Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm aspergillus oryzae n2 koji tương nuôi cấy trên môi trường bán rắn cám gạo trong quy trình sản xuất nước tương.

Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC 1 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3-MCPD : 3-monochloropropane-1,2-diol A.oryzae : Aspergillus oryzae FAO : Food and Agriculture Organization EMB : Eosin Methylene Blue PCA : Plate Count Agar EC : European Conmunity LSB : Least Significant Bit BGBL : Brilliant Green Bile Lactose SPSS : Statistical Package to the Social Sciences g/l : gam/lít µm : micromet ml : mililit 2 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG 3 3 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nước tương là loại nước chấm chế biến từ đậu nành được tiêu dùng rộng rãi trên thị trường từ lâu đời và đã trở thành một loại nước chấm không thể thiếu trên thị trường Việt Nam. Nguyên liệu chính để sản xuất nước tương là đậu nành rất giàu đạm thực vật nên tốt cho sức khỏe người tiêu dùng [1]. Nước tương lên men có nguồn gốc từ thực vật là dịch thủy phân nguồn đạm có trong nguyên liệu. Tác nhân thủy phân có thể là enzyme do vi sinh vật tiết ra, có thể là acid như HCl (nước chấm hóa giải). Nước chấm lên men thuần túy là nước chấm cổ truyền ở các nước Á Châu. Tuy nhiên thời gian thủy phân kéo dài hàng tháng, giá thành cao. Vì vậy trong một thời gian dài nước tương được sản xuất ở Việt Nam là nước chấm hóa giải. Gần đây người ta phát hiện trong nước tương hóa giải bằng HCl có chứa nhiều 3-MCPD (3-monochloropropane-1,2-diol) có khả năng gây ung thư, vì vậy có xu hướng quay trở về công nghệ truyền thống. Một số quy trình sản xuất nước chấm an toàn (về 3-MCPD) được sản xuất bằng cách kết hợp lên men và hóa giải đã được triển khai [7]. Một trong những tính năng đặc biệt của việc sử dụng Aspergillus oryzae trong quá trình lên men truyền thống của Nhật Bản là việc sử dụng môi trường nuôi cấy ở trạng thái rắn (hạt gạo, đậu nành, cám lúa mì). Quá trình lên men này có nguồn gốc từ 3000-2000 năm trước tại Trung Quốc. Công nghệ này đã được nhập khẩu vào Nhật Bản từ thế kỷ 13-15 [32]. Nhật Bản là một trong những quốc gia có những sản phẩm lên men truyền thống lâu đời nhất, ứng dụng trong các sản phẩm đó là nhờ sự phát hiện ra loại mốc “koji” ngay từ rất sớm. “Koji” là mốc cấy trên gạo, lúa mạch hoặc đậu nành, nó hoạt động như một chất mồi cho quá trình lên men. Truyền thống này đã được thực hiện ít nhất 500 năm ở Nhật Bản và tạo ra nhiều sản phẩm có tiếng như rượu sake, tương miso,... Tuy nhiên việc ứng dụng koji trong chế biến thực phẩm vẫn còn lạ lẫm với Việt Nam và nhiều nước trên thế giới [44]. Xuất phát từ những thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cám-gạo) trong quy trình sản xuất nước tương” 4 4 Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 2 TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Đậu nành 2.1.1.1. Đặc điểm của đậu nành Đậu nành là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Khó có thể tìm được một loại cây trồng nào có giá trị kinh tế như cây đậu nành. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp và là cây cải tạo đất tốt. Vì thế cây đậu nành còn được gọi là “ông hoàng của các loại cây họ đậu” [3]. Cây đậu nành có xuất xứ từ Trung Quốc, và được biết đến vào khoảng năm 1700-1100 trước công nguyên hoặc sớm hơn rồi dần được du nhập vào Triều Tiên, Nhật Bản, Malayxia, các nước Đông Dương, trong đó có nước ta [14], [15]. Đậu nành tên khoa học là Glycine max thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidae) có nguồn gốc từ cây đậu nành hoang dại (Glycine ussurensis) dạng thân leo, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [29]. Hình 2.1. Cây đậu nành [45] Từ hạt đậu nành người ta có thể chế biến ra rất nhiều sản phẩm bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men, … như: