Tài liệu Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao​

Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG Trần Thị Thúy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ĐƠN DÒNG NẤM ĐỐI KHÁNG TRICHODERMA PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG Trần Thị Thúy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ĐƠN DÒNG NẤM ĐỐI KHÁNG TRICHODERMA PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO Chuyên ngành: Khoa học Môi trường Mã số: 60440301 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM NGỌC DUNG PGS.TS. ĐỒNG KIM LOAN Hà Nội - 2013 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. PHẠM THỊ NGỌC DUNG và PGS.TS. ĐỒNG KIM LOAN đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ trong phòng thí nghiệm của bộ môn Bệnh cây Trồng, Viện Bảo vệ Thực vật - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Chủ nhiệm và các thành viên tham gia đề tài “Nghiên cứu tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao và các giải pháp khoa học công nghệ trong phòng trừ bệnh”, mã số ĐTĐL.2011G/63 đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện đề tài, giúp em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Khoa Môi trường trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt 2 năm học vừa qua. Với vốn kiến thức mà em được tiếp thu trong quá trình học tập sẽ là hành trang quý báu để em có thể hoàn thành tốt công việc sau này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. EM XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN. Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2013 Học viên TRẦN THỊ THÚY Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3 1.1. Nấm đối kháng Trichoderma spp. ............................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp. . .................... 3 1.1.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp. lên các tác nhân gây bệnh cây trồng . ............................................................................................................... 4 1.1.3. Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng ................................................................................................. 7 1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trên cây trồng. ..................................................................... 8 1.1.5. Một số loại vi sinh vật đối kháng và chế phẩm sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt nấm bệnh được nghiên cứu và sử dụng ........................... 12 1.2. Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao ........................... 14 1.2.1. Tình hình thiệt hại do bệnh thối đen quả ca cao gây nên ....................... 14 1.2.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora ............. 15 1.2.3. Chu kỳ phát triển bệnh ......................................................................... 17 1.2.4. Sự vận chuyển của mầm bệnh .............................................................. 17 1.2.5. Nghiên cứu về phòng trừ sinh học bệnh thối đen quả ca cao ................ 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 22 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 22 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................ 22 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm ............................... 23 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 29 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................. 30 3.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao ........... 30 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 3.2. Phân lập nấm Trichoderma sp. ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông. ............................................................................ 31 3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao .................................................................................... 33 3.3.1. Khả năng ký sinh của nấm Trichoderma sp. .......................................... 33 3.3.2. Khả năng sinh kháng sinh bay hơi của nấm Trichoderma sp. ................. 34 3.4. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp. ................................................................................................ 36 3.4.1. Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma sp. trên môi trường nhân tạo. ......................................................................................................... 