Tài liệu Nghiên cứu tính sinh miễn dịch của các epitope kháng nguyên ha của virus cúm ah5n1 đã được dự đoán bằng phương pháp tin sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HỒNG KIM NGHIÊN CỨU TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA CÁC EPITOPE KHÁNG NGUYÊN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐÃ ĐƯỢC DỰ ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01 Phản biện 1: PGS.TS. Trương Thị Xuân Liên Phản biện 2: TS. Trần Tấn Thành Phản biện 3: TS. Nguyễn Hữu Hùng Phản biện độc lập 1: TS. Trần Tấn Thành Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Hữu Hùng NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. Trần Linh Thước Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2014 Lời cảm ơn Em trân trọng cảm ơn Thầy GS.TS. Trần Linh Thước, người hướng dẫn khoa học đồng thời là người hướng dẫn ba chương trình nghiên cứu học thuật của em tại Trường. Thầy không những đã định hướng đề tài, quan tâm giúp đỡ vật chất và tinh thần cho luận án của em mà cũng là người dẫn dắt, người thủ trưởng tinh tế, nhiệt tâm của em trong suốt 12 năm vừa qua. Cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Lệ, chủ nhiệm đề tài KC.04.18 đã cho tôi cơ hội tham gia và thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài. Tôi chân thành cảm ơn GS.TS.BS. Đỗ Quang Hà và TS. Juliet Bryant đã hướng dẫn cho tôi thực hành một số thí nghiệm tại PTN an toàn sinh học cấp II và PTN an toàn sinh học cấp III. Cảm ơn GS.TS. Jeremy Farrar và Ban quản lý của Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU) tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học và thực hành thí nghiệm tại đây. Cảm ơn các anh, chị, em của Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường và Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi rất nhiều về cơ sở vật chất, hóa chất, trang thiết bị và động viên tinh thần cho tôi triển khai hầu hết các thí nghiệm nghiên cứu của luận án. Cảm ơn Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử của Bộ môn Di Truyền đã giúp tôi sử dụng một số thiết bị trong quá trình thực hành thí nghiệm của mình. Cảm ơn Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tâp và làm việc. Cảm ơn PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương, PGS.TS. Đặng Thị Phương Thảo, chị Trần Thị Phượng Giang và các chị của Phòng Sau Đại học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM đã giúp tôi hoàn thành hồ sơ của luận án. Cảm ơn TS. Nguyễn Đức Hoàng, TS. Phan Thị Phượng Trang, TS. Lê Thị Thúy Ái, Bạn Tuyền, các em Trí Nam, Huy Dũng, Tường Vy, Như Thùy, Lương Thắng, Hoài Nam, Tuấn Anh đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn hai em Lâm Ánh Nguyệt và Phạm Hồng Ánh đã giúp tôi thực hiện thí nghiệm tại OUCRU. Cảm ơn Bác sĩ Long, Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Pasteur TP.HCM đã hỗ trợ tôi thực hiện một số thí nghiệm của luận án. Con xin gửi đến các đấng sinh thành: Ba – Má hai bên nội ngoại lời tri ân và biết ơn sâu sắc. Cảm ơn đại gia đình con ở Cam Ranh đã luôn yêu thương, động viên con trong suốt 34 năm qua. Em cảm ơn anh và con đã luôn bên cạnh, chia sẻ những vui buồn, là nguồn động lực cho em vượt qua những lúc gian nan và sẽ cùng em bước tiếp trên con đường phía trước. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 12 năm 2014 Trần Thị Hồng Kim Mục lục MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. ix LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. DỊCH BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 Ở GIA CẦM VÀ Ở NGƯỜI .......... 4 1.1.1. Bệnh cúm do virus cúm A/H5N1 ..................................................................... 4 1.1.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới ....................................................... 4 1.1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam ........................................................ 5 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ...................................... 5 1.2.1. Phân loại và danh pháp ..................................................................................... 6 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc di truyền và tiến hóa ........................................................... 7 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 ........................................................................................ 10 1.3.1. Phòng ngừa virus cúm A/H5N1 bằng vắc-xin ............................................... 10 1.3.2. Điều trị bệnh do virus cúm ............................................................................. 12 1.4. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở VẬT CHỦ ĐỐI VỚI KHÁNG NGUYÊN VIRUS CÚM...................................................................................................................... 13 1.4.1. Kháng nguyên và miễn dịch nguyên .............................................................. 