giá, bột, đậu phụ, chao, sữa đậu nành, nước tương, sốt,… đến các sản phẩm có giá trị cao như: protein đậu nành, thịt nhân tạo,… Sở dĩ, đậu nành được sử dụng để chế biến ra nhiều sản phẩm như vậy là do trong hạt đậu nành có thành phần dinh dưỡng cao, giàu vitamin, muối khoáng. Đặc biệt quan trọng nhất là protein, protein của đậu nành có phẩm chất tốt nhất trong số các protein của thực vật, protein đậu nành dễ tiêu hóa không có cholesterol. Hàm lượng 5 5 Khóa luận tốt nghiệp protein trong đậu nành còn cao hơn cả thịt, cá và cao gấp hai lần so với protein có trong các loại đậu đỗ khác. Ngoài ra, đậu nành còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu nành hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, thận, dạ dày và ruột, là sự lựa chọn cho những người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp,… Bên cạnh đó, bã từ bột đậu nành đã ép lấy dầu có thể dùng làm nguyên liệu để chế biến thức ăn tinh, hỗn hợp giàu đạm cho gia súc, gia cầm. Mặt khác, thân lá của cây đậu nành cũng có thể dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm [15]. Đậu nành là cây lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất của thế giới, đứng hàng thứ tư sau cây lúa nì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích nghi khá rộng nên đậu nành đã được trồng ở khắp năm châu, nhưng tập trung nhiều nhất là châu Mỹ khoảng 73%, tiếp đến là châu Á khoảng 23%,... Sản lượng đậu nành hàng năm trên thế giới đạt khoảng 103-114 triệu tấn (FAO, 1992). Ở nước ta, diện tích gieo trồng đậu nành chỉ mới chiếm một tỷ lệ nhỏ trong tổng diện tích gieo trồng (1,5-1,6%), và tập trung chủ yếu ở bốn vùng: các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc, vùng đồng bằng sông Hồng, miền Đông Nam Bộ, vùng đồng bằng sông Cửu Long [7], [15]. 2.1.1.2. Thành phần hóa học của đậu nành Bảng 2.1. Thành phần hóa học của hạt đậu nành [7] Thành phần, % trọng lượng khô Các thành phần của hạt Protein Lipid Tro Carbohydrat đậu nành (%) (%) (%) (%) Hạt nguyên 40 20 4,9 35 Tử diệp 43 23 5 29 Vỏ hạt 8,8 1 4,3 86 Phôi 41 11 4,4 43 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành gồm: 35-45% protein, 15-20% chất béo, 35% carbohydrates, nước 8%, các chất vô cơ 5%, các muối khoáng Na, K, Ca, S, P, Mg, Fe, các vitamin A, B1, B2, D, E, F, các enzyme, sáp, nhựa và cellulose. Ngoài ra, đậu nành còn là nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể như: leucine, isoleucine, methionine, valine, tryptophan, phenylalanine, threonine, lysine [7]. 2.1.1.3. Đặc trưng cơ bản của các thành phần hóa học trong đậu nành Đậu nành có thành phần dinh dưỡng cao, đậu nành là thức ăn vô cùng bổ dưỡng. Hàm lượng protein trung bình 35-45% và cao gấp đôi so với các loại đậu 6 6 Khóa luận tốt nghiệp khác. Ngoài ra, trong hạt đậu nành còn có nhiều vitamin B hơn bất cứ loại đậu nào, đậu nành cũng chứa nhiều vitamin A, D và các chất khoáng,… [4], [11]. • Protein Đậu nành có nhiều protein hơn thịt, nhiều canxi hơn sữa bò và nhiều lecithin hơn trứng, các acid amin cần thiết mà cơ thể không tạo ra được cũng đều có đủ trong đậu nành. Protein của đậu nành dễ tiêu hóa, không có các thành phần tạo cholesterol, không có các dạng acid uric [3]. Ngày nay, người ta còn phát hiện thêm trong đậu nành có chứa chất lecithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể [4]. Trong thành phần protein đậu nành chủ yếu là globulin (85-95%) và gồm các acid amin không thay thế như: tryptophan, isoleucine, leucine, phenylalanine,… Trong đó, hàm lượng của các acid amin chứa lưu huỳnh như: methionine, cystine,… của đậu nành rất gần với hàm lượng các chất này của trứng. Hàm lượng của casein, đặc biệt là lizin rất cao [14]. Bảng 2.2 Thành phần các acid amin không thay thế trong đậu nành [29] Thành phần Tryptophan Leucine Isoleucine Lysine Phenylalanine Threonine Valine • Hàm lượng 1,1 8,4 5,8 6 3,8 4,8 5,8 Vitamin và