]. Từ dữ liệu của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm thì năm 2005 số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 141 vụ, làm 4291 người bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi sinh vật gây ra [8]. 1.2. Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 1.2.1. Salmonella typhi 1.2.1.1. Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di động được. Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella, trong đó Kauffmann White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng nguyên H [29]. Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng của màng tế bào. Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường. Những thay đổi trong thành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng nguyên O khác nhau. Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4 [29]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau [29]. Tuy nhiên hoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được biểu hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn [29]. Hai kháng nguyên H này được xếp vào pha 1 và pha 2. Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2. Ngoài ra, một số tuýp huyết thanh “đơn pha” do tự nhiên như S. enteriditis, S. typhi. Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã. Trong đó S. typhi thuộc phân loài I [27]. Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp KauffmannWhite [27]. Loài và phân loài Salmonella Số lƣợng tuýp huyết thanh trong mỗi phân loài Vật chủ S.enterica subsp.enterica (I) 1454 Động vật máu nóng S.enterica subsp.salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và môi trường S.enterica subsp.arizonae (IIIa) 94 Động vật máu lạnh và môi trường S.entericasubsp.diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường S.enterica subsp.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường S.bongori (V) 20 Động vật máu lạnh và môi trường S.enterica subsp.indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường Tổng cộng: 2463 tuýp huyết thanh Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/