13 1.4.2. Đáp ứng miễn dịch ở vật chủ đối với kháng nguyên virus cúm ...................... 13 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮC-XIN THẾ HỆ MỚI PHÒNG CÚM A. ................................................................................................................ 18 i Mục lục 1.5.1. Các nghiên cứu phát triển vắc-xin thế hệ mới phòng cúm A trên thế giới ..... 18 1.5.2. Các vắc-xin phòng cúm gia cầm A/H5N1 đang được nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam ..................................................................................... 19 1.6. NGUYÊN LÝ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN Ở VẬT CHỦ. .............................................. 21 1.6.1. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên thông qua đáp ứng miễn dịch dịch thể ở vật chủ ....................................................................... 22 1.6.2. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên thông qua đáp ứng miễn dịch tế bào ở vật chủ .......................................................................... 23 1.7. DỰ ĐOÁN EPITOPE KHÁNG NGUYÊN VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC NHẰM ỨNG DỤNG TRONG PHÁT TRIỂN VẮC-XIN ................................................................................... 27 1.7.1. Epitope ............................................................................................................ 27 1.7.2. Dự đoán epitope kháng nguyên virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp Tin Sinh học .............................................................................................................. 28 1.8. CẢI THIỆN TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA EPITOPE VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ BẢO VỆ CỦA VẮC-XIN PHÒNG CÚM A/H5N1 ................................................................................................................ 32 1.8.1. Cải thiện tính sinh miễn dịch của epitope ...................................................... 32 1.8.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin phòng cúm A/H5N1...... 34 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 37 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 37 2.1.2. Vâ ̣t liê ̣u sinh ho ̣c ............................................................................................. 38 2.1.3. Hóa chất – Môi trường ................................................................................... 43 ii Mục lục 2.2. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP VÀ KIỂM TRA TÍNH SINH MIỄN DỊCH CÁC EPITOPE KHÁNG NGUYÊN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐÃ ĐƯỢC DỰ ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC ...................... 47 2.2.1. Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên epitope dự đoán từ kháng nguyên HA dưới dạng peptide tái tổ hợp ....................................................... 49 2.2.2. Tạo các chủng E. coli biểu hiện epitope tế bào B và epitope tế bào T dưới dạng các peptide tái tổ hợp ............................................................................... 52 2.2.3. Phương pháp tinh chế, định lượng và phân tích độ sạch của kháng nguyên .. 56 2.2.4. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột với các kháng nguyên thu nhận được ............................................................................................................ 58 2.2.5. Phương pháp ELISA gián tiếp để đánh giá tính sinh miễn dịch của các epitope tế B ......................................................................................................... 59 2.2.6. Phương pháp ELISPOT để đánh giá tính sinh miễn dịch của các epitope tế T ............................................................................................................... 61 2.2.7. Phương pháp kiểm tra khả năng trung hòa kháng nguyên HA virus cúm A/H5N1 của kháng huyết thanh kháng epitope bằng thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) ................................................................................ 63 2.2.8. Phương pháp kiểm tra khả năng trung hòa độc lực virus cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật vi trung hòa ......................................................................................... 64 2.2.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .......................................................... 67 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC VÀ TỔNG HỢP DI TRUYỀN CÁC EPITOPE ĐÃ ĐƯỢC DỰ ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC ............... 