khoáng chất Trong hạt đậu nành chứa khá nhiều các loại vitamin, cả tan trong dầu và tan trong nước, đặc biệt, hàm lượng của vitamin B2 và B1. Ngoài ra, trong đậu nành còn có các loại vitamin như: PP, A, E, K, C, D,…[13]. Trong hạt đậu nành khô chứa 5% khoáng, trong số những nguyên tố khoáng đa lượng hiện diện trong đậu nành điển hình nhất là muối của K tiếp đó tới các loại muối khoáng của P, Mg, S, Ca, Cl, Na. Hàm lượng trung bình của các nguyên tố khoáng này nằm trong khoảng 0,2-2,1%. Với những nguyên tố khoáng vi lượng thì 7 7 Khóa luận tốt nghiệp gồm có: Cu, Zn, Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lượng của những nguyên tố khoáng vi lượng này dao động khoảng 0,01-140 ppm [3], [15]. Bảng 2.3 Thành phần vitamin trong đậu nành [7] Thành phần Thiamine Riboflavine Vitamine E • Hàm lượng (µg/g) 6,25-6,85 0,92-1,19 α-tocopherol 10,9-28,4 τ-tocopherol 150-190 δ-tocopherol 24,6-72,5 Lipid Hạt đậu nành có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật. Hàm lượng lipid trong đậu nành khoảng 15-20%, lipid của đậu nành chứa một tỷ lệ các acid béo chưa no cao gồm: oleic, linoleic và linolenic acid, 2 acid béo linoleic và linolenic không thể thiếu đối với cơ thể [3], [13], [15]. Bảng 2.4 Thành phần lipid trong đậu nành [7] Thành phần Hàm lượng (%) Palmitic 4-23 Stearic 3-30 Oleic 25-86 Linoleic 25-60 Linolenic 1-15 Carbohydrates: Trung bình trong đậu nành carbohydrates chiếm khoảng 35%. Trong số đó carbohydrates có tính tan gồm: raffinose, stachyose và sucrose. Những carbohydrates không tan chủ yếu gồm: cellulose, hemicellulose, pectin và một phần nhỏ tinh bột [3],[13]. Thành phần chính trong carbohydrates đậu nành là những oligosaccharides và những polisaccharides phức tạp, trong đó carbohydrates phức tạp chiếm khoảng 86%. 8 8 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 2.5 Thành phần glucid trong đậu nành [7] Thành phần Hàm lượng (%) Sucrose 5,5 Raffinose 0,9 Stachyose 3,5 Thành phần hóa thảo mộc trong hạt đậu nành: Những thành phần hóa thảo mộc trong đậu nành gồm có: isoflavon, saponins, lecithin, trypsin inhibitor, lectins, phytosterol,… [3], [15]. 2.1.2. Tổng quan về chế phẩm Aspergillus oryzae 2.1.2.1 Đặc điểm nấm mốc Aspergillus oryzae Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương là một loài nấm sợi có tên khoa học là Aspergillus oryzae. Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để đường hóa gạo khi làm rượu Sake. Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine [46]. Giống nấm mốc dùng trong sản xuất nước chấm có thể là Aspergillus oryzae, Aspergillus soyae, Aspergillus teriol, Aspergillus niger... [7]. Aspergillus oryzae sinh trưởng dạng hệ sợi, bao gồm các sợi rất mảnh chiều ngang 5-7 mm, phân nhánh nhiều, có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào [8]. Nấm mốc Aspergilus oryzae sinh ra các enzyme như: amylose, invetose, maltose, protease có khả năng phân giải tinh bột thành đường, protein thành các acid amin. Nấm mốc Aspergillus oryzae đã được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các sản phẩm lên men ở Châu Á, do đó protease từ loại này có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nước tương và các sản phẩm khác [36]. Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất tương [41]. 2.1.2.2. Giới thiệu về koji tương  Khái niệm: Koji là một trong những thành phần quan trọng nhất được coi là giống khởi động để sản xuất một số thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản. Tên khoa học của Koji là Aspergillus oryzae . Koji có chứa một hệ các enzyme thủy phân được tạo thành trong nấm mốc sinh trưởng trên các cơ chất chứa tinh bột. Các enzyme này (gluco amylo, α-amyloza, proteaza) thủy phân tinh bột và 9 9 Khóa luận tốt nghiệp protein thành các chất có trọng lượng phân tử thấp. Tùy thuộc sản phẩm cuối cùng, các chủng nấm mốc khác nhau được sử dụng để sản xuất koji như: Aspergillus oryzae, Aspergillus awamoki, Aspergillus kawachi, Aspergillus niger,... [47]. Koji không thực sự là một loại nấm men, như nhiều người nhầm tưởng. Koji là mốc Aspegillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường cám-gạo, lúa mạch hoặc đậu nành.