36 3.4.2. Đặc điểm sinh thái của nấm Trichoderma sp. ........................................ 37 3.5. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao. ........................................................................................................ 43 3.5.1. Nghiên cứu thành phần cơ chất của môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. .............................................................................................. 44 3.5.2. Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. .............................................................................................. 45 3.5.3. Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trong lên men nhân sinh khối của nấm Trichoderma (ánh sáng, chế độ cấp khí) .................................... 50 3.6. Đánh giá sức sống của nấm Trichoderma sp. sau bảo quản sản phẩm nhân sinh khối .................................................................................................. 54 3.7. Sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp. ................................ 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 58 1. Kết luận.......................................................................................................... 58 2. Kiến nghị ....................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 59 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADCI/VOCA Tổ chức hợp tác phát triển nông nghiệp và trợ giúp quốc tế a, b, c, d Phân lớp sự sai khác giữa các công thức CMA Môi trường gồm bột ngô (60g), Agar (20g) Cs Cộng sự CV Độ biến động (%) Czapek Môi trường tổng hợp bao gồm Saccharose (30g), NaNO3 (3g), K2HPO4 (1g), MgSO4 (0,5g), KCl (0,5g), FeSO4 (0,1g), 1000ml nước IRRISTAT Phần mềm thống kê trong nông nghiệp. P. Phytophthora PDA Môi trường nuôi cấy gồm khoai tây (200g), đường dextro (20g), Agar (20g), 1000ml nước PTNT Phát triển nông thôn sp. Một loài bất kỳ spp. Nhiều loài bất kỳ T. Trichoderma VSV Vi sinh vật Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Lượng phân bón cho ca cao mới trồng trong 2 năm đầu tiên .................. 19 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả năng bẫy nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao................................................................................ 30 Bảng 3.2. Nguồn Trichoderma thu thập được từ 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông ......................................................................................... 31 Bảng 3.3. Nguồn Trichoderma có triển vọng đã thu thập được tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông ............................................................... 32 Bảng 3.4. Khả năng ký sinh của các dòng nấm đối kháng Trichoderma sp đối với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao ........................... 33 Bảng 3.5. Khả năng ức chế nấm Phytophthora palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi của các dòng nấm Trichoderma sp. .......................................................... 35 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma sp. có triển vọng ............................................................... 38 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm Trichoderma sp. có triển vọng ............................................................... 39 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma sp. có triển vọng ....................................................... 40 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp có triển vọng ...................................................................................................... 41 Bảng 3.10. Định tính hoạt độ enzyme của nấm đối kháng Trichoderma sp có triển vọng ...................................................................................................... 42 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp. ............................................................................. 44 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp. trên môi trường gạo .................................................... 46 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp. trên môi trường bột ngô .............................................. 48 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường thóc ......................................................... 