Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp vật liệu ceo2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến adn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN Ngành: Khoa học vật liệu Mã số: 9440122 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. PHƯƠNG ĐÌNH TÂM 2. GS.TS. TRẦN TRUNG Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Trải qua 3 năm học tập và nghiên cứu hết mình, tác giả đã hoàn thành luận án Tiến sĩ Khoa học Vật liệu tại Viện AIST, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Để có thể hoàn thành luận án này, tác giả đã nhận được sự hướng dẫn tận tâm, động viên và chỉ bảo hết lòng của hai thầy hướng dẫn đó là PGS. TS Phương Đình Tâm và GS. TS Trần Trung. Qua đây, tác giả xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy đặc biệt là PGS. TS Phương Đình Tâm – người đã luôn bên cạnh, sát sao, chỉ bảo, góp ý từng bước thực hiện luận án của tác giả. Bên cạnh đó, tác giả cũng đã nhận được sự tư vấn, giúp đỡ, động viên vô cùng to lớn của các thầy PGS. TS Phạm Hùng Vượng, TS. Nguyễn Đức Dũng và cô PGS. TS Đặng Thị Thanh Lê cùng toàn thể các thầy cô, các bạn nghiên cứu sinh và học viên cao học đã và đang theo học tại Viện AIST và các anh chị em, bạn bè đồng nghiệp. Tác giả cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô và các anh chị em và các bạn! Trong thời gian theo học tại Viện AIST, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tác giả cũng đã nhận được sự tận tình giúp đỡ của tập thể các lãnh đạo Viện AIST, các phòng ban chức năng trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Tác giả xin trân trọng cảm ơn tất cả các sự giúp đỡ này! Ngoài ra, tác giả cũng xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới đại gia đình nội ngoại hai bên, cảm ơn chồng và các con của tác giả đã luôn đồng hành, tiếp sức cho tác giả trong suốt thời gian thực hiện luận án! Tác giả Nguyễn Thị Nguyệt i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được tác giả khác công bố. Hà Nội, ngày TM. Tập thể hướng dẫn tháng năm 2020 Tác giả PGS.TS Phương Đình Tâm Nguyễn Thị Nguyệt ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ ix DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. x MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1: CẢM BIẾN ADN ĐIỆN HÓA .............................................................. 6 1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN .................................................................................. 7 1.2 Cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN ................................................................................................................ 9 1.2.1 Phương pháp quét thế vòng ........................................................................ 9 1.2.2 Phương pháp quét thế xung vi phân (DPV) .............................................. 11 1.2.3 Phương pháp quét thế sóng vuông (SWV) ............................................... 12 1.2.4 Phương pháp phổ tổng trở EIS ................................................................. 13 1.3 Các phương pháp cố định chuỗi ssADN ......................................................... 15 1.3.1 Hấp phụ vật lý ........................................................................................... 15 1.3.2 Cố định bằng liên kết cộng hóa trị ............................................................ 16 1.3.3 Cố định thông qua tương tác Avidin/Streptavidin -Biotin ....................... 18 1.3.4. Cố định bằng phương pháp điện hóa ....................................................... 19 1.4 Phương pháp phát hiện sự lai hóa ADN ......................................................... 21 1.4.1 Phương pháp đánh dấu ............................................................................. 21 1.4.2 Phương pháp không đánh dấu .................................................................. 25 1.5 Ứng dụng của cảm biến sinh học .................................................................... 29 Kết luận chương 1 ................................................................................................. 29 Chương 2: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU THANH NANO CeO2 & NANO COMPOSIT CeO2@Ppy ........................................................................... 31 2.