Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp protein ns1 của virus dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Chu Thị Minh Hải NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PROTEIN NS1 CỦA VIRUS DENGUE ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2018 Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là công trình do chính tôi nghiên cứu, học viên Chu Thị Minh Hải, chuyên ngành Thạc sĩ Công nghệ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hoàn thành dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Quốc Phong. Một số nhiệm vụ nghiên cứu là thành quả tập thể và đã được đồng sự cho phép sử dụng.Các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các luận văn khác. Tác giả luận văn Chu Thị Minh Hải i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, người đã hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài, người đã dạy tôi những kiến thức quý báu trong thực tiễn cũng như thái độ, phương pháp làm việc khoa học. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo động viên của các anh/chị /em làm tại phòng thí nghiệm proteomic, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Họ đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo của Viện công nghệ Sinh học, Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy tôi trong suốt những năm học qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân, họ là những người luôn sát cánh, động viên tôi vượt qua những khó khăn để có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất. Do điều kiện, khả năng và thời gian thực hiện đề tài có hạn đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong nhận sự đóng góp của các thầy cô và các bạn để đề tài này được hoàn thiện hơn nữa. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 4 năm 2018 Học viên Chu Thị Minh Hải ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU Chƣơng I: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3 1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết trên thế giới và tại Việt nam. .................. 3 1.1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết trên thế giới. ......................................... 3 1.1.2.Tình hình dịch SXHD diễn ra tại khu vực Đông Nam Á. ............................ 6 1.1.3.Tình hình dịch bệnh SXHD diễn ra tại Việt Nam ........................................ 7 1.1.4. Diễn biến thể hiện lượng virus Dengue trong máu người bênh sốt xuất huyết ………………………………………………………………....................….10 1.2. Đặc điểm của virus Dengue ................................................................................. 12 1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu trúc và di truyền của virus Dengue ...................... 12 1.2.2. Đặc điểm protein của virus Dengue ........................................................... 14 1.2.2.1. Protein cấu trúc .................................................................................... 14 1.2.2.2. Protein không cấu trúc ......................................................................... 14 1.3. Protein NS1 của virus Dengue ...................................................................... 15 1.3.1. Đặc điểm của protein NS1.......................................................................... 16 1.3.2.Vai trò và ứng dụng của NS1 ...................................................................... 19 1.3.2.1.Ứng dụng tạo vaccine chống SXHD ..................................................... 19 1.3.2.2. NS1 là mục tiêu cho thuốc chống virus ............................................... 20 1.3.2.3.Ứng dụng trong chẩn đoán DENV........................................................ 20 iii 1.4. Một số phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue ............................... 21 1.4.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng ................................... 22 1.4.1.1. Sốt xuất huyết Dengue ......................................................................... 22 1.4.1.2. Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo ...................................... 23 1.4.1.3. Sốt xuất huyết Dengue nặng ................................................................ 23 1.4.2. Phương pháp phân lập virus ....................................................................... 