50 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của chế độ đậy nút kín và đảo trộn đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma .................................................................... 51 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của chế độ buộc nút hở và đảo trộn cấp khí đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp................................................ 52 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp. .................................................................................... 54 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản sản phẩm nhân sinh khối đến sức sống của nấm Trichoderma ............................................................. 55 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái nấm Trichoderma sp. ................................................................ 4 Hình 1.2. Sơ đồ chu trình sống của nấm Phytophthoro spp .................................... 16 Hình 1.3. Hình thái học của Phytophthora palmivora. Hàng dưới là túi noãn hình cầu với túi đực amphigynous và một bọc bào tử hình trứng với một cuống ngắn. .......................................................................................... 16 Hình 3.1. Đồ thị thể hiện tỷ lệ phân lập được nguồn nấm Trichoderma từ đất tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông. .................................................. 31 Hình 3.2. Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora palmivora ....... 34 Hình 3.3. Hiệu quả ức chế của giống Trichoderma đã phân lập đối với nấm Phytophthora palmivora ........................................................................ 35 Hình 3.4. Các giai đoạn phát triển sau nuôi cấy của nấm Trichoderma sp trên môi trường ............................................................................................. 37 Hình 3.5. Định tính hoạt độ enzyme của nấm đối kháng Trichoderma sp. ............. 43 Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đối với nấm Trichoderma ........... 45 Hình 3.7. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường gạo .......................................................... 47 Hình 3.8. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường bột ngô .................................................... 49 Hình 3.9. Bảo quản chế phẩm Trichoderma trong túi hút chân không .................... 56 Hình 3.10. Bảo quản chế phẩm Trichoderma trong túi không hút chân không ....... 56 Hình 3.11. Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma sp. .............................. 57 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 MỞ ĐẦU Cây ca cao (Theobroma cocoa L) có nguồn gốc từ lưu vực sông Amazon ở Nam, Trung Mỹ trong tầng thấp của những cánh rừng mưa nhiệt đới. Từ hơn 500 năm trước, ca cao đã được trồng rộng rãi ở nhiều vùng Trung Mỹ, Đông Phi, Tây Phi và lan đến các nước Đông Nam Á. Năm 2002, chỉ riêng mức tiêu thụ hạt ca cao trên thế giới đạt 4 tỷ USD, nhu cầu này sẽ tăng trong thời gian tới và tăng nhanh nhất ở thị trường Châu Á [1, 14, 12]. Cây ca cao hiện là cây trồng chính được trồng trong các chương trình giữ gìn sinh thái, tạo cảnh quan cho các vùng đất trống, đồi trọc, đem lại cơ hội tốt để cải thiện đời sống, tăng thu nhập cho người nông dân sản xuất nhỏ và nghèo. Theo Ross Jaaz (trưởng đại diện ADCI /VOCA), hơn 80 % ca cao trên thế giới được sản xuất từ mảnh đất nhỏ dưới 1ha [12]. Bệnh thối đen quả ca cao (black pod) là bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng nhất đối với các vùng trồng ca cao trên thế giới, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng hạt ca cao, do nấm Phytophthora palmivora gây ra. Bệnh gây hại không những trên quả từ giai đoạn còn non cho đến khi quả chín, mà còn hại cả trên thân, cành và lá. Nấm Phytophthora palmivora gây hại không chỉ trên các bộ phận khi sinh mà còn có khả năng tồn tại trong đất và hạn chế sự sinh trưởng của cây con được trồng lại trên đất trồng ca cao trước đây đã bị bệnh. Ước tính thiệt hại do loại bệnh này gây ra là rất lớn từ 10 % đến 30 % và có thể lên đến 90 - 100 %, phụ thuộc vào vị trí địa lý, giống trồng trọt, chủng gây bệnh và điều kiện môi trường từng vùng (Keane, 1992) [49]. Ở Việt Nam, cây ca cao được du nhập và trồng thử từ những năm cuối thập niên 50 của thế kỷ 20. Các khu vực trồng và