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 31 2. 2 Thực nghiệm .................................................................................................. 34 2.2.1 Hóa chất, thiết bị ....................................................................................... 34 2.2.2 Tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2.......................................................... 34 iii 2.2.3 Tổng hợp vật liệu nano composit CeO2@Ppy .......................................... 36 2.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 37 2.3.1 Kết quả tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 ............................................. 37 2.3.2 Kết quả tổng hợp vật liệu nano composit CeO2@Ppy.............................. 47 Kết luận chương 2 ................................................................................................. 54 Chương 3: PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN ADN TRÊN CƠ SỞ CÁC THANH NANO CeO2 ............................................................................................................ 56 3.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 56 3. 2 Thực nghiệm .................................................................................................. 59 3.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 59 3.2.2 Cố định ssADN ......................................................................................... 59 3.2.3 Các phép đo điện hóa ................................................................................ 62 3.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 62 3.3.1 Kết quả cố định chuỗi ssADN .................................................................. 62 3.3.2 Đặc trưng của cảm biến ADN .................................................................. 66 3.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm ...................................................... 69 3.3.4 Độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc và khả năng tái sử dụng ................. 73 Kết luận chương 3 ................................................................................................. 75 Chương 4: CẢM BIẾN SINH HỌC ADN TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU NANO COMPOSIT CeO2@Ppy ........................................................................................ 76 4.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 76 4.2 Thí nghiệm ...................................................................................................... 78 4.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 78 4.2.2 Cố định các chuỗi ssADN dò lên bề mặt điện cực ................................... 79 4.2.3 Phân tích điện hóa ..................................................................................... 79 4.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 79 4.3.1 Kết quả cố định ssADN ............................................................................ 79 4.3.2 Đặc trưng điện hóa của cảm biến sinh học ADN ..................................... 81 4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số đến tín hiệu ra của cảm biến ........................................................................................................................... 84 4.3.4 Độ chọn lọc, độ lặp lại và độ ổn định của cảm biến sinh học ADN ......... 86 iv 4.3.5 Xác định vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR và so sánh với số liệu phát hiện của cảm biến ADN ...................................................................... 88 Kết luận chương 4 ................................................................................................. 