23 1.4.3. Phương pháp chẩn đoán dựa trên phát hiện acid nucleic ........................... 24 1.4.3.1. Phương pháp RT-PCR ......................................................................... 24 1.4.3.2. Phương pháp Real-time RT-PCR ........................................................ 25 1.4.4. Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết thanh ..................................................... 25 1.4.4.1. Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu(Hemagglutination Inhibition).......................................................................................................... 25 1.4.4.2. Phương pháp miễn dịch enzyme phát hiện kháng thể IgM (MACELISA)………………… .................................................................................. 26 1.4.4.3. Phương pháp chẩn đoándựa trên protein kháng nguyên NS1 .............. 27 Chƣơng II: VẬT LỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 32 2.1.Vật liệu ........................................................................................................... 32 2.1.1. Mẫu RNA virus Dengue ............................................................................. 32 2.1.2.Vector tách dòng ......................................................................................... 32 2.1.3.Vector biểu hiện .......................................................................................... 33 2.1.4.Vật chủ biểu hiện ......................................................................................... 34 2.2. Môi trường – Hóa chất .................................................................................. 35 2.3. Thiết bị ........................................................................................................... 36 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 36 2.4.1. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 36 2.4.1.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ........................................................... 36 2.4.1.2. Phương pháp giữ giống vi sinh vật.......................................................... 37 2.4.1.3. Phương pháp tạo tế bào khả biến ............................................................ 37 2.4.1.4. Biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3) ..... 38 iv 2.4.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................... 38 2.4.2.1. Phương pháp tạo cDNA mã hóa gen NS1 bằng enzyme phiên mã ngược38 2.4.2.2. Phương pháp khuếch đại gen mã hóa NS1 bằng PCR ........................... 39 2.4.2.3. Phương pháp tách chiết DNA plasmid .................................................... 40 2.4.2.4. Phương pháp tạo cấu trúc pJET1.2::NS1 ................................................ 41 2.4.2.5. Biến nạp vào tế bào E. coli ...................................................................... 42 2.4.2.6. Cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn ............................................... 42 2.4.2.7. Tinh sạch vector pET22b(+) và đoạn gen mã hóa NS1 .......................... 43 2.4.2.8. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)::NS1 ............................................. 44 2.4.3. Phương pháp hóa sinh ................................................................................ 45 2.4.3.1. Phương pháp điện di trên gel agarose ..................................................... 45 2.4.3.2. Phương pháp điện di SDS – PAGE ......................................................... 45 2.4.3.3. Phương pháp tách chiết protein thể tan ................................................... 46 2.4.3.4. Phương pháp tách chiết protein thể vùi ................................................... 47 2.4.3.5. Phương pháp Western blot ...................................................................... 47 2.4.3.6. Phương pháp tinh sạch protein ................................................................ 48 2.4.4. Phương pháp Tin-Sinh học ......................................................................... 49 2.4.4.1. Phương pháp thiết kế mồi........................................................................ 49 2.4.4.2. Phương pháp sử dụng phần mềm MultAlin ............................................ 