phát triển ca cao ở Việt Nam bao gồm Tây Nguyên, Nam Trung Bộ, miền Đông và Miền Tây Nam Bộ [1, 12]. Khi hình thành các vùng sản xuất ca cao hàng hoá tập trung gặp phải vấn đề là nhiều loài dịch hại quan trọng phát triển nhanh và gây hại nặng, làm giảm năng suất, chất lượng quả ca cao. Bệnh thối đen quả ca cao cũng là bệnh chính gây hại ca cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Để phát triển và sản xuất ca cao có hiệu quả, 1 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 bền vững cần phải có các biện pháp phòng trừ các bệnh hại nghiêm trọng này, trong đó có bệnh thối đen quả ca cao [25, 27]. Ở Việt Nam, việc ứng dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora gây nên mới chỉ được nghiên cứu ở một số đối tượng như: hồ tiêu, sầu riêng, cà chua, khoai tây, trên cây ca cao vẫn chưa được đề cập nghiên cứu. Vì vậy việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học có tác dụng tiêu diệt nấm gây bệnh thối đen quả ca cao là hết sức quan trọng, vừa có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng đồng thời bảo vệ môi trường [7, 17]. Trong thực tế dòng nấm đối kháng Trichoderma đã được ứng dụng để tiêu diệt một số loại bệnh hại cây trồng và đã có nhiều chế phẩm sinh học được tạo ra cho hiệu quả cao. Nấm Trichoderma đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng thông qua nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, tạo ra chất kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh. Việc nghiên cứu phân lập lựa chọn những chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng, tiêu diệt nấm bệnh cao là hết sức cần thiết , góp phần nâng cao hiệu quả phòng trừ, an toàn với môi trường và sức khỏe của con người [13]. Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận văn sẽ thực hiện: “Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao”. Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập chủng nấm Trichoderma spp. từ đất và nấm Phytophthora palmivora từ mẫu bệnh thối đen quả ca cao lấy ở một số vùng trồng ca cao của tỉnh Đăk lăk, Đăk Nông và Bình Phước. - Xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao. - Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp. đã tuyển chọn được. - Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma sp. có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao. 2 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Nấm đối kháng Trichoderma spp. 1.1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp. [7, 13, 17, 21, 23, 24, 35, 40, 48]. Giống nấm Trichoderma Pers. thuộc họ Moniliaceae, bộ moniliales, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes. Nấm Trichoderma có sợi nấm dạng bò lan, không màu hay sáng màu. Sợi nấm sinh trưởng, phát triển thành những tảng nấm nhỏ dạng gối phẳng, có cành bào tử đơn bào không mầu. Cành bào tử phân nhánh và các nhánh này thường mọc đối xứng nhau hoặc theo nhiều phía. Trên cành bào tử thường có cuống đính bào tử. Cuống đính bào tử hình chai. Bào tử hình tròn hoặc hình trứng, sáng màu, có cấu tạo đơn bào. Bào tử có thành dầy. Kích thước bào tử thay đổi tùy loài phổ biến từ 3,0 µm đến 4,0 µm. Đây là các nấm đối kháng sống trong đất. Thường quan sát thấy nấm Trichoderma tồn tại trong đất ở dạng sợi nấm hoăc bào tử. Bào tử có rất nhiều trong đất ẩm. Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc khác nhau. Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt. Khuẩn lạc Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong vòng 5 - 7 ngày. Trên môi trường PDA khi ủ ở nhiệt độ ở 250C, khuẩn lạc nấm Trichoderma ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bào tử xuất hiện. Ở một số loài Trichoderma còn có khả năng tiết ra sắc tố có màu vàng trên môi trường PGA. Một số loài Trichoderma còn tạo mùi đặc trưng như Trichoderma viride tạo mùi dừa. Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia. Hầu hết các loài Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 - 300C, một số loài phát triển tốt ở 350C thậm chí ở 400C. Thủy phần của môi trường lên men xốp sinh khối của Trichoderma thích hợp là 54 - 56 %. pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển 3 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 là 5 - 6, khi pH > 6 sinh trưởng của nấm yếu, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu. Trong thời gian nhân nuôi, nấm Trichoderma cần có điều kiện thoáng khí vì vậy sau khi vô trùng cần làm cho môi trường nhân nuôi xốp bằng cách lắc để chúng không kết lại thành mảng. Nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được. Hình 1.1. Hình thái nấm Trichoderma sp. 1.1.