89 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 90 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 92 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TT Ký hiệu, Tên Tiếng Anh chữ viết tắt Tên Tiếng Việt 1 ADN Acid deoxyribonucleic A xít deoxyribonucleic 2 APTES 3-Aminopropyl-triethoxy- 3-Aminopropyl-triethoxy- silane silan 3 ASV Adsortive Stripping Vôn-ampe hòa tan hấp phụ Voltammetry 4 BSA Bovine Serum Albumin Bovine Serum Albumin 5 CE Counter electrode Điện cực đối 6 CPs Conducting Polyme(s) (Các) Polyme dẫn điện 7 CTAB Cetyltrimethyl ammonium cetyltrimetyl amoni bromit bromide 8 CV Cyclic Voltammetry Vôn - ampe vòng 9 DAO Diamin Oxidase Enzym DAO 10 DIG Digoxigenin Digoxigenin 11 DPV Differential Pulse Quét thế xung vi sai Voltammetry 12 dsADN Double strand ADN Chuỗi ADN kép 13 EDC 1-Ethyl-3-3-Dimethyl- 1-Etyl-3-3-Dimetyl- aminopropyl Carbodiimide aminopropyl Cacbodiimit 14 EDS Energy dispersive spectroscopy 15 EDTA X Ethylene Diamine Tetracetic Etylen Diamin Tetracetic A Acid 16 EIS X-ray Phổ tán sắc năng lượng tia xít Impedance Phổ tổng trở điện hóa Electrochemical Spectrocopy 17 18 ELISA FESEM Enzym-linked Xét nghiệm miễn dịch liên Immunosorbent assay kết với enzym Field Emission vi Scaning Hiển vi điện tử quét phát xạ trường Electron Microscopy 19 FTIR Fourier Transform Infrared Phổ hồng ngoại biến đổi Spectrocopy 20 hCG Fourier Human Chorionic hooc môn gonadotropin Gonadotropin 21 HRP Horseradish peroxide Horseradish Perô xít 22 IEP Isoelectric Point Điểm đẳng điện 23 ISFET Ion-Sensitive Field-Effect Trasistor hiệu ứng trường Transistor nhạy ion 24 ITO Indium Tin Oxide Ô xít thiếc indi 25 LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện 26 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng 27 MIA 1-Methylimidazole 1-Metyl imidazol 28 NRs Nanorods Các thanh nano 29 PABA Acid Para-Aminobenzoic A xít 4-Aminobenzoic 30 PANAM Poly Amidoamine Poly amidoamin 31 PANi Polyaniline Polyanilin 32 PBS Phosphat Buffer Saline Đệm phốt phát 33 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polyme 34 Ppy Polypyrrole Poly pyrol 35 Py Pyrrole Pyrol 36 RE Reference electrode Điện cực so sánh 37 SCE Saturated Calomel Electrode Điện cực Calomen bão hòa 38 SMOs Solid Metal Oxides ô xít kim loại bán dẫn 39 ssADN Single strand ADN Chuỗi ADN đơn 40 SWV Square Wave Voltammetry Quét thế sóng vuông 41 TEM Transmission electron Hiển vi điện tử truyền qua microscopy 42 TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt 43 TMC N-trimetyl chitosan N-trimetyl chitosan vii 44 WE Working electrode Điện cực làm việc 45 XRD X-ray Diffraction Nhiễu xạ tia X viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: Các hóa chất, thiết bị được dùng trong nghiên cứu ............................... 34 Bảng 3.1: Các chuỗi nucleotit tổng hợp được dùng trong nghiên cứu .................... 59 Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các đỉnh hấp thụ phổ FTIR của CeO2; ssADN và ssADN cố định trên các thanh CeO2 ..................................................................................... 64 Bảng 3.3: Giá trị mô phỏng của tất cả các thành phần trong mạch tương đương Randles ..................................................................................................................... 68 Bảng 3.4: So sánh các thông số phân tích của các cảm biến ADN Salmonella khác nhau .......................................................................................................................... 69 Bảng 4. 1: Thông tin các chuỗi ADN ...................................................................... 78 Bảng 4.2: Các thông số phân tích của các cảm biến sinh học để phát hiện Salmonella ................................................................................................................ 84 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh mô phỏng phân tử ADN với 2 chuỗi xoắn kép .......................... 7 Hình 1.2: Cấu tạo chuỗi polynucleotit và các nucleo bazo ....................................... 8 Hình 1.3: Đồ thị quét thế vòng .................................................................................. 9 Hình 1.4: Đồ thị CV cảm biến ADN trước và sau khi lai hóa các chuỗi ssADN ... 11 Hình 1.5: Dạng thế quét và đồ thị dòng-thế phương pháp quét thế xung vi phân .. 12 Hình 1.6: Dạng thế quét và đồ thị dòng-thế phương pháp quét thế xung vuông .... 12 Hình 1.7: Mạch tương đương của bình điện phân ................................................... 13 Hình 1.8: Tổng trở quá trình Faraday Zf.................................................................. 13 Hình 1.9: Giản đồ Nyquist phổ tống trở điện hóa EIS ............................................ 14 Hình 1.10: Các kỹ thuật cố định ssADN dò quan trọng lên điện cực...................... 15 Hình 1. 11: Sơ đồ chế tạo cảm biến ADN sử dụng hạt PANAM-Au ...................... 17 Hình 1.12: Sơ đồ cố định và lai hóa ADN lên bề mặt điện cực Au ........................ 