68 3.1.1. Tổng hợp hóa học các epitope tế bào B và epitope tế bào T đã được dự đoán từ kháng nguyên HA .................................................................................... 68 3.1.2. Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên epitope dự đoán iii Mục lục từ kháng nguyên HA dưới dạng peptide tái tổ hợp ................................................... 68 3.1.3. Biểu hiện, thu nhận và tinh chế epitope tế bào B và epitope tế bào T dưới dạng các peptide tái tổ hợp ................................................................................ 75 3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA CÁC EPITOPE TẾ BÀO B, TẾ BÀO T ĐÃ ĐƯỢC TỔNG HỢP .................................................................. 92 3.2.1. Tính sinh miễn dịch của các epitope tế bào B và epitope tế bào T được tổng hợp hóa học .............................................................................................. 85 3.2.2. Tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên là các epitope tế bào B được tổng hợp di truyền dưới dạng các peptide tái tổ hợp ....................................... 97 3.2.3. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên là các epitope tế bào T được tổng hợp di truyền dưới dạng peptide tái tổ hợp ............................................. 94 3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH TRUNG HÒA KHÁNG NGUYÊN HA VÀ TRUNG HÒA ĐỘC LỰC VIRUS CÚM A/H5N1 CỦA KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG CÁC EPITOPE TỔNG HỢP ............................................ 97 3.3.1. Đánh giá hoạt tính trung hòa kháng nguyên HA của kháng huyết thanh bằng thử nghiệm HI ................................................................................................... 97 3.3.2. Đánh giá hoạt tính trung hòa độc lực virus của kháng huyết thanh kháng peptide tái tổ hợp bằng thử nghiệm vi trung hòa ......................................... 102 3.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH TRUNG HÒA KHÁNG NGUYÊN HA VÀ TRUNG HÒA ĐỘC LỰC VIRUS CỦA KHÁNG HUYẾT THANH TỪ HỖN HỢP EPITOPE TIỀM NĂNG ....................................................... 103 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 107 4.2. ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................ 109 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................... 110 iv Mục lục TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 111 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa Acid amin ANNs Artificial Neural Network (mạng nơron nhân tạo) APS Ammonium Persulfate bp base pair BSA Bovine Serum Albumin (huyết thanh bò) CPE Cytopathic effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào) cRNA complementary Ribonucleic Acid CTL cytoxic T-cell lymphocyte dH2O distilled water (nước cất) dNTP deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ELISPOT Enzyme-linked immunosorbent spot GST Gluthathione-S-tranferase HA Haemagglutinin HI Haemagglutinin Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) HMMs Hidden Markov Models (mô hình Markov ẩn) IFN Interferon gamma IL Interleukin vi IPTG Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside Kanr Kanamycine resistance (kháng Kanamycine) kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Môi trường Luria–Bertani MCS Multiple Cloning Site MDCK Madin-Darby Canine Kidney (tế bào thận chó) mRNA messenger RiboNucleic Acid OPD O-Phenylene Diamine PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PMSF Phenyl methyl sulphonyl fluoride RNA Ribonucleic acid SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (liều hủy hoại 50% số giếng tế bào nuôi cấy) TEMED Tetramethylethylenediamine TNF Tumor Necrosis Factor SVMs Support Vector Machines (máy học hỗ trợ) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Vai trò, chức năng các phân đoạn gen virus cúm A/H5N1 ........................... 8 Bảng 1.2. Tình hình sản xuất vắc-xin dựa trên các trình tự bảo tồn của virus cúm ở một số công ty lớn trên thế giới .......................................................................... 19 Bảng 1.3. Các epitope dự đoán được đánh giá tính sinh miễn dịch bởi đề tài KC.04.18 ...................................................................................................................... 31 Bảng 2.1. Các mồi được sử dụng trong luận án .......................................................... 39 Bảng 2.2. Các epitope dự đoán được tổng hợp hóa học ............................................. 41 Bảng 2.3. Cách tính kết quả TCID50 trong phản ứng vi trung hòa. ............................ 65 Bảng 3.1. Các epitope bảo tồn nhận diện bởi tế bào B và tế bào T được tổng hợp hóa học để kiểm tra tính sinh miễn dịch. ...................................................................... 68 Bảng 3.2. Các plasmid tái tổ hợp đã được tạo dòng trong luận án ............................ 