50 2.4.4.3. Phương pháp sử dụng phần mềm NEBcutter V2.0 ................................. 50 2.4.4.4. Phương pháp sử dụng phần mềm FastPCR ............................................. 50 2.4.4.5. Phương pháp sử dụng phần mềm BLAST .............................................. 51 2.4.4.6. Phương pháp sử dụng phần mềm Translate Tool .................................... 51 2.4.4.7. Phương pháp sử dụng phần mềm Quantity One ..................................... 50 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 53 3.2. Kết quả RT-PCR khuếch đại gen mã hóa NS1 ............................................. 56 3.3. Kết quả tách dòng gen mã hóa NS1 .............................................................. 57 3.4. Kết quả tạo cấu trúc biểu hiện mang gen mã hóa protein NS1 ..................... 58 3.4.1. Xử lý vector pET22b và pJET1.2::ns1 bằng enyme giới hạn .................... 59 v 3.4.2. Chèn gen ns1 vào vector pET22b và biến nạp vào E.coli .......................... 60 3.5. Chọn dòng E.coli mang cấu trúc biểu hiện pET22b::ns1 .............................. 61 3.5.1. Kết quả kiểm tra plasmid bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen ns1 .......... 62 3.5.2. Kiểm tra plasmid bằng cách cắt bằng enzyme giới hạn ............................. 62 3.5.3. Giải trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện pET22b::ns1 .......................... 63 3.6. Biểu hiện protein NS1 trong E.coli ............................................................... 66 3.7. Khảo sát các điều kiện biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp .............................. 67 3.7.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - IPTG ........................ 67 3.7.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống ................................................ 68 3.7.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................................... 69 3.7.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian cảm ứng .......................................... 70 3.8. Kết quả tinh sạch Protein. .............................................................................. 68 3.9. Ứng dụng chế tạo thử nghiệm que thử phát hiện nhanh kháng thể đặc hiệu kháng virus Dengue từ huyết thanh ....................................................................... 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. ............................................................................ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 73 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AP : Alkaline Phosphatase AuNPs : Gold nanoparticles (hạt nano vàng) BCIP : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : Base pairs (cặp bazo nitơ) cDNA : Complementary Deoxyribonucleic acid (DNA bổ sung) DI : Deion E.coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked ImmonuSorbent Assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme) EtBr : Ethidium Bromide HCSD : Hội chứng sốc Dengue HI : Hemagglutination Inhibition (phương pháp ức chếngưng kết hồng cầu) IgG : Immunoglobulin G IgM : Immunoglobulin M IPTG : Isopropyl β-D-1-Thioglactopyranoside Kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton LB : Luria Bertani (môi trường LB) NPT : Nitro Blue Tetrazolium vii NSP : Non-Structural Protein (protein phi cấu trúc) OD : Optical Density (mật độ quang) PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamide) PBS : Phosphate Buffered Saline (dung dịch đệm muối phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PVDF : Polyvinylidene fluoride RNA : Ribonucleic acid R-Nase : Ribonuclease RT-PCR : Revese Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng phiên mã ngược) SD : Sốt Dengue SDS : Sodium Dodecyl Sulfate Sol : Solution SXHD : Sốt xuất huyết Dengue TAE : Tris - Axit acetic - EDTA TEMED : Tera Mehylethylen Ediamine WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Thông tin trình tự hai đoạn mồi thiết kế đặc hiệu gen ns1 của virus Dengue ......................................................................................................................55 Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch gen NS1 và vector pET22b sau khi cắt bằng enzyme giới hạn ......................................................................................................................60 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Các quốc gia và khu vực có nguy cơ bùng phát dịch SXHD trên toàn thế giới, 2012 ....................................................................................................................4 Hình 1.2. Số lượng các ca mắc SXH được thông báo cho WHO hằng năm ..............5 1955-2010....................................................................................................................5 Hình 1.3. Số lượng trung bình các trường hợp mắc SXHD của 30 quốc gia/lãnh thổ có dịch cao nhất, 2004-2010 .......................................................................................5 Hình 1.4. Số ca mắc SXHD và tỉ lệ tử vong do SXHD của các quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á, 1985-2009 ............................................................................................7 Hình 1. 5. Sự phân bố của các serotype của virus Dengue tại Việt Nam ...................8 Hình 1.6. Tỉ lệ mắc SXHD và số ca chết do SXHD gây ra, 1985-2014 .....................9 Hình 1. 7. Tình hình nhiễm Dengue khu vực Phía Nam ...........................................10 Hình 1.8. Đường biểu diễn thể hiện lượng virus Dengue trong máu người bệnh sốt xuất huyết…………………………………………………………………………..13 Hình 1. 9. Hệ gen của virus Dengue và polyprotein của nó .....................................13 Hình 1. 10. Cấu trúc của virus Dengue .....................................................................13 Hình 1. 11. Cấu trúc hạt virus Dengue chưa trưởng thành và trưởng thành ( A: Hạt virus Dengue chưa trưởng thành; B: Hạt virus Dengue đã trưởng thành) ................14 Hình 1.12. Các protein của virus Dengue .................................................................15 Hình 1.13. Cấu trúc NS1 dạng dimer và dạng hexamer ...........................................17 Hình 1.14. Quá trình trưởng thành của NS1 trong quá trình xâm nhiễm của virus Dengue ......................................................................................................................19 Hình 1.15. So sánh các phương pháp chẩn đoán dựa trên độ tin cậy và tính khả thi của chúng [18] ...........................................................................................................22 Hình 1. 16. Nguyên lý của phương pháp MAC-ELISA ...........................................27 Hình 1.17. Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus Dengue theo nguyên lí sắc kí miễn dịch . .................................................................................................................29 Hình 2. 2. Cấu trúc vector pET-22b(+) .....................................................................34 x Hình 3. 1. So sánh các trình tự gen mã hóa NS1 của virus Dengue type 1 bằng phần mềm MultAlin ...........................................................................................................54 Hình 3. 2. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi NS1-D1-F/R .......................56 Hình 3.3. Kết quả PCR khuếch đại gen mã hóa NS1................................................57 Hình 3. 4. A-Kết quả điện di plasmid sau khi tách (1-6:plasmid của 6 khuẩn lạc đã chọn); B- Kết quả kiểm tra PCR (1-4: Sản phẩm PCR của plasmid của 4 dòng 1-4 tương ứng; L: Thang chuẩn 100bp); C- Kết quả cắt plasmid dòng số 2 bằng BamHI và SalI (2: Sản phẩm cắt plasmid dòng số 2 bằng enzyme giới hạn; L: Thang chuẩn) ...................................................................................................................................58 Hình 3. 5. A-Kết quả cắt vector bằng enzyme giới hạn (L: ladder 1 kb; 1: pJET1.2::ns1; 2: pET22b); B- Kết quả tinh sạch gen ns1 và pET22b sau khi cắt (L: ladder 1 kb; 1: ns1; 2: pET22b).................................................................................60 Hình 3. 6. Kết quả biến nạp vào E.coli của hỗn hợp sau khi nối pET22b(+) với ns1 ...................................................................................................................................61 Hình 3. 7. Kết quả tách plasmid của các dòng khuẩn lạc (Đường chạy 1-10 tương ứng với plasmid tách ra từ các dòng khuẩn lạc từ 1-10) ...........................................61 Hình 3. 