Ở Nhật Bản koji được nuôi cấy tự nhiên và được gọi là koji-kin. Nó được sử dụng trong chế biến các sản phẩm như: nước tương, miso, mirin và sake [48].  Đặc điểm: Koji có chứa một hệ các enzyme thủy phân được tạo thành trong nấm mốc sinh trưởng trên các cơ chất chứa tinh bột. Các enzyme thủy phân này (glucoamylase, α-amylase, protease) để thủy phân tinh bột và protein thành các chất có trọng lượng phân tử thấp. Koji được nuôi cấy từ hạt gạo, hạt lúa mì hoặc đậu nành. Đó là một thành phần quan trọng trong việc sản xuất của các loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản như sake, miso và shoyu. Các loại mốc koji khác nhau được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm khác nhau. Aspergillus oryzae là nấm mốc được sử dụng để sản xuất koji rộng rãi nhất. Đối với malt sản xuất bia, mốc koji cung cấp enzyme cần thiết để phân hủy các chất nền cho quá trình lên men thực phẩm [49]. Koji đậu nành là chế phẩm Aspergillus oryzae giàu hoạt lực protease thường được sản xuất bằng cách nuôi cấy mốc trên các cơ chất như đậu nành, ngô, gạo hay cám mì có bổ sung trấu để tăng độ thoáng khí. Chế phẩm Aspergillus oryzae được ứng dụng phổ biến trong sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành [23]. Koji (Aspergillus oryzae) có lẽ đã được thuần hóa ít nhất 2.000 năm trước đây. Nó được sử dụng cho các sản phẩm sake, mirin, shochu, awamori (một thức uống Okinawa), dấm gạo, nước tương và miso. Không có gì ngạc nhiên khi nó được tuyên bố thành kokkin (nấm quốc gia) do Hiệp hội Bia của Nhật Bản và các gen được bảo vệ chặt chẽ cho đến năm 2005. Bên cạnh đó, nó cũng được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc và Hàn Quốc để lên men các thực phẩm khác nhau. Để sử dụng Koji, bào tử được trộn vào cơm trắng (khoai tây, lúa mì và đậu nành cũng được sử dụng, tùy thuộc vào mục đích), sau đó được ủ trong một khoảng thời gian, ở một môi trường ấm áp 30 0C. Các Koji biến tinh bột trong gạo thành đường (một quá trình được gọi là đường hóa) và tạo thành một loạt các acid béo 1 0 10 Khóa luận tốt nghiệp và acid amin trong đó có glutamate, là cơ sở cho các "vị thứ năm," umami. Hỗn hợp Koji lúa này được gọi là kome-Koji [50]. Khi koji được sử dụng trong chế biến thức ăn, protease sẽ phân hủy protein để sản xuất acid amin bao gồm glutamate. Acid amin này cho ra umami, tạo hương vị thơm ngon cho món ăn. Các hương vị của umami kết hợp với thị hiếu khác vòng tạo ra hương vị của món ăn. Amylase phá vỡ tinh bột để tạo thành các loại đường đơn giản như glucose khi làm amazaké [51]. Mặt khác, lúa mì rang và đậu nành hấp chín đã khử chất béo thường được người Nhật sử dụng để sản xuất koji. Đáng chú ý, trong lúa mì rang và đậu nành hấp chín có chứa protease và amylase có chất lượng vượt trội. Nước tương koji, có màu xanh đậm, mùi thơm, vị ngọt và hơi đắng. Trong giai đoạn lên men koji, protein phá vỡ các chuỗi axit amin bằng enzyme phân giải protein, đặc biệt bởi protease trung tính và kiềm. Polysaccharides được thủy phân thành oligosaccharides, disaccharides và monosacarit, chủ yếu là do amylase của nấm mốc tiết ra, lipid cũng được thủy phân bởi các lipase có trong koji [21].  