18 Hình 1.13: Sơ đồ cố định ssADN dò thông qua tương tác streptavidin – biotin ..... 19 Hình 1.14: Sơ đồ các kiểu liên kết của chất chỉ thị oxy hóa khử tới bề mặt ADN . 22 Hình 1.15: Sơ đồ cảm biến điện hóa ADN dựa trên nhãn enzyme theo Gang Liu . 23 Hình 1.16: Sơ đồ cảm biến ADN dựa trên nhãn hạt nano Fe3O4/TMC/Au ............ 25 Hình 1.17: Sơ đồ sự phát hiện điện hóa ADN không đánh dấu theo R. Nurmalasari .................................................................................................................................. 26 Hình 1.18: Sơ đồ sự phát hiện điện hóa ADN không dán nhãn .............................. 27 Hình 1.19: Đồ thị quét thế vòng (A) và đồ thị Nyquist (B) của cảm biến ADN ..... 28 Hình 2.1: Quy trình tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 bằng phương pháp thủy nhiệt .......................................................................................................................... 35 Hình 2.2: Quy trình tổng hợp CeO2@Ppy ............................................................... 36 Hình 2.3: Ảnh FESEM CeO2 NRs phụ thuộc nồng độ chất tạo mầm Na3PO4........ 38 Hình 2.4: Phổ nhiễu xạ tia X của CeO2 khi thay đổi nồng độ các chất tạo mầm .... 39 Hình 2.5: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi nồng độ Ce3+ thay đổi .......................... 40 Hình 2.6: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 thủy nhiệt khi nhiệt độ thay đổi ................. 41 Hình 2.7: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi thời gian thay đổi ................................. 43 Hình 2.8: Giản đồ nhiễu xạ tia X mẫu CeO2 khi thời gian thủy nhiệt ..................... 44 Hình 2.9: Phổ tán sắc năng lượng tia X của các thanh nano CeO2 ......................... 45 x Hình 2.10: Cơ chế hình thành CeO2 cấu trúc nano ................................................. 46 Hình 2.11: Cơ chế hình thành thanh nano CeO2 ..................................................... 46 Hình 2.12: Hình ảnh FESEM của mẫu poly pyrol tinh khiết .................................. 47 Hình 2.13: Ảnh FESEM nano composit CeO2- Ppy phụ thuộc tỷ lệ CeO2/Py....... 49 Hình 2.14: Ảnh hưởng của thời gian polyme hóa đến hình thái bề mặt của nano composit CeO2-Ppy đặc trưng bởi FESEM ..................................................... 50 Hình 2.15: Hình thái cấu trúc của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy đặc trưng bởi: (a)- FESEM và (b)– TEM ................................................................. 51 Hình 2.16: Phổ EDS của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy ............... 52 Hình 2.17: (A)- Giản đồ nhiễu xạ tia X và (B)- phổ FT-IR của các mẫu vật liệu... 52 Hình 2.18: Giản đồ phân tích nhiệt.......................................................................... 54 Hình 3.1: Sơ đồ cố định ssADN lên bề mặt điện cực .............................................. 61 Hình 3.2: Sơ đồ chế tạo cảm biến ADN trên cơ sở các thanh nano CeO2 .............. 62 Hình 3.3: Phổ FTIR của (a)- CeO2; (b)- ssADN và (c)- ssADN/CeO2 ................... 63 Hình 3.4: Phổ UV-vis của (a)- chuỗi ssADN và (b)- ssADN/CeO2 ........................ 65 Hình 3.5: Ảnh huỳnh quang của cảm biến trên cơ sở CeO2 NRs ............................ 66 Hình 3.6: Giản đồ Nyquist đo trong dung dịch đệm pH = 7 ................................... 66 Hình 3.7: Tín hiệu ra của cảm biến ADN phụ thuộc vào [dsADN] ........................ 68 Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến tín hiệu ra của cảm biến .................................... 70 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ ion đến tín hiệu ra của cảm biến ...................... 71 Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ ssADN dò đến tín hiệu ra của cảm biến ........ 72 Hình 3.11: Ảnh hưởng của thời gian lai hóa đến tín hiệu ra của cảm biến ............. 73 Hình 3.12: Các đặc trưng của cảm biến trên cơ sở CeO2 NRs ................................ 74 Hình 4.1: Ảnh huỳnh quang của cảm biến trên cơ sở CeO2 NR@Ppy ................... 80 Hình 4.2: Phổ hồng ngoại FTIR cảm biến trên cơ sở CeO2-NR@Ppy .................. 81 Hình 4.3: Đường cong CV- (A) và đồ thị Nyquist của cảm biến- (B) .................... 82 Hình 4.4: Giản đồ Nyquist (a) và đồ thị ∆Ret (b) phụ thuộc [ssADN đích] ............ 