8. A - Kết quả kiểm tra plasmid mang gen ns1 bằng PCR (1-10: Sản phẩm PCR của 10 dòng khuẩn lạc đánh số 1-10; - : Mẫu kiểm chứng âm; L- ladder 100bp); B - Kết quả kiểm tra plasmid (10) mang gen ns1 bằng enzyme giới hạn BamHI và SalI; L-Lader 1kb.....................................................................................62 Hình 3. 9. Kết quả giải trình tự đoạn gen chèn trong vector pET22b(+)và trình tự axit amin suy diễn của đoạn gen đã giải trình tự. (RBS-vị trí bám của ribosome; BamHI và SalI là vị trí cắt của hai enzyme giới hạn) ...............................................64 Hình 3. 10. Kết quả so sánh trình tự gen đã chèn vào vector pET22b trong nghiên cứu này với các trình tự gen trên NCBI ....................................................................65 Hình 3. 11. A- Kết quả điện di SDS-PAGE của mẫu protein thu được từ dòng E.coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang cấu trúc pET22b::ns1. Đường chạy 1, phổ protein dịch chiết từ E. coli mang cấu trúc pET22::ns1; Đường chạy 2, phổ protein dịch chiết từ E. coli không mang genns1; B- Kết quả western blot của mẫu protein tương ứng ..66 xi Hình 3. 12. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của protein NS1 trong vi khuẩn E.coli. Đường chạy 1-8 tương ứng là với nồng độ IPTG là 0,05 mM; 0,1 mM; 0,3 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1,0 mM; 1,3 mM và 1,5 mM .................68 Hình 3. 13. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến sự biểu hiện của protein NS1 trong E.coli ........................................................................................................69 Hình 3. 14. Khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự biểu hiện của protein NS1 trong vi E.coli ...................................................................................................70 Hình 3. 15. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian cảm ứng đến sự biểu hiện của protein NS1 trong vi khuẩn E.coli.............................................................................71 xii MỞ ĐẦU Sốt Dengue (SD), sốt xuất huyết Dengue (SXHD) và hội chứng sốc Dengue (HCSD) là bệnh do virus Dengue gây ra, bệnh lây lan từ người sang người, vector truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti. Trong suốt nhiều thập kỷ qua, tỉ lệ mắc bệnh SD, SXHD và HCSD vẫn không ngừng tăng lên, hiện nay chưa có vắc xin phòng ngừa cũng như chưa có thuốc đặc trị.Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hiện tại có khoảng 3,9 tỷ người - chiếm khoảng hơn 40% dân số thế giới, ở các quốc gia có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới đang có nguy cơ mắc bệnh SXHD. Dengue là một trong những virus nguy hiểm nhất đe dọa đến hơn 1/3 dân số thế giới ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo WHO, có tới 390 triệu trường hợp mắc SD mỗi năm trên toàn thế giới và có khoảng 3.9 % người nhiễm dengue bị chết hằng năm. Tại Việt Nam, riêng từ đầu năm 2017 đến 8/2017 đã có 80.555 trường hợp mắc SXH và trong đó có 22 trường hợp tử vong [21], [22]. Protein NS1 của virus Dengue là một glycoprotein có độ tương đồng và tính bảo thủ cao, tồn tại cả ở dạng liên kết màng (kể cả ở trong tế bào cũng như ở trên bề mặt của tế bào) và dạng tiết ra ngoại bào, xuất hiện trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm virus Dengue giai đoạn sớm, có thể phát hiện trước khi hình thành các kháng thể Dengue IgM và IgG. Hiện nay việc chẩn đoán virus Dengue có nhiều phương pháp như: Làm các xét nghiệm cận lâm sàng; các xét nghiệm miễn dịch như phát hiện kháng nguyên NS1 (ELISA-NS1) đã được sử dụng để phát hiện protein NS1 của virus Dengue, tuy nhiên phương pháp này không thể định týp, sinh phẩm đắt. Phương pháp huyết thanh lọc phát hiện kháng thể bằng kỹ thuật Mac-ELISA, hoặc phân lập virus thường cho kết quả chậm không phù hợp trong chẩn đoán và điều trị, chủ yếu phục vụ cho công tác giám sát dịch tễ. Kỹ thuật sinh học phân tử Nested RT-PCR, real-time RT-PCR để chẩn đoán virus Dengue đã được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán. Tuy nhiên các phương pháp này vẫn chưa được áp dụng phổ biến và ứng dụng thực tiễn tại Việt Nam do chi phí cao, hạn chế về trang bị và đội