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp. lên các tác nhân gây bệnh cây trồng [35, 40, 48]. Nấm đối kháng Trichoderma có nhiều trong đất và được biết rõ đến hiệu quả trong việc kiểm soát các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và Botrytis cinerea. Cơ chế trực tiếp liên quan đến hiệu quả đối kháng là sự cạnh tranh, sinh kháng sinh và ký sinh. Tùy thuộc vào loài nấm Trichoderma mà tạo ra các loại kháng sinh khác nhau. Nấm Trichoderma viride sinh ra kháng sinh: viridin, trichodermin, xosukacylin, almatecin hoặc các vitamin, cacbonhydrat, nitơ nhờ vậy làm đất tốt. 4 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Các chất kháng sinh này có thể ở dạng bay hơi hoặc không bay hơi, khi tiết ra đều ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh ở mức độ khác nhau. Nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma có khả năng sản sinh các enzym Chitinase và -glucanase với hàm lượng cao, đây là 2 enzym thủy phân vách tế bào của các loài nấm gây bệnh rất mạnh. Theo Jollès và Muzzarelli, 1999, các loài nấm mốc như Trichoderma, Gliocladium ... cho hàm lượng chitinase cao. Chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh của các loài nấm này với các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nấm Trichoderma khi ký sinh nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase. Các chủng nấm mốc Trichoderma, Aspergillus, Candida albicans, Sclerotium glucanicum...có khả năng sản sinh -glucanase cao, đặc biệt là nấm Trichoderma. -glucanase của Trichoderma giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh để đối kháng nấm gây bệnh cây trồng. -1,3-glucanase ở Trichoderma kìm hãm quá trình sinh tổng hợp -1,3glucan vách tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh. Tác động đối kháng của nấm Trichoderma đối với vi sinh vật gây bệnh cây được thông qua bởi một số cơ chế sau đây: - Cơ chế ký sinh: Theo R.Weindling mô tả từ năm 1932 (Adams, 1990; Snyder và cộng sự, 1976), tác giả gọi đó là hiện tượng "giao thoa sợi nấm". Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm bệnh, cuối cùng mới thấy nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh bên trong sợi nấm bệnh. Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ. Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá hủy từng phần hoặc hoàn toàn. Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các 5 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma. Hiện tượng tan rã Kitin có ở vùng xung quanh nơi xâm nhập của nấm Trichoderma (Dubey, 1995; Inbar và cộng sự, 1996; Mikala-Doukaga và cộng sự, 1979; Rousseau và cộng sự, 1996). Một điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bào tử đính của nấm Trichoderma sau khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành được thể giác bám. Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ. Tỉ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm Trichoderma với nấm vật chủ (Inbar và cộng sự, 1996; Pereverzeva và cộng sự, 1995). - Cơ chế kháng sinh: Nấm Trichoderma có khả năng sinh ra một số kháng sinh. Khả năng sinh ra chất kháng sinh của các loài, các chủng là khác nhau giống. Một số chất kháng sinh do Trichoderma sinh ra bao gồm: + Gliotoxin: là chất kháng sinh được R.Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma lignorum tạo thành. Trichoderma sinh kháng sinh Gliotoxin với điều kiện hàm lượng oxy phải cao. Chất Gliotoxin được tích luỹ nhiều trong dịch môi trường. Sự tích luỹ tối đa chất Gliotoxin thường ở giai đoạn phát triển sớm của nấm Trichoderma. Chất Gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, pisi; Botrytis, R.solani). + Viridin: là chất kháng sinh thứ hai do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động sống của chúng (Bilai, 1974; Martin và cộng sự, 1975; Seiketov, 1982). Chất kháng sinh này được phát hiện vào năm 1945 ( Seiketov, 1982). Viridin độc hơn rất nhiều so với Gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao. Ngoài ra, đã xác định được một số chất kháng sinh khác do nấm Trichoderma sinh ra như: chất kháng sinh U-21693 được Meyer phát hiện năm 1996. Năm 1975, ở Nhật Bản, các tác giả Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được 2 chất kháng sinh: Trichoderma và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T.koningii và T.aureoviride (Seiketov, 1982). Nấm Trichoderma còn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh dễ bay hơi có hoạt tính sinh lý cao. Theo Hutchinson (1973) thì thành phần chính của những chất này là khí Cacbonic (CO2) và etanol (Seiketov, 1982). 