Phân loại: Theo hình dáng sản xuất: Koji được sản xuất ra dưới dạng bánh thì gọi là mochi-koji, còn dưới dạng hạt thì gọi là bara-koji. Quá trình sản xuất ra koji gọi là sei-koji. Nấm này còn được dùng ở Nhật Bản để sản xuất tương Nhật từ đậu nành, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là shoyu (soy sauce) [52]. Theo màu sắc: Koji được phân loại với 3 dạng màu sắc khác nhau: kuro (màu đen), shiro (màu trắng) và Kii (màu vàng). Các loại koji khác nhau về màu sắc do quá trình sản xuất được nuôi cấy bởi các loại nấm mốc khác nhau như: Aspergillus oryzae tạo koji vàng, Aspergillus awamoki và Aspergillus niger tạo mốc koji đen, Aspergillus kawachi tạo mốc koji trắng [54]. - Koji vàng (kii koji): đã tồn tại ở Nhật Bản nhiều năm. Nó đã được sử dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm. Kii-koji rất nhạy cảm với nhiệt độ và thích hợp với khí hậu lạnh, Kii-koji hiếm khi được sử dụng. Đầu những năm 1990, việc sử dụng Kii-koji đang dần tăng lên, nhưng trên một cơ sở rất hạn chế. Một loạt các nguyên vật liệu có thể được sử dụng kết hợp với Kii-koji: gạo (kome), khoai lang, lúa mạch (mugi). Shochu sản xuất với Kii-koji thường có màu sắc đẹp và mùi trái cây [53]. 1 1 11 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.2. Koji vàng (kii koji) [53] - Koji đen (kuro koji): Trong lịch sử, kuro - koji có nguồn gốc ở Okinawa để sản xuất rượu Awamori, ngày nay nó vẫn được sử dụng hầu hết để sản xuất Awamori. Kuro-koji bền hơn Kii koji màu vàng, phù hợp với khí hậu cận nhiệt đới. Mặc dù có thể tạo ra hương vị đặc biệt, hầu hết các nhà sản xuất cuối cùng cũng loại bỏ kuro - koji vì lý do vệ sinh. Kuro-koji kết hợp phổ biến với khoai lang, shochu và Awamori [53]. Hình 2.3. Koji đen (kuro koji)[53] - Koji trắng (shiro koji): Shiro koji được phát hiện vào năm 1923 khi Genichiro Kawachi (người đã giới thiệu kuro-koji ) chứng kiến một sự biến đổi trong kurokoji. Điều này dẫn đến việc nghiên cứu sâu hơn cho đến khi ông có thể xác định làm thế nào để nuôi cấy nó độc lập. Cuối cùng Shiro-koji thay thế kuro-koji để ngăn chặn các điều kiện vệ sinh khủng khiếp gây ra bởi kuro-koji. Các nhà sản xuất nhận ra một số lợi ích từ việc sử dụng shiro-koji: độ bền, dễ dàng phổ biến rộng rãi và đẩy mạnh quá trình đường hóa. Shiro-koji shochu có đặc điểm là dễ uống, nhẹ và sạch [53]. Hình 2.4. Koji trắng (shiro koji) [54] 1 2 12 Khóa luận tốt nghiệp • • Phân loại theo nguyên liệu sản xuất có 3 loại: koji gạo, koji lúa mì và koji đậu nành [55]. Giống đưa vào sản xuất phải có các điều kiện như sau [5]: - Ảnh hưởng tốt đối với hương thơm - Hoạt lực của men protease cao - Sức phát triển mạnh và chống tạp khuẩn tốt - Không sinh độc tố aflatoxin 2.1.2.2. Ứng dụng Nấm Aspergillus oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế tạo tương và nước tương do Aspergillus oryzae lên men ngon hơn các tương khác, vì loại mốc này có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt. Hai loài không độc làm tương là Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với 2 loài rất nguy hiểm là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tố Aflatoxin gây bệnh ung thư [41]. Aspergillus oryzae tham gia vào quá trình sản xuất tương và rựu vang [28] Bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae hiện đã được phân tích và biết rất kỹ vào năm 2001. Nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau (amylase, protease, lipase, hemicellulase, cellulase, oxidoreductase, phytase, pectinesterase…) [41]. Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine. Năm 1894 ông lấy được bằng sáng chế về quá trình sản xuất men đường hóa, trình bày phương pháp nuôi nấm sợi Aspergillus trên cám và dùng cồn để chiết xuất ra men amylase (men đường hóa tinh bột). Sau đó Takamine đã chứng minh được men này có thể ứng dụng trong y học và ông nhận được Bằng sở hữu trí tuệ. Mặc dù nghề làm tương ở Việt Nam và nghề làm sake ở Nhật Bản đã có từ lâu đời, nhưng việc chiết rút ra enzyme và sản xuất chế phẩm enzyme thì Takamine là người đi tiên phong [41]. Chế phẩm này được ứng dụng phổ biến trong quá trình sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành, cá hoặc từ thịt nhằm thúc đẩy quá trình lên men, tăng chất lượng của sản phẩm và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm [18]. Nấm mốc Koji đẩy mạnh quá trình lên men của cây họ đậu trong đó có tương miso và nước tương [28]. 