74 Bảng 3.3. Các epitope tế bào B và T đã được tổng hợp hóa học và tổng hợp di truyền để kiểm tra tính sinh miễn dịch trong luận án. .............................................. 82 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sự phân bố dịch cúm A/H5N1. ..................................................................... 5 Hình 1.2. Cấu trúc virus cúm A (A) và ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử (B) ............ 7 Hình 1.3. Các đáp ứng miễn dịch thích ứng của vật chủ đối với kháng nguyên virus cúm ..................................................................................................................... 16 Hình 1.4. Quy trình ELISPOT điển hình. ..................................................................... 25 Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVFT và plasmid pGEX-fljB. ................................................ 39 Hình 2.2.Các thang chuẩn DNA được sử dụng trong luận án .................................... 42 Hình 2.3.Các thang chuẩn protein được sử dụng trong luận án ................................ 42 Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các nội dung nghiên cứu trong luận án ............................. 48 Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước tạo dòng plasmid tái tổ hợp ............................... 49 Hình 3.1. Kết quả thu nhận plasmid (A), PCR thu gen hab (B) và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pVFT- hab (C) ................................................................................. 69 Hình 3.2. Kết quả so sánh trình tự gen hab của plasmid tái tổ hợp pVFT-hab với trình tự gen mã hóa epitope tế bào B liên tục HaBc.. ............................................ 70 Hình 3.3. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của plasmid pVFT-(hab)3 bằng cặp mồi hab-3-F/hab-3-R và cặp mồi gst-F/T7-ter .......................................... 71 Hình 3.4. Kết quả phân tích plasmid pVFT-fljB-hab ly trích từ dòng E. coli/pVFT-fljB-hab bằng phản ứng PCR và giải trình tự đoạn fljB-hab. .............. 72 Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pVFT-fljB-(hab)3 bằng PCR khuẩn lạc (A) và PCR plasmid (B).. ........................................................... 73 Hình 3.6. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pVFT-fljB-(habdc)3 bằng PCR khuẩn lạc (A) và PCR plasmid (B) ............................................................. 73 Hình 3.7. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc tuyển chọn ix dòng E. coli DH5α/pGEX-fljB-(hati)3. .......................................................................... 74 Hình 3.8. Kết quả biểu hiện và tinh chế protein GST-(HaBc)3 bằng SDS-PAGE (A) và (C) và lai Western với kháng thể kháng GST (B) ..................................................... 75 Hình 3.9. Phân tích sự biể u hiện protein dung hợp GST-H:1,2-HaBc bằng SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B). ...................................... 76 Hình 3.10. Kết quả tinh chế protein dung hợp GST-H:1,2-HaBc bằng SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B).. .................................... 77 Hình 3.11. Phân tích kết quả thu nhận và tinh chế peptide tái tổ hợp H:1,2-HaBc bằng SDS-PAGE. ......................................................................................................... 78 Hình 3.12. Kết quả phân tích sự biểu hiện protein dung hợp GST-H:1,2-(HaBc)3 bằng SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B). .......................... 79 Hình 3.13. Kết quả SDS-PAGE phân tích và thu nhận peptide tái tổ hợp H:1,2-(HaBc)3 từ protein GST-H:1,2-(HaBc)3 được xử lý bằng TEV protease. ......... 79 Hình 3.14. Kết quả biểu hiện protein GST-H:1,2-(HaBdc)3 của chủng E. coli BL21 (DE3)/pVFT-fljB-(habdc)3 bằng điện di SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B). ...................................................................................... .80 Hình 3.15. Kết quả thu nhận H:1,2-(HaBdc)3 bằng điện di SDS - PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B). .............................................................. 81 Hình 3.16. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện các epitope tái tổ hợp (HaTi)3 bằng điện di SDS-PAGE (A, C) và lai Western với kháng thể kháng GST (B, D) ................ .82 Hình 3.17. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện kháng nguyên epitope tế bào B của kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope HaBc (A) và HaBdc (B) ..... 87 Hình 3.18. Hình ảnh quan sát kết quả thử nghiệm ELISPOT của ba epitope bảo tồn nhận diện bởi tế bào T.. .................................................................................. 