83 Hình 4.5: Tối ưu các điều kiện thực nghiệm ........................................................... 86 Hình 4.6: Các đặc trưng riêng của cảm biến ........................................................... 87 Hình 4.7: Sơ đồ biểu diễn phương pháp phát hiện vi khuẩn Salmonella ................ 88 xi Hình 4.8: So sánh kết quả phát hiện mẫu vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR với số liệu của cảm biến ADN .......................................... 89 xii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, bệnh dịch do vi sinh vật gây ra đang là mối hiểm hoạ không thể lường trước được. Trong những năm qua đã có hàng chục nghìn người chết bởi các loài vi sinh vật gây bệnh như: vi rút H5N1, SARS, vi khuẩn gây bệnh tả, vi rút viêm não Nhật Bản... gây ra. Trong số đó, căn bệnh thương hàn do chủng vi khuẩn Salmonella gây ra đã khiến hàng chục triệu người mắc bệnh với số người chết lên tới hàng triệu người. Theo thống kê của Bộ y tế [1] ở Việt Nam tỷ lệ mắc thương hàn tính trên 100.000 dân trong năm: 2010 là 64,4; 2011 là 56,8, trong đó tỷ lệ tử vong là 0,02/100.000 dân; tới năm 2016 là 0,58. Tính riêng cho đối tượng là trẻ em số ca mắc thương hàn do khuẩn Salmonella theo các năm 2012, 2013, 2014, 2015 và 2016 lần lượt là: 613, 706, 469, 492, 374 với số trẻ chết được ghi nhận vào năm 2014 là 3 trẻ. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh đang là yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các nhà khoa học cũng như của các hãng công nghiệp. Hiện nay, các phương pháp phân tích nhanh vi sinh vật thường được sử dụng là PCR, ELISA, nuôi cấy tế bào... là các phương pháp phân tích truyền thống trong công nghệ sinh học. Trong đó, các xét nghiệm miễn dịch như ELISA chỉ có thể phát hiện được Salmonella ở giới hạn 104 đến 105 CFU/mL, với thời gian làm giàu mẫu mất khoảng 16 h đến 24 h và giới hạn này được cải thiện bằng phương pháp phản ứng chuỗi PCR xuống tới 5 CFU/mL [2]. Việc lấy mẫu xét nghiệm đòi hỏi quy trình khắt khe, các thí nghiệm phải được thực hiện trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn của tổ chức Y tế thế giới, trang thiết bị đắt tiền. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển phương pháp bổ sung cho các phương pháp này là việc hết sức cần thiết. Trong đó, sử dụng cảm biến sinh học được cho là phương pháp hiệu quả, bổ sung cho các phương pháp truyền thống do cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, dễ dàng sử dụng, thời gian phân tích nhanh và cho kết quả tin cậy [2],[3]. Cảm biến sinh học là một thiết bị phân tích trên cơ sở kết hợp giữa phần tử sinh học và bộ phận chuyển đổi tín hiệu để chuyển đổi các tín hiệu sinh hoá thành tín hiệu dễ dàng cho người quan sát. Do các phân tử sinh học không thể tự gắn được 1 lên bề mặt cảm biến, do đó cần có một lớp vật liệu trung gian để cố định giữa bộ chuyển đổi và phân tử sinh học. Lớp vật liệu này không chỉ gắn kết thành phần sinh học và bề mặt cảm biến mà nó còn đóng vai trò chuyển điện tích từ dung dịch đến bề mặt cảm biến. Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại vật liệu được sử dụng để gắn kết phân tử sinh học lên bề mặt cảm biến như ống nano cacbon [4][5], polyme dẫn [6], các vật liệu ô xít kim loại bán dẫn [7], các hạt nano kim loại [8], các vật liệu ô xít kim loại đất hiếm [9] ...v.v. CeO2 cấu trúc nano là một trong các vật liệu hứa hẹn nhất đói với cảm biến sinh học điện hóa do các đặc tính hấp dẫn như là tính bền hóa học, tương thích sinh học, không độc, bề mặt riêng cao, dẫn điện và đặc tính vận chuyển electron cao. CeO2 có năng lượng vùng cấm rộng, Eg = 3,4 eV và điểm đẳng điện cao IEP = 9,2. Điều này rất thích hợp cho việc hấp phụ các phân tử có điểm đẳng điện thấp mà không cần bất kỳ xử lý hóa học nào [10]. Tuy nhiên, các công trình công bố chủ yếu sử dụng điện cực dạng màng cấu trúc đơn pha chỉ bao gồm các hạt oxit kim loại để phát triển cảm biến sinh học sẽ có hiện tượng giảm diện tích bề mặt riêng do sự co cụm và mất biên giới giữa các hạt, dẫn đến làm giảm khả năng hấp phụ các tác nhân. Để tránh được hiện tượng nêu trên, thường là tạo một lớp hấp phụ các phân tử tác nhân trên bề mặt hạt, cũng đồng thời nâng cao hiệu suất của cảm biến: tăng độ nhạy, giảm giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, tác giả đã lựa chọn cách bao phủ các thanh