1 3 13 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.5. Hình ảnh nấm mốc Aspergilus oryzae [56] Khi mốc phát triển điều khắp và chằng chịt là lúc các enzyme đang tiến hành phân giải protein trong hạt đậu thành các acid amin tự do và một phần đường [41]. 2.2. GIỚI THIỆU VỀ NƯỚC TƯƠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG 2.2.1. Giới thiệu về nước tương 2.2.1.1. Đặc điểm của nước tương Nước tương là một món ăn dạng lỏng, chủ yếu là acid amin với muối, có hương vị đặc trưng. Trong bữa ăn dùng để chấm hoặc trong nấu nướng dùng làm gia vị. Nước tương còn được gọi là xì dầu hoặc xắng sáu [20]. Nước tương đã được thêm vào trong các món ăn truyền thống của nhiều khu vực Đông Á và trở thành nền văn hóa Đông Nam Á. Nước tương được sử dụng rộng rãi như ở Thái, Trung Quốc, Hàn Quốc và món ăn Nhật Bản. Mặc dù xuất hiện ở nhiều nước, nhưng nước tương sản xuất trong các nền văn hóa khác nhau và các vùng khác nhau thì có sự khác nhau trong hương vị, mùi thơm và độ mặn [35]. Nước tương là một chất lỏng mặn, màu nâu sẫm với một hương thơm riêng biệt. Nó là đại diện gia vị mặn trong nấu ăn Phương Đông, nhưng nó ngày càng phổ biến ở nhiều khu vực khác trên thế giới. Công nghiệp hóa đã làm thay đổi quá trình sản xuất, thay đổi các nguyên liệu được sử dụng, tiêu chuẩn hóa sản phẩm và sửa đổi phần nào đặc tính của nó [42]. Các thành phần chính của nước tương là đậu nành, bột mì, muối và nước. Trung tâm của quá trình sản xuất là quá trình lên men phức tạp, theo đó cacbonhydrate lên men thành rượu và acid lactic, các protein bị phá vỡ thành 1 4 14 Khóa luận tốt nghiệp các peptide và acid amin. Các phản ứng đó tạo ra màu sắc, độ đặc và mùi thơm của nước tương. Quá trình sản xuất nước tương được chia thành 3 giai đoạn: chuẩn bị chế phẩm Aspergillus oryzae, ngâm nước muối lên men và tinh chế sản phẩm [42]. Hình 2.6. Hình ảnh nước tương [57] Nước tương đậu nành là một trong những gia vị lâu đời nhất trên thế giới và đã được sử dụng ở Trung Quốc trong hơn 2.500 năm. Nó được làm từ một hỗn hợp lên men của đậu nành nghiền, muối và các enzyme. Nước tương là dịch thủy phân nguồn đạm có trong nguyên liệu [41]. Tác nhân thủy phân có thể là enzyme do vi sinh vật tiết ra, có thể là acid như HC1 (nước chấm hóa giải). Nước tương được sản xuất từ các nguyên liệu giàu protein bằng hai phương pháp: vi sinh vật và hóa học. Nước tương lên men thuần túy là nước tương cổ truyền ở các nước Á châu. Tuy nhiên thời gian thủy phân kéo dài hàng tháng, giá thành cao. Vì vậy trong một thời gian dài hầu hết nước tương được sản xuất ở Việt Nam là nước chấm hóa giải. Các phương pháp lên men phải mất đến sáu tháng để hoàn thành với vị và hương thơm hài hòa. Các loại nước chấm không ủ chỉ mất hai ngày để thực hiện và thường mờ nhạc về hương vị và mùi thơm. Nước tương đậu nành đã được sử dụng để tăng cường hương vị của nhiều loại thực phẩm, bao gồm thịt gà, thịt bò, súp, mì ống và món rau khai vị [4]. Nước tương trên thị trường bao gồm các sản phẩm thủy phân hóa học và nửa còn lại bao gồm các loại lên men truyền thống. Tuy nhiên người tiêu dùng có xu hướng sử dụng các loại nước tương lên men truyền thống hơn [34]. 1 5 15 Khóa luận tốt nghiệp Gần đây người ta phát hiện trong nước chấm (nước tương) hóa giải bằng HC1 có chứa nhiều 3-MCPD (3-monochloropropane-l,2diol) có khả năng gây ung thư. Vì vậy, có xu hướng quay trở về công nghệ truyền thống. Một số quy trình sản xuất nước chấm an toàn (về 3-MCPD) giá thành chấp nhận được bằng cách kết hợp lên men và hóa giải đã được triển khai [7], [8]. 2.2.