88 Hình 3.19. Kết quả ELISPOT định lượng số tế bào đơn nhân tiết IFN- phân lập từ lách chuột tiêm các epitope và ủ với các epitope tổng hợp hóa học ..................... 89 x Hình 3.20. Kết quả ELISA kiểm tra sự hiện diện của kháng thể nhận diện epitope HaBc của các kháng huyết thanh chuột được tiêm kháng nguyên HaBc và kháng nguyên (HaBc)3............................................................................................. 90 Hình 3.21. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện epitope HaBc (A) và peptide tái tổ hợp H;1,2-HaBc (B) của các kháng huyết thanh chuột được tiêm kháng nguyên HaBc, H;1,2-HaBc, GST-H:1,2 ............................................................. 91 Hình 3.22. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện kháng nguyên HA virus cúm A/H5N1 của các kháng huyết thanh chuột được tiêm H:1,2-(HaBc)3 (A) và H:1,2-(HaBdc)3 (B).. ................................................................................................ 93 Hình 3.23. Kết quả ELISPOT phát hiện tế bào đơn nhân tiết cytokin INF- phân lập từ lách chuột được tiêm peptide GST-H:1,2-(HaT1)3 khi được ủ với epitope HaT1 (A) và peptide GST-H:1,2-(HaT1)3 (B) ................................................ 95 Hình 3.24. Kết quả ELISPOT định lượng số tế bào đơn nhân tiết IFN- phân lập từ lách chuột tiêm các epitope tế bào T tổng hợp hóa học và epitope tế bào T tổng hợp di truyền ....................................................................................................... 95 Hình 3.25. Kết quả HI so sánh khả năng trung hòa kháng nguyên HA virus cúm A/H5N1 (A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope và peptide tái tổ hợp của epitope tế bào B.......................................................................................................................... 98 Hình 3.26. Kết quả HI kiểm tra khả năng trung hòa kháng nguyên HA từ hai chủng virus cúm A/H5N1 (A/Vietnam/CL26/2004(H5N1) và A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của kháng huyết thanh chuột được tiêm peptide tái tổ hợp........................................................................................ 100 Hình 3.27. Minh họa các vị trí của các epitope tế bào B và epitope tế bào T trên cấu trúc 3D của phân tử HA (mã số PDB: 1JSM). .................................................... .101 Hình 3.28. Kết quả vi trung hòa kiểm tra khả năng trung hòa hai chủng virus cúm xi A/H5N1 (A/Vietnam/CL26/2004(H5N1) và A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của kháng huyết thanh chuột đượctiêm kháng nguyên tái tổ hợp............................... 103 Hình 3.29. Hiệu giá kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và hiệu giá kháng thể trung hòa virus cúm A/Vietnam/CL26/2004(H5N1) của kháng huyết thanh chuột được tiêm các kháng nguyên peptide tái tổ hợp và hỗn hợp kháng nguyên tiềm năng*, (* r-(HaT1)3 + r-(HaBc)3 + r-(HaBdc)3). .............................................. 104 xii Lời mở đầu Virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm, đồng thời ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng con người trên thế giới từ năm 2003 đến nay. Kể từ khi được phát hiện, virus cúm gia cầm A/H5N1 đã gây chết người trên bình diện rộng ở Hồng Kông năm 1997. Các nhà khoa học đã chứng minh virus cúm A/H5N1 có thể biến đổi gen liên tục, có thể xuất hiện chủng đột biến có khả năng truyền nhiễm từ người sang người và gây ra đại dịch. Tiêm phòng vắc-xin là liệu pháp y học chính nhằm khống chế đại dịch cúm gia cầm H5N1 cũng như ngăn chặn virus lây nhiễm trên người. Cho đến nay, có nhiều loại vắc-xin phòng cúm H5N1 đã được phát triển và sử dụng như vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc và vắc-xin virus tái tổ hợp. Tuy nhiên, virus cúm A/H5N1 có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt liên tục và nhanh chóng, tạo ra nhiều chủng mới có thể kháng lại hiệu quả bảo hộ của các vắc-xin đang lưu hành. Do đó, các phương pháp mới để phát triển vắc-xin vẫn tiếp tục được nghiên cứu nhằm cải thiện các loại vắc-xin hiện có, khắc phục vấn đề hàng năm phải tạo vắc-xin mới cho các chủng virus cúm mới, đồng thời nhằm nghiên cứu tạo ra một loại vắc-xin đa trị có khả năng phòng ngừa được nhiều chủng virus cúm khác nhau. Một trong các hướng tiếp cận đang được quan tâm hiện nay là phát triển vắc-xin phổ rộng, dựa trên các epitope bảo tồn của hai kháng nguyên bề mặt quan trọng HA và NA của virus cúm A. Epitope là một vùng nhỏ trên bề mặt cấu trúc kháng nguyên có khả năng tương tác với các phân tử của hệ thống miễn dịch của vật chủ để gây đáp ứng miễn dịch. Epitope được phân thành epitope tế bào B (nhận diện bởi tế bào B) và epitope tế bào T (nhận diện bởi tế bào T). Ưu điểm chính của vắc-xin dựa trên epitope là khả năng gây đáp ứng miễn dịch với cấu trúc kháng nguyên tối thiểu; do vậy, nếu chứa đầy đủ các epitope cần thiết, vắc-xin