6 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 - Tác động của men: Nhiều loài Trichoderma có khả năng sinh ra men phân giải (như men laminarinaza, chitinaza,…) (Score và cộng sự, 1994). Khi phát triển ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma có thể tiết ra những loại men gây suy biến thành tế bào nấm gây bệnh cho cây như men  -(1-3)-glukanase và chitinaza (Chet và cộng sự, 1981 và Jones &Watson, 1969-dẫn theo Martin và cộng sự, 1985; Chet và cộng sự, 1981, 1983). - Cơ chế cạnh tranh: nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nấm gây bệnh cây. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nấm gây bệnh (Green và cộng sự, 1996; Martin và cộng sự, 1985). 1.1.3. Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng [35, 40, 48]. Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của nấm Trichoderma viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea. Ngày nay, người ta còn biết sử dụng nấm Trichoderma để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở rễ (như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora,...) và cả các bệnh ở các phần trên mặt đất (như Botrytis cinerea). Bliss (1959); Ohr và cộng sự (1973), cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất, quần thể Trichoderma trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillaria mellea trên đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide. Well và các cộng sự (1962) lần đầu tiên công bố sử dụng một số lượng lớn Trichoderma được nuôi trồng trên môi trường rắn ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng để kiểm soát nấm Sclerotium rolfsii trên cà chua. Barkman và Rodriguez Kabano (1975) nuôi trồng T.harzianum bằng phương pháp thương mại, các giá thể chứa nấm được rải xuống đất dọc theo các hàng đậu với lượng 112 – 140 kg/ha sau 70 100 ngày sau khi gieo đậu. Với lượng 140 kg/ha, T.harzianum có tác dụng phòng chống S.rolfsii và tăng năng suất lên trong khoảng 3 năm. Nấm Trichodema hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm R.solani (Chet và Baker, 1980; 1981) và 7 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 phân lập từ đất tại Mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất (Lumsden, 1977). Nhiệt độ và tia phóng xạ gamma không thể diệt nấm R.solani nhưng trong môi trường T.harzianum diệt được nấm này (Nelson và cộng sự, 1983), đây là vai trò chính của Trichoderma trong việc phòng trừ sinh học. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trên cây trồng.  Ở nước ngoài [35, 40, 48]. Cho tới nay có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin…) cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây trồng. Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ các nấm Pythium spp. và R. solani gây bệnh chết héo đậu và củ cải (Chet và cộng sự,1981). Ở Ấn Độ, hiệu quả ức chế bệnh do R. Solani gây trên khoai tây của nấm T. harzianum đạt tới 89,1%. Ở Thái Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua do nấm S.rolfsii: tỷ lệ cây sống đạt 91,7%; trong khi đó ở đối chứng chỉ đạt 61,9%. Ở Philippin, nấm T.harzianum làm giảm đáng kể tỷ lệ bị bệnh do nấm R.Solani ở đậu xanh: tỷ lệ bị bệnh khi dùng T.harzianum là 14-19%; đối chứng là 79-86% (Davide, 1991). Nấm T.harzianum nuôi trồng trên môi trường rắn có tác dụng chống được các bệnh thối trắng trên hành (Sclerotium cepivorum) ở Ai cập (Abd-El và cộng sự, 1982) và ở Mỹ (Papavizas và Lewis, 1982); bệnh trên dưa leo và bệnh trên cây bông do Verticillium dahlia ở Liên xô ( Fedrorinchik và cộng sự, 1975), bệnh chết rạp cây con do Rhizoctonia và bệnh tàn rụi (S.rolfsii) trên nhiều cây trồng ở Israel (Chet và cộng sự, 1982, Elad và cộng sự, 1982) và bệnh thối trái trên dưa leo (Kommedahi và Windels, 1981). Hiệu quả phòng trừ sinh học của nấm nuôi trồng trên môi trường rắn phụ thuộc vào nhiệt độ, loại môi trường nuôi trồng và thời điểm cấy nấm vào đất (Elad và cộng sự, 1980), tỷ lệ cấy Trichoderma vào giá thể (Elad và cộng sự, 1980, Hadar và cộng sự, 1979) và mật độ của nấm gây bệnh trong đất. Theo Anderens và cộng sự (1983), Barros và cộng sự (1996), Dutta và cộng sự (1999), cho biết khi quả táo đươc xử lý chế phẩm Trichoderma viride đã làm 8 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 giảm được 20-40% tỷ lệ thối quả do nấm Botrytis cinerea, Alternaria tenuis. Theo Dubos và cộng sự (1979) ở Pháp người ta đã thử nghiệm nấm Trichoderma viride có hiệu quả phòng trừ bệnh thối xám quả nho giảm 70% so với đối chứng. Theo Sing R. S (1995) thì nấm Trichoderma viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh hại khoai tây do loài Rhizoctonia solani gây nên, hiệu quả ức chế tối đa là 83,4%. Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự (1979), Wu. W. S (1996) dùng chế phẩm Trichoderma sp. có tác dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm Trichoderma sp. có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây. Theo Anderens và cộng sự (1983), Barros và cộng sự (1996) và Dutta và cộng sự (1999), cho biết khi quả táo đươc xử lý chế phẩm Trichoderma viride đã làm giảm được 20-40% tỷ lệ thối quả do nấm Botrytis cinerea, Alternaria tenuis. Theo Dubos và cộng sự (1979) ở Pháp người ta đã thử nghiệm nấm Trichoderma viride có hiệu quả phòng trừ bệnh thối xám quả nho giảm 70% so với đối chứng. Theo Sing R. S (1995) thì nấm Trichoderma viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh hại khoai tây do loài Rhizoctonia solani gây nên, hiệu quả ức chế tối đa là 83,4%. Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự (1979), Wu (1996) dùng chế phẩm Trichoderma sp. có tác dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, giúp cây sinh trưởng khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây. Trichoderma là một trong những loại nấm có khả năng ức chế một số nấm đặc biệt là các loài nấm đất như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia gây bệnh trên các loại cây họ đậu, cây ăn trái, cây hòa thảo, cây công nghiệp và cây hoa cảnh. Trichoderma không những tiêu diệt được nhiều loài nấm bệnh gây hại cây trồng mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng phát triển của cây trồng. Những chất kháng sinh do chúng tiết ra còn có thể xâm nhập vào mô tế bào cây và làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng (Biswas, 1999). 9 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Theo Dutta và Das (1999), đã thử nghiệm khả năng phòng trừ sinh học của nấm Trichoderma harzianum bằng cách cho một số lượng lớn bào tử nấm này nuôi trồng trong môi trường rắn vào đất để kiểm soát nấm Rhizoctonia solani trên cây đậu tương. Trichoderma harzianum khi bón vào đất với tỷ lệ 1 : 10 theo thể tích đã ngăn chặn được bệnh ở thân và rễ do nấm Rhizoctonia solani gây hại đồng ruộng. Nghiên cứu của Diby và cộng sự, 2003 đã ghi nhận nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369, 1370 được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu có khả năng kích thích sinh trưởng và hạn chế được bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm Phytophthora capsici gây nên. Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369 với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens IISR 11 cho hiệu quả phòng trừ đạt 63%, cao hơn so với đối chứng là 36%. Hiện nay tại Mỹ, các chế phẩm PlantshieldTM và RootshieldTM từ loài Trichoderma harzianum nòi T22 đã được khuyến cáo để sử dụng phòng trừ một số bệnh do nấm Phytophthora, Pythium, Fusarium trên một số cây trồng. Chế phẩm được sử dụng bằng cách phun lên lá, tưới hay bón vào đất. Promote Plus cũng là một chế phẩm Trichoderma (Trichoderma koningii và Trichoderma harzianum) được khuyến cáo sử dụng tại đây để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani, một số loài Pythium, Phytophthora.  Ở trong nước [5, 7, 9, 17, 20, 21, 23, 24]. Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng như: chế phẩm Trichoderma thử nghiệm trên cây rau tại huyện Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh của Viện Sinh học Nhiệt đới, chế phẩm Trichoderma thử nghiệm trên cây xà lách xoong ở Vĩnh Long của Bộ môn Bảo vệ thực vật - Trường Đại học Cần Thơ, chế phẩm Trichoderma sử dụng trên cây rau của Bộ môn Bảo vệ thực vật - Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. Chế phẩm sinh học đa chức năng MT1 của Viện Bảo vệ thực vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm Phytophthora spp., chế phẩm Trichoderma spp. phòng trừ bệnh thối quả ca cao do nấm Phytophthora palmivora của