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước tương Vai trò của nước tương: Nghiên cứu của Đại học Quốc gia Singapore chỉ ra rằng loại xì dầu sẫm màu của Trung Quốc chứa chất chống oxi hóa cao gấp 10 lần của rựu vang đỏ. Xì dầu không chứa các isoflavon có lợi cho sức khỏe, mà thông thường gắn liền với các sản phẩm từ đậu nành. Nó cũng khá mặn vì thế không phù hợp với những người phải ăn kiêng muối [28]. Khi nói đến giá trị dinh dưỡng của nước tương quan trọng nhất là hàm lượng đạm toàn phần và hàm lượng acid amin. Tỷ lệ hàm lượng acid amin đối với đạm toàn phần cho biết mức độ thủy phân triệt để nguồn protein từ nguyên liệu và tỷ lệ này càng cao càng tốt. Thành phần hóa học của nước tương thay đổi tùy theo nguyên liệu, khâu phối chế và phương pháp sản xuất. Nước tương được xem là ngon khi đảm bảo được yêu cầu về màu sắc, hương thơm, vị ngọt của đạm và đường. Bảng 2.6. Thành phần hóa học của nước tương [58] Thành phần hóa học Hàm lượng (g/l) Đạm nitơ toàn phần 15,0-21,6 Amoniac 1,0-2,0 Đường 14,5-15,3 Lipid 17,0-25,0 NaCl 200-250 Acid acetic 2,0-8,0 2.2.2. Phương pháp sản xuất nước tương Để sản xuất tương có tới 2 phương pháp công nghệ: công nghệ sản xuất theo phương pháp lên men và phương pháp thủy phân bằng acid. 2.2.2.1 Phương pháp lên men vi sinh vật Quá trình sản xuất nước tương được tạo ra chủ yếu bằng sự thủy phân protein, gluxit trong nguyên liệu nhờ hệ enzyme protease và amylase tạo ra từ nấm mốc giống. Mốc giống dưới dạng bào tử được cấy vào khối nguyên liệu đã hấp chín và ủ tạo chế phẩm nấm mốc koji (có lượng enzyme đạt tối ưu). Khi giai đoạn nuôi mốc kết thúc, làm tơi nguyên liệu đã lên mốc, pha trộn dung dịch 1 6 16 Khóa luận tốt nghiệp nước muối và lên men trong khoảng 3 đến 6 tháng. Trong quá trình lên men có bổ sung các dạng nấm men, vi khuẩn lactic nhằm tạo hương vị tốt cho sản phẩm. Sau quá trình lên men dịch thủy phân được tách ra nhờ phương pháp lọc ép. Dịch sau khi lọc được thanh trùng, hoàn thiện sản phẩm và đóng chai [1]. Nguyên liệu Ngâm qua đêm Hấp 1000C, 30 phút Giống Aspergillus oryzae Giống Aspergillus oryzae Nguyên liệu Lên men Ngâm qua đêm Ủ Hấp 1000C, 30 phút Lọc Lên men Nước tương ủ Hình 2.7. Sơ đồ quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men [43] Ưu điểm: - Lọc Nước tương không chứa độc tố 3 – MCPD Nước tương Chọn một số chủng Aspergillus oryzae có hoạt tính α-amylase và protease cao, không sinh aflatoxin, lên men ổn định. Nhược điểm: - Hiệu suất thủy phân thấp Thời gian sản xuất kéo dài (2-3 tháng) Nguyên liệu Chiếm nhiều mặt bằng 2.2.2.2. Phương pháp hóa học (thủy phân bằng acid) Nghiền Ngoài phương pháp lên men, nước tương còn được sản xuất bằng cách HClacid thủy Thủy thủy phân acid (dùng phân phân protein). Sản phẩm tạo ra được gọi là nước tương hóa học.Na2CO3 Sản phẩm này hoàn toàn khác so với nước tương được sản xuất bằng phương pháp lên men [1]. Trung hòa Gia vị, muối, màu, chất bảo quản Phối chế Thanh trùng Lọc Nước tương 1 7 17 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.8. Sơ đồ quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp hóa học [43] Đầu tiên nguyên liệu được ngâm, nấu ở nhiệt độ 110-121 0C với HCl 1516% trong khoảng 12-24 giờ. Sau khi sôi, để nguội hoàn toàn lọc rửa dịch thủy phân sau đó trung hòa bằng NaOH hoặc Na 2CO3 đến pH 5,0-6,0 (thấp hơn pH 5,0 có vị chua, cao hơn pH 6,0 có vị đắng, mùi nồng). Thêm muối, cô đặc đến hàm lượng đạm cần thiết (tiêu chuẩn đạm: 10-22g/l). Sau đó đem thanh trùng, vô chai, bảo quản và phân phối tiêu thụ [1]. Ưu điểm: - Thời gian thủy phân nhanh, giá thành rẻ Ít choáng mặt bằng Mùi vị được người tiêu dùng ưa chuộng Nhược điểm: - Hóa chất gây hư hao nhà xưởng, thiết bị Công nghệ sản xuất gây ô hiễm môi trường và người trực tiếp sản xuất Sản phẩm tạo ra có chứa độc tố 3-MCPD vượt mức cho phép 1 8 18 Khóa luận tốt nghiệp 2.3. BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN NƯỚC TƯƠNG 2.3.1. Cơ sở khoa học của phương pháp lên men Đối với phương pháp sản xuất nước chấm lên men, cơ sở khoa học của nó là lợi dụng hệ men của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu đạm nuôi chúng, để rồi thủy phân protein thành các dạng acid amin và các dạng peptid khác có trong nguyên liệu thành nước chấm [20]. Do vậy trong quá trình sản xuất phải nuôi mốc cho tốt, để có nhiều men thủy phân triệt để protein có trong nguyên liệu, nâng cao hiệu suất lợi dụng nguyên liệu, hạ giá thành sản phẩm [5]. 