ngũ nhân viên làm xét nghiệm. Việc tạo ra một phương pháp phát hiện nhanh, chính xác virus Dengue ở giai đoạn sớm nhiễm bệnh là vô cùng quan trọng và cần thiết, góp phần cho các bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả và kịp thời bảo đảm sức khỏe cho người bệnh. 1 Xuất phát từ tình hình đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp Proteins NS1 virus Dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán” để phục vụ phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh virus Dengue phù hợp điều kiện tại Việt Nam. Mục tiêu của đề tài: - Tạo được protein NS1 tái tổ hợp để ứng dụng phát triển kit chẩn đoán nhanh. Nội dung nghiên cứu: - Tách dòng gen mã hóa protein NS1 từ virus Dengue - Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp phù hợp chủng chủ E.coli - Biểu hiện và tinh sạch protein NS1 - Sử dụng NS1 tái tổ hợptạo thử nghiệm que thử phát hiện nhanh kháng thể đặc hiệu virus Dengue từ huyết thanh. 2 Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1. Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết trên thế giới và tại Việt nam. 1.1.1. Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết trên thế giới. Sốt Dengue (SD), sốt xuất huyết Dengue (SXHD) và hội chứng sốc Dengue (HCSD) là bệnh do virus Denguegây ra, bệnh lây lan từ người sang người, vector truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti. Trong suốt nhiều thập kỷ qua, tỉ lệ mắc bệnh SD, SXHD và HCSD vẫn không ngừng tăng lên, hiện nay chưa có vắc xin phòng ngừa cũng như chưa có thuốc đặc trị. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hiện tại có khoảng hơn 3.9 tỷ người chiếm khoảng hơn 40% dân số thế giới, ở các quốc gia có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới đang có nguy cơ mắc bệnh SXHD. Ước tính có tới 390 triệu trường hợp mắc SD mỗi năm trên toàn thế giới. Hằng năm, có khoảng hơn 500.000 trường hợp ca mắc SXHD nghiêm trọng cần phải nhập viện. Trong đó, một tỉ lệ rất lớn(khoảng 90%) là trẻ em dưới 5 tuổi. Và khoảng 5% của các trường hợp nhiễm Dengue bị chết hằng năm[17], [16], [22]. Dịch SD được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1635 tại phía Tây của nước Pháp và đại dịch SXHD được ghi nhận tại Philippines vào những năm 1953-1954 và tại Thái Lan năm 1958 [16]. Trước năm 1970, chỉ có 9 quốc gia xuất hiện dịch SXHD. Ngày nay, SD và SXHD đã ảnh hưởng đến hơn 100 quốc gia và vùng lãnh thổ trên toàn thế giới, trong đó có 20 nước châu Phi, 42 nước Châu Mỹ, 7 nước Đông Nam Á, 4 nước phía đông Địa Trung Hải và 29 nước thuộckhu vực Tây Thái Bình Dương. Đặc biệt, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương là hai khu vực bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất với hơn 2,3 triệu trường hợp được công bố nhiễm SXHD trong năm 2010 [17]. Hằng năm, có hằng trăm nghìn ca nhiễm SXHD nghiệm trong và có khoảng 20.000 trường hợp tử vong do mắc SXHD[15]. Dịch bệnh sốt xuất huyết đang gia tăng thường xuyên, trong thời kì dịch diễn ra, tỉ lệ mắc bệnh đối với những người trước đây chưa từng tiếp xúc với virus Dengue lên tới 40% đến 50% thậm chí có thể đạt tới 80%90%[16]. Vào năm 2012, dịch SXHD đượcWHO xếp hạng là một trong những bệnh lây truyền qua muỗi đáng phải quan tâm nhất. Dịch bệnh SXHD bùng phát đã gây ra những thiệt hại rất lớn về con người, gây ra những gánh nặng cho hệ thống y tế 3 và nền kinh tế của hầu hết các nước nhiệt đới trên toàn thế giới. Sự xuất hiện và lan truyền của 4 serotype virus Dengue từ châu Á tới châu Mỹ, châu Phi và các vùng Địa Trung Hải đã cho thấy nguy cơ xảy ra một đại dịch toàn cầu [15]. Hình 1.1: Các quốc gia và khu vực có nguy cơ bùng phát dịch SXHD trên toàn thế giới, 2012 [17] Trong 50 năm qua, số ca mắc bệnh SXHD đã tăng lên khoảng 30 lần trên toàn cầu, và sự gia tăng mở rộng địa lí của dịch SD tới các quốc gia mới. Trong giai đoạn mười năm, con số mắc SD/SXHD được báo cáo cho Tổ chức Y tế thế giới tiếp tục tăng theo cấp số nhân. Từ năm 2000 đến năm 2008, số ca mắc SD/SXHD được báo cáo là 1.656.870, gấp 3,5 lần giai đoạn 1990-1999 (479.848 ca). Trong năm 2008, có 69 quốc gia có sự hiện diện của SD/SXHD tập trung ở Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương và châu Mỹ [16]. Năm 2008 số ca mắc SD/SXHD được ghi nhận tại Châu