sẽ kích thích phản ứng miễn dịch chuyên biệt trong khi tránh được những ảnh hưởng không mong muốn. 1 Lời mở đầu Cùng với sự phát triển của ngành Tin Sinh học, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (PTN.CNSHPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Trường ĐH KHTN) thuộc Đại học Quốc gia TP.HCM (ĐHQG - HCM) quan tâm đến hướng nghiên cứu phát triển vắc-xin phòng virus cúm A dựa trên epitope bảo tồn nêu trên. Trong các năm 2008 – 2010, PTN.CNSPT đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao chủ trì triển khai một đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước là “Nghiên cứu ứng dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vắc-xin và thuốc”, mã số KC.04.18/06-10. Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope được nhận diện bởi tế bào B, tế bào T từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A bằng các chương trình dự đoán epitope khác nhau và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope dự đoán. Trong đề tài KC.04.18/06-10, 08 epitope tế bào B và T được dự đoán từ HA và NA được tuyển chọn để tổng hợp và kiểm chứng tính sinh miễn dịch. Các kết quả bước đầu đánh giá tính sinh miễn dịch của các epitope dự đoán in silico từ đề tài KC.04.18 đã cho thấy một số epitope tế bào T có tính sinh miễn dịch mạnh. Các epitope tế bào B được tổng hợp hóa học cho thấy đáp ứng miễn dịch rất yếu. Việc tổng hợp di truyền các epitope được dự đoán nhằm làm tăng tính sinh miễn dịch chưa được thực hiện bởi đề tài KC.04.18 do giới hạn về thời gian. Do vậy, các epitope này cần được tổng hợp theo chiến lược tăng cường tính sinh miễn dịch của kháng nguyên. Là một thành viên của đề tài trực tiếp tham gia việc tổng hợp và kiểm chứng thực nghiệm tính sinh miễn dịch các epitope đã được dự đoán, trong luận án này, nghiên cứu sinh kế thừa các kết quả nghiên cứu của đề tài KC.04.18 và tiếp tục tổng hợp các epitope dự đoán từ kháng nguyên HA, hiện diện trên bề mặt của virus và có vai trò quyết định độc tính của virus. Mục tiêu của luận án này nhằm tổng hợp di truyền một số epitope đã được dự đoán từ kháng nguyên HA virus cúm A/H5N1, kiểm chứng thực nghiệm tính sinh miễn dịch và triển vọng áp dụng các epitope này trong phát triển vắc-xin phòng virus cúm A/H5N1. Nội dung thực nghiệm của luận án bao gồm: 2 Lời mở đầu - Tổng hợp hóa học các epitope tế bào B và T đã được dự đoán từ kháng nguyên HA và tổng hợp di truyền các epitope này dưới dạng các peptide tái tổ hợp; - Đánh giá tính sinh miễn dịch của các epitope tế bào B, epitope tế bào T đã được tổng hợp hóa học và tổng hợp di truyền; - Đánh giá khả năng trung hòa kháng nguyên HA và trung hòa độc lực virus của kháng huyết thanh kháng epitope và kháng peptide tái tổ hợp; - Đề xuất các kháng nguyên có triển vọng ứng dụng để phát triển vắc-xin và bước đầu đánh giá hiệu quả trung hòa kháng nguyên HA và trung hòa độc lực virus của hỗn hợp các kháng nguyên tiềm năng. 3 Tổng quan 1.1. DỊCH BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 Ở GIA CẦM VÀ Ở NGƢỜI 1.1.1. Bệnh cúm do virus cúm A/H5N1 Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng truyền nhiễm từ động vật sang người. Tuy quần thể chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời) và gia cầm (vịt, gà tây, gà, ngan, ngỗng) là các vật chủ tự nhiên của virus cúm A, nhưng nhóm virus này có khả năng dễ dàng biến đổi các kháng nguyên bề mặt dẫn đến việc nó có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người. Ca nhiễm cúm gia cầm ở người do virus cúm A/H5N1 gây ra được báo cáo lần đầu tiên là tại Hồng Kông năm 1997. Năm 2006, các nghiên cứu trên một chùm ca nhiễm virus cúm A/H5N1 ở Thái Lan cho thấy sự lan truyền từ người sang người, tạo ra quan ngại về khả năng virus đạt được sự thích nghi và truyền nhiễm từ người sang người và gây ra đại dịch [15] [21] [27]. 1.1.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới Virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Năm 1996, virus cúm A/H5N1 được phát hiện trở lại tại Quảng Đông và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết trên người. Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều trận dịch cúm trên gia cầm và tiếp tục lây lan hơn 70 quốc gia trên thế giới, cướp đi sinh mạng của gần 400 người và buộc các nhà chức trách phải tiêu hủy hơn 400 triệu gia cầm, gây thiệt hại khoảng 20 tỷ USD. Tổ chức Lương Nông (FAO) cảnh báo, hiện nay nhiều ổ virus cúm A/H5N1 vẫn tồn tại ở châu Á và Trung Đông (Hình 1.1) [45] [52]. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) từ năm 2003 đến đầu năm 2015 có 694 ca nhiễm cúm A/H5N1 trên người và 58% trường hợp tử vong. Việt Nam, Indonesia và Ai Cập là 3 quốc gia có số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất trên thế giới. WHO xác định Việt Nam là “điểm nóng”, có khả năng cho phép cúm A/H5N1 4