2.3.2. Sản phẩm của quá trình thủy phân Chất lượng nước tương thay đổi tùy theo nguyên liệu, tỷ lệ phôi chế, phương pháp chế biến... Trong nước chấm lên men còn chứa khá nhiều đường do tác dụng của men amylase của mốc lên tinh bột. Nước chấm còn chứa một lượng chất béo, một số vitamin, muôi ăn và các nguyên tố vi lượng khác. Vì vậy, các loại nước chấm nếu được sản xuất theo đúng quy trình kỹ thuật và được bảo quản tốt sẽ có màu sắc đẹp, hương vị thơm và có vị ngọt của đạm và đường [10]. Nước tương có chứa nhiều acid amin thiết yếu như: valine, tryptophan, lysine và histidine và cũng chứa vitamin (đặc biệt là vitamin B 6) và chất chống oxi hóa (isoflavone) [30]. 2.3.2.1. Acid amin Trong nước tương có nhiều acid amin như arginin, methionin, tryptophan, tyrosin, valin, serin, glycin, hystidin, alanin, glutamic, asparagin... Những acid amin này cùng với di, tri, tetra - peptid làm cho nước tương có vị ngọt của đạm và mùi thơm mùi thịt. Nước tương sản xuất theo phương pháp lên men hầu như giữ được tất cả các acid amin có trong đậu nành [10]. 2.3.2.2. Đường Trong nước tương có các loại đường glucoza, fructoza, maltoza, pentoza, dextrin. Đường có vai trò quan trọng trong việc hình thành màu sắc nước tương [10]. 2.3.2.3. Acid hữu cơ Các acid hữu cơ có trong nước tương quan hệ mật thiết với nhau tạo hương vị đặc trưng của nước tương. Trong đó, acid lactic chiếm hàm lượng nhiều nhất (chiếm khoảng 1,6%). Acid lactic tác dụng với nước tương tạo hợp chất lactat như lactat phenol. Ngoài ra còn có acid acetic 0,2%, acid sucinic 1 9 19 Khóa luận tốt nghiệp 0,087 – 0,16%, acid formic 0,05%. Muối của các acid này tham gia tạo vị cho nước tương [10]. 2.3.2.4. Chất màu Màu của nước tương chủ yếu do đường kết hợp với acid amin tạo nên. Màu của nước tương lên men được hình thành dần dần từ màu vàng đến màu nâu nhạt, cuối cùng là nâu đậm. Sự hình thành màu của nước tương phụ thuộc vào nồng độ đường, acid amin và nhiệt độ. Nếu tăng cường phản ứng giữa acid amin với đường thì không có lợi vì tạo ra melanoid. Melanoid là chất mà cơ thể khó hấp thu và khi nồng độ của nó cao sẽ làm giảm hương vị của sản phẩm. Mặt khác, quá trình hình thành sản phẩm màu này gây tổn thất lớn acid amin. Để hạn chế quá trình này, ta chọn nguyên liệu có hàm lượng đường thấp, tránh nâng cao nhiệt độ và kéo dài thời gian thủy phân [10]. 2.3.2.5. Thành phần hương thơm Mùi của nước tương là do tổng hợp của rất nhiều chất khác nhau tạo thành. Mùi của nước tương có thể phân ra acid hữu cơ, rượu, aldehyde, thành phần hương thơm có lưu huỳnh, phenol... Cụ thể là các hợp chất như: acetaldehyde, propandehyde, butadehyde, valeraldehyde, allyl mecaptan, methyel mecaptan, isobutan adehyde, dimelthyl capmetan, etyloleat, rượu ethylic, acid acetic, acid petanoic, acid propionic, acid benzoic, benzaldehyde... có hương thơm ngũ cốc rang [10]. 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống là một trong các loại sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới. Đó là một sản phẩm được sản xuất thủ công mang sắc thái kinh nghiêm và bản sắc riêng của từng dân tộc [7]. Việt nam là một trong những nước Châu Á giàu các sản phẩm lên men như: nước mắm, mắm tôm, tương, nước tương, rượu... Ngày càng đóng vai trò quan trọng trong nền văn hóa ẩm thực của người Việt. Trong đó, nước tương là một loại gia vị rất thông dụng ở Việt Nam. Nó không chỉ dùng làm nước chấm mà nó còn có vai trò như một loại gia vị, giúp cho món ăn có vị ngon và vị mặn nhẹ, tạo mùi thơm đặc trưng cho món ăn [13]. 2 0 20