nano CeO2 (vật liệu được nghiên cứu) bằng lớp màng mỏng poly pyrol (Ppy) để tạo vật liệu lai hóa Ppy@CeO2 cấu trúc lõi-vỏ. Điều thú vị ở đây là Ppy với giá trị hàm công (chênh lệch năng lượng giữa mức Fermi và năng lượng chân không) khoảng 5,0 eV [11] và CeO2 có giá trị hàm công là 5,34 eV [12] khi tiếp xúc các electron lẻ của Ppy dễ dàng chuyển sang các orbital trống của Ce với cấu hình 3d94f0 trong CeO2, tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa “Salmonella ssADN dò” và vỏ PPy. Khi đó cấu trúc lõi-vỏ này đảm bảo được độ xốp, cùng những khoảng trống không gian chứa dung dịch có tác nhân phân tích để tạo ra cảm biến ADN đối với vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp ở người. “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến ADN” là đề tài mà nghiên cứu sinh hướng tới. Theo đó việc tập 2 trung nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano (CeO2 NRs) có kích thước phù hợp và trên bề mặt được che phủ bởi lớp PPy tạo thành cấu trúc lõi-vỏ với lớp hấp phụ “Salmonella ssADN dò”, tạo thành một cảm biến sinh học phát hiện khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy ở người. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Mục tiêu chung của đề tài là phát triển cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp. Mục tiêu cụ thể: ✓ Tổng hợp được vật liệu nano một chiều CeO2 và vật liệu nano composit CeO2@Ppy có cấu trúc lõi vỏ. ✓ Phát triển được cảm biến ADN hiệu suất cao trên cơ sở vật liệu nano một chiều CeO2 chế tạo được. 3. Nội dung nghiên cứu của luận án - Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 và vật liệu CeO2@Ppy có cấu trúc lõi vỏ. - Nghiên cứu cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến. - Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các vật liệu đã chế tạo được nhằm phát hiện đoạn ADN của vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp. 4. Phương pháp nghiên cứu Trong quá trình thực hiện luận án này, tác giả đã sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, trong đó: - Vật liệu thanh nano CeO2 được tổng hợp bằng phương pháp thuỷ nhiệt, vật liệu có cấu trúc lõi vỏ CeO2@Ppy được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp hóa học. - Đặc trưng hình thái, cấu trúc vật liệu đã được nghiên cứu bằng các phương pháp như: Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEMJEOL/JSM-7600F); phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS); phương pháp phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD); phương pháp phân tích phổ hồng 3 ngoại (FTIR), phương pháp phân tích nhiệt (TGA) thực hiện trên thiết bị Labsys TG/DSC (SETARAM – Pháp). - Đặc trưng của cảm biến đã được nghiên cứu bằng phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) và phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa (EIS) thực hiện trên thiết bị IM6-Thales tại Viện AIST trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Trong bối cảnh ngày càng có nhiều loại dịch bệnh do các loài vi sinh vật gây ra, sự ra đời của các công cụ phát hiện sớm các vi sinh vật như cảm biến ADN là hết sức quan trọng. Trong nghiên cứu này, cảm biến sinh học đã được phát triển trên cơ sở vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano và vật liệu lai giữa CeO2 và polyme dẫn. Cơ chế phát hiện của cảm biến đã được giải thích rõ ràng trên cơ sở sự tương tác của chuỗi ssADN dò với ssADN đích. Cảm biến ADN sau khi được phát triển sẽ góp phần vào sự phát triển phương pháp phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học và môi trường. 6. Những đóng góp mới của luận án Những nghiên cứu của luận án đã mang lại những đóng góp mới bao gồm: - Đã tổng hợp được vật liệu thanh nano CeO2 có chiều dài ~200 nm và đường kính ~20 nm bằng phương pháp thủy nhiệt đơn giản với tiền chất ban đầu là Ce(NO3)3.6H2O và chất khoáng hóa Na3PO4, thời gian thủy nhiệt ngắn (24 h) và nhiệt độ 200 oC. - Đã chế tạo được vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2/Ppy bằng phương pháp trùng hợp hóa học với tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian tổng hợp 6 h, trong dung dịch chứa FeCl3.6H2O. - Đã phát triển được cảm biến ADN điện hóa trên cơ sở vật liệu thanh nano CeO2 nhằm xác định vi khuẩn Salmonella với giới hạn phát hiện và độ nhạy tương ứng là 0,01 µM và 3362,1 ΩµM-1cm-2. Khoảng phát hiện tuyến tính từ 0,01 