Viện Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên. 10 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Các kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuất và Lê Văn Thuyết, 2001 đã phát hiện những điểm kí sinh hoặc sự quấn của sợi nấm đối kháng lên sợi nấm bệnh, đôi khi dưới tác động của một số loại men được tiết ra từ nấm đối kháng còn thấy hiện tượng sợi nấm bị quăn lại, chết từng đoạn mà không cần có sự ký sinh trực tiếp. Nhờ các men này các chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Tác giả Trần Thị Thuần và cộng sự (2004), đã tiến hành phân lập từ các nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma đã thu thập, kết quả cho thấy các loài nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 - 85,5% đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp. , Aspergillus spp. Theo tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2008) nấm Trichoderma hazianum có khả năng ức chế cao đối với sự phát triển của sợi nấm Phytophthora tropicalis, trên môi trường bằng phương pháp cấy đối xứng, sợi nấm Phytophthora bị tiêu diệt sau 3 ngày nuôi cấy. Cũng theo tác giả, một số chủng nấm Trichoderma spp. vừa có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử Phytophthora đồng thời có khả năng phân hủy tốt một số loại tàn dư thực vật, hữu dụng trong quá trình ủ phân hữu cơ, cung cấp phân hữu cơ cho các vườn hồ tiêu. Theo Trần Kim Loang và cộng sự (2008), sử dụng chế phẩm Trico-VTN (gồm Trichoderma virens và Trichoderma asperellum) với nồng độ 0,3 – 0,4% mỗi tháng một lần, hạn chế được sự phát triển và gây hại của bệnh do nấm Phytophthora trên cây tiêu và ca cao trong điều kiện vườn ươm. Trên đồng ruộng xử lý chế phẩm Trico-VTN với lượng 10 – 15 g/gốc, xử lý 4 lần từ đầu mùa mưa, cách nhau 2 tháng, kết hợp với bón phân hữu cơ, phân bón lá, vệ sinh đồng ruộng và tiêu thoát nước có thể hạn chế sự phát triển và lây lan của bệnh chết nhanh hồ tiêu trên đồng ruộng. Theo Nguyễn Minh Châu (2009), sử dụng nấm Trichoderma trộn với phân hữu cơ bón vào đất, tưới nước giữ ẩm để phòng trừ một số bệnh thối rễ, vàng lá, nứt gốc…cho vườn cây ăn quả khá tốt. Các vườn ươm sử dụng nấm Trichoderma 11 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 phòng trừ được bệnh do nấm gây hại trên cây giống. Phối trộn nấm Trichoderma với phân chuồng hoai mục bón cho vườn cây theo định kỳ thì hiệu quả càng tăng lên. Hồng Châu, 2009 cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian hoai mục. Hiện nay, chủng Trichoderma do Trường Đại học Cần Thơ sản xuất được nông dân sử dụng đánh giá có tác dụng rất tốt trong việc ngăn ngừa các loại nấm hại như Fusarium, Rhizoctonia, Phytopthora ... gây bệnh trên cây có múi và cây rau họ bầu, bí. Vì vậy mà các chế phẩm có chứa Trichoderma ngày càng được lưu hành, sử dụng nhiều hơn; đặc biệt các vườn trồng chanh ở Bến Lức hoặc các ruộng trồng dưa hấu ở Tân Trụ. Theo các tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2012), sử dụng nấm đối kháng Trichoderma Asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây cao su đã được một nhóm tác giả thuộc Viện Bảo vệ Thực vật nghiên cứu. Nhóm nghiên cứu đã lấy tổng số 80 mẫu đất thu thập được quanh vùng rễ của các cây lâu năm tại 3 tỉnh: Bình Phước, Đăk Lăk và Quảng trị, đã phân lập được 18 nguồn Trichoderma sp, trong đó có 8 nguồn triển vọng có khả năng đối kháng với nấm bệnh. Trong điều kiện phòng thí nghiệm nấm Trichoderma Asperellum có khả năng phòng trừ bằng ký sinh sợi nấm đạt hiệu quả là 100% đối với nấm Phytophthora Botryosa và nấm Phytophthora Citrophthora. Khả năng phòng trừ bằng chất kháng sinh bay hơi đạt hiệu quả là 84,8 – 93,4% đối với nấm Phytophthora Botryosa và đạt hiệu quả là 90,4 – 91,8% đối với nấm Phytophthora Citrophthora. Các nguồn khác có khả năng ức chế nhưng với hiệu quả thấp hơn (70,3 – 85,9). Nấm Trichoderma asperellum có khả năng đối kháng cao với nấm Phytophthora spp. gây bệnh trên cao su bằng ký sinh trực tiếp sợi nấm và chất kháng sinh bay hơi. Đồng thời nấm này có hoạt độ các enzyme phân giải như Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao. 1.1.5. Một số loại vi sinh vật đối kháng và chế phẩm sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt nấm bệnh được nghiên cứu và sử dụng [13, 23, 21, 60]. Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Galindo (1992), đã tiến hành nghiên cứu nhiều thí nghiệm để kiểm tra khả năng phòng trừ sinh học đối với nấm P. 12