Mỹ, Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương đã vượt quá 1,2 triệu và con số này là 2,3 triệu vào năm 2010. Gần đây, số ca mắc SD/SXHD được báo cáo ngày càng gia tăng. Riêng tại châu Mỹ năm 2010 đã ghi nhận 1,6 triệu trường hợp sốt Dengue trong đó 49.000 trường hợp là sốt Dengue nặng[18]. Không những số ca mắc SD tăng lên hàng năm ở các khu vực đã có SD, mà ngày càng có nhiều khu vực mới có bệnh nhân mắc SD, và con số gia tăng ở tốc độ bùng nổ. Năm 2010 những ca SD đầu tiên được ghi nhận đầu tiên tại Pháp và Croatia. Năm 2012 trên đảo Madeira của Bồ Đào Nha dịch SXH đã bùng phát với 4 1.800 ca được ghi nhận và thêm năm quốc gia khác của châu Âu cũng ghi nhận những trường hợp xuất hiện SD[17]. Hình 1.2: Số lượng các ca mắc SXH được thông báo cho WHO hằng năm 1955-2010 [15] Hình 1.3: Số lượng trung bình các trường hợp mắc SXHD của 30 quốc gia/lãnh thổ có dịch cao nhất, 2004-2010 [15] 5 1.1.2. Tình hình dịch SXHD diễn ra tại khu vực Đông Nam Á. Trong số 2,5 tỉ người trên toàn thế giới đang sống trong các quốc gia và khu vực có nguy cơ mắc SXHD thì có khoảng 1,3 tỉ người sống ở khu vực Đông Nam Á [16]. Kể từ năm 2000, dịch SXHD đã lan rộng tới nhiều quốc gia trong khu vực này, năm 2003 chỉ có 8 quốc gia gồm Bangladesh, Ấn Độ,Indonesia, Maldives, Myanmar, Sri Lanka, Thái Lan và Timor-Leste có dịch SXHD nhưng đến năm 2009 thì tất cả các quốc gia trong khu vực đều đã xuất hiện các trường hợp nhiễm SD [18]. Các quốc gia trong vùng Đông Nam Á được chia thành 4 vùng khí hậu riêng biệt với khả năng lan truyền bệnh SXHD khác nhau. Dịch SXHD là một trong những các vấn đề quan trọng đối với sức khỏe của người dân ở các quốc gia như Indonesia, Myanmar, Sri Lanka, Thái Lan, Timor-Leste, nơi có khí hậu nhiệt đới gió mùa và cũng là vùng xích đạo nơi nuỗi Aedes aegypti phổ biến từ thành thị cho tới nông thôn, ở đây có nhiều serotype virus lưu hành và SXHD là một trong những nguyền nhân hàng đầu gây nhập viện cũng như gây ra các ca tử vong ở trẻ em [18]. Theo báo cáo của WHO cho thấy, tỉ lệ các ca tử vong ở trong khu vực này xấp xỉ khoảng 1%, nhưng ở Ấn Độ, Indonesia và Myanmar. Dịch bệnh xảy ra ở các khu vực cách xa các vùng thành thị thì tỉ lệ các ca tử vong có thể lên tới 3-5% [18]. Tại Indonesia, nơi hơn 35% dân số sống ở các khu vực thành thị, đã có 150.000 ca mắc SXHD vào năm 2007 với hơn 25.000 trường hợp được xác nhận là từ thủ đô Jakarta và Đông Java. Tỉ lệ tử vong đạt xấp xỉ 1% [18]. Tại Thái Lan, dịch SXHD được xảy ra trên cả 4 vùng: phía Bắc, vùng Trung tâm, Đông Bắc và phía Nam. Trong tháng 6 năm 2007, dịch bệnh bùng phát ở các tỉnh: Trat, Bangkok, Chiangrai, Phetchabun, Phitsanulok, Khamkaeng Phet, Nakhon Sawan và Phit Chit. Tổng số ca mắc SXHD được báo cáo từ tháng 1 đến tháng 11 năm 2007 là 58.836 trường hợp, tỉ lệ tử vong tại Thái Lan là 0,2% [18]. 6 Hình 1.4: Số ca mắc SXHD và tỉ lệ tử vong do SXHD của các quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á, 1985-2009[16] 1.1.3. Tình hình dịch bệnh SXHD diễn ra tại Việt Nam Việt Nam là một trong những quốc gia nằm trong vùng dịch tễ lan truyền của virus Dengue.Theo WHO, Việt Nam là quốc gia đứng thứ 3 trên toàn thế giới về số ca mắc SXH (Hình 1.3). SXHD xuất hiện ở Việt Nam từ 1959 kể từ đó đến nay SXH đã gây nhiều ca tử vong, cũng như các trường hợp phải nhập viện, đặc biệt là ở trẻ em tại miền Nam Việt Nam. Tại Việt Nam, SXHD xảy ra ở mọi thời điểm trong năm, đặc biệt tập trung vào các mùa mưa, ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước nhưng vùng dịch phổ biến ở các tỉnh miền Trung và miền Nam. Ở miền Bắc tỉ lệ mắc SXHD thấp hơn so với các khu vực còn lại do điều kiện khí hậu.Những năm đầu SXHD chỉ xuất hiện ở một vài địa phương với các ổ dịch nhỏ, số người mắc bệnh ít, tỷ lệ tử vong cao. Những năm sau, SXHD lan rộng trên nhiều tỉnh thành với số ca bệnh ngày càng gia tăng. Đỉnh cao là các năm 1983, 1987 với qui mô toàn quốc. Tỷ lệ mắc chung cho cả nước từ 41,02 (1981) đến 462,24/100.000 dân (1987). Do công tác điều trị đạt được nhiều tiến bộ nên tỷ lệ tử vong giảm từ 2,7 (1983) xuống còn 0,16 (1994)/100.000 dân. Năm 1996, SXHD được ghi nhận trong 44 trên 53 tỉnh thành trong cả nước. Năm 1998, dịch SXH bùng phát ở 19 tỉnh thành phía Nam với 119429 ca mắc (438,9/100000 dân) và 342 ca chết (1,26/100000 dân) [4]. 7