µM đến 2 µM. 4 - Đã phát triển một cảm biến sinh học ADN dựa trên vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2-NR@Ppy nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella với khoảng tuyến tính là 0,01÷0,4 nM, độ nhạy 593,7 ΩnM-1cm-2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cảm biến ADN tương ứng là 0,084 nM và 0,28 nM. 7. Cấu trúc của luận án Bản luận án được trình bày theo bố cục như sau: MỞ ĐẦU Chương 1: Trình bày tổng quan về “Cảm biến sinh học điện hóa”. Chương 2: Trình bày về kết quả “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 và nano composit CeO2@Ppy”. Chương 3: Trình bày về kết quả nghiên cứu về “Cảm biến ADN độ nhạy cao trên cơ sở các thanh nano CeO2. Chương 4: Trình bày về kết quả nghiên cứu về “Cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu nano composit CeO2@Ppy”. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO 5 Chương 1: CẢM BIẾN ADN ĐIỆN HÓA Hiện nay, cùng với các phương pháp phân tích truyền thống như PCR, ELISA, cảm biến sinh học cũng đang dần trở thành thiết bị bổ sung hiệu quả để xác định vi sinh vật gây bệnh. Cảm biến sinh học đầu tiên trên thế giới được nghiên cứu bởi L.D. Clark vào năm 1962 là cảm biến sinh học enzym dùng để phát hiện gluco trong máu [13]. Kể từ đó, cộng đồng nghiên cứu từ các lĩnh vực khác nhau như: vật lý, hóa học, vật liệu… đã cùng nhau nghiên cứu phát triển loại cảm biến này ngày hoàn thiện hơn nữa. Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm: 1) Bộ chuyển đổi (transducer): là các cảm biến vật lý hoặc hoá học giúp chuyển đổi các tín hiệu thu được do các phản ứng sinh hóa tạo ra thành các tín hiệu có thể quan sát được. 2) Tác nhân cố định: là thành phần làm cầu nối giúp gắn kết các phần tử sinh học lên trên bề mặt cảm biến. Tác nhân cố định thường là các vật liệu polyme dẫn, ống nano cacbon, ô xít kim loại, vật liệu nano composit hoặc vật liệu lai [5–7], [11]. 3) Phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor): là enzym, kháng thể, đoạn ssADN…[15], có vai trò tương tác với chất cần phân tích tạo ra các tín hiệu đặc trưng, các tín hiệu này được phát hiện bằng bộ chuyển đổi. Ngoài ra, nó còn có bộ phận chuyển đổi và xử lý tín hiệu. Có nhiều cách để phân loại cảm biến sinh học. Dựa vào các phần tử sinh học, nó được chia thành cảm biến enzym, cảm biến miễn dịch và cảm biến ADN…v.v. Nếu dựa vào bộ chuyển đổi tín hiệu, cảm biến sinh học được chia thành cảm biến quang, cơ, nhiệt, điện. Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi tín hiệu điện được sử dụng nhiều hơn cả do nó có cấu tạo đơn giản, thiết bị nhỏ gọn, độ nhạy cao. Trong các bộ chuyển đổi tín hiệu điện, bộ chuyển đổi tín hiệu điện hoá đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Đây là bộ chuyển đổi dựa vào sự tương tác của các phân tử sinh học với các chất cần phân tích làm thay đổi tín hiệu sinh hoá, tín hiệu này sẽ được phát hiện bằng bộ chuyển đổi và hiển thị ở đầu ra của cảm biến. Trong chương này, tác giả sẽ trình bày tổng quan về cảm biến sinh học ADN điện hoá. Nội dung chương sẽ khái quát lại cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện 6 hóa, các bộ chuyển đổi sử dụng trong cảm biến sinh học ADN, phương pháp cố định, cơ chế phát hiện lai hóa và các ứng dụng của cảm biến sinh học điện hóa ADN. 1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN ADN có tên gọi đầy đủ là axit deoxyribo nucleic cấu tạo bởi 2 chuỗi polyme sinh học là các poly nucleotit liên kết với nhau hình thành cấu trúc xoắn kép xung quanh một trục tưởng tượng (Hình 1.1-(A)). Hình 1.1: Hình ảnh mô phỏng phân tử ADN với 2 chuỗi xoắn kép [16] Mỗi nucleotit được cấu tạo bởi các nucleobazo gọi tắt là bazo chứa nitơ liên kết với một phân tử đường deoxyribo và một nhóm phốt phát thông qua các liên kết hóa học. Các nucleotit liên kết với nhau thông qua liên kết hóa học giữa phân tử đường của nucleotit đứng trước với nhóm phốt phát của nucleotit đứng sau. Các chuỗi poly nucleotit của ADN liên kết với nhau thông qua liên kết hydro giữa các cặp bazo A-T và C-G theo nguyên tắc bổ sung cặp bazo. Trong đó A chỉ liên kết với T thông qua 2 liên kết hydro còn C chỉ liên kết với G thông qua 3 liên kết hydro và ngược lại để tạo nên chuỗi dsADN mạch kép như được mô tả ở Hình 1.1-(B). Ở đó, 4 loại bazo trong cấu trúc ADN bao gồm: C- Cytosine và T- thymine là 2 bazo có 7