Tài liệu Nghiên cứu tình hình, đặc điểm lâm sàng và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh sporotrichose bằng itraco

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh vi nấm sâu (La Sporotrichose) là một bệnh nhiễm nấm bán cấp hay mãn tính ở da, do vi nấm Sporothrix Schenckii gây ra xâm nhập chủ yếu qua đường da lan theo đường mạch bạch huyết nông dưới dạng cục nhỏ, sau đó vỡ thành các vết loét ít đau. Sporothrix Schenckii là nấm nhị độ lưỡng hình (dimorphique) sống hoại sinh ở đất, lá cây, thực vật sống hoặc chết, gai, chất bài tiết của súc vật … xâm nhập cơ thể qua vết trầy xướt da, vết thương do gai đâm. Vì vậy dể gây bệnh cho người làm vườn, làm ruộng, trồng hoa, thợ hầm mỏ… bệnh còn được gọi là bệnh gardener’s .Triệu chứng lâm sàng có thể gặp 4 thể: Thể da – bạch huyết (Formes Cutanées – lymphangitique Sporochose), Thể đơn thuần khu trú ở da (Formes cutanées), Thể bệnh lan tỏa (Formes généralisées),Thể phổi nguyên phát (Formes pulmonaire primitive), Ở Việt Nam bệnh gặp rải rác và rất hiếm ở các tỉnh miền Bắc, ở miền nam chỉ gặp ở Đà Lạt có một số vùng nội dịch, bệnh nhân hầu hết là nông dân làm vườn rẫy, trồng rau quả và hoa, buôn bán hoa [2][5][7] Hàng năm phòng khám TT.PCBXH tỉnh Lâm đồng tiếp nhận và điều trị khoảng40-50bệnh nhân mỗi năm, phần lớn bệnh nhân cư trú ở phường 7, 8, 9, 12 Thành phố Đà Lạt, thị trấn Lạc Dương và Xã Lát Huyện Lạc Dương, qua kết quả nghiên cứu của TTPC. Bệnh Xã Hội tỉnh Lâm đồng năm 2006 [6]. Mặt khác thường bệnh nhân khi mắc bệnh thường tự mua thuốc chữa trị, hoặc đến các phòng khám không chuyên, điều trị không đúng phác đồ bệnh vẫn không thuyên giảm, một số trường hợp còn nhầm với lao da, ung thư da…. Phần lớn bệnh nhân và cộng đồng thiếu kiến thức về bệnh lý này không biết cách phòng tránh và xử lý vết thương. Bệnh đã ảnh hưởng đến sức khỏe 2 đời sống kinh tế xã hội của nhân dân địa phương, ngoài phương pháp điều trị cổ điển bằng Potassium Iodur (KI) qua kết quả nghiên cứu của TTPCBXH Lâm đồng năm 2006 [6],[8] thì chưa có nghiên cứu nào hệ thống về áp dụng thuốc kháng sinh kháng nấm để điều trị bệnh lý này. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tình hình, đặc điểm lâm sàng và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh Sporotrichose bằng Itraconazole” nhằm mục tiêu: 1. Khảo sát đặc điểm lâm sàng bệnh Sporotrichose tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương và Trung tâm phòng chống bệnh xã hội Lâm đồng 2. Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh Sporotrichose bằng Itraconazole . 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tình hình bệnh Sporotrichose trên thế giới và Việt Nam Sporothrix Schenckii là nấm lưỡng dạng (dimorphique) sống hoại sinh ở đất, lá cây, thực vật sống hoặc chết (thực vật mục nát, vỏ cây có gai, gai thực vất, chất bài tiết của súc vật … xâm nhập cơ thể qua vết trầy xước da, vết thương do gai đâm, … Vì vậy dể gây bệnh cho người làm vườn, làm ruộng, trồng hoa, thợ hầm mỏ… bệnh còn được gọi là bệnh gardener’s (bệnh người làm vườn) được Schenk mô tả lần đầu tiên ở Mỹ năm 1898, sau đó Beumann và Ramoud (1903) phát hiện ở Châu Âu. Năm 1912 Beumann và Gougerot mô tả chi tiết hình dạng của nấm. Theo Findley, Sporothrix Schenkii phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 25 – 27 độ C, do đó bệnh thường gặp ở vùng cao nguyên, ôn đới hay nhiệt đới, nhiều nhất là ở Châu Mỹ La Tinh (Amérique Latine) như: Mexique, Costarica, Venezuela, Bresil, Guatemala, ở Nam Phi (grotte du Tranvaal) và cũng tìm thấy ở Nhật Bản (Japon). Bệnh hiếm gặp ở Châu Âu, mặc dù người ta đã chẩn đoán nhiều trường hợp ở Pháp vào khoảng năm 1905-1920 [20],[21],[23][43]. Ở Việt Nam gặp rải rác ở một số tỉnh miền Bắc, theo thống kê bệnh lý tại Bệnh viện Da liễu Trung ương thì hàng năm chỉ có khoảng từ 3-5 cas. Ở miền nam chỉ gặp nhiều tại Đà Lạt có một số vùng nội dịch với suất độ mắc bệnh cao, bệnh nhân hầu hết là nông dân làm vườn rẫy, trồng rau quả và hoa, buôn bán hoa. Theo kết quả điều tra trước đây của GS.TS Trần Xuân Mai Trường Đại Học Y – Dược Thành Phố Hồ Chí Minh năm 1984 đã tìm thấy sự hiện diện của Sporothrix Schenckii trong đất và rau ở khu vực phường 3,4 cũ (tức là phường 7,8 hiện tại) [5],[8], kết quả điều tra của 4 TT.PCBXH tỉnh Lâm đồng năm 2006[6] đã tìm thấy sự hiện diện của nấm Sporothrix Schenckii trong môi trường đất và thực vật ở các phường của Thành phố Đà lạt và Lạc dương. Hàng năm phòng khám TT. PC.BXH và ở một số phòng khám da liễu thuộc tỉnh Lâm Đồng tiếp nhận và điều trị khoảng 40-50 bệnh nhân mỗi năm, phần lớn bệnh nhân cư trú ở phường 7,8,9,12 Thành phố Đà Lạt, thị trấn Lạc Dương và Xã Lát Huyện Lạc Dương,bệnh đã gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và kinh tế của người lao động địa phương [5],[6]. 1.2. Dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng bệnh Sporotrichose Bình thường gặp ở nam giới , khỏe mạnh , dưới 30 tuổi , ít gặp ở trẻ em, hay gặp ở những người làm vườn, làm ruộng, thợ nề, trồng hoa hoặc bán hoa, những người tiếp xúc với đất, nhiều trường hợp lây nhiễm trong phòng thí nghiệm [1],[2],[3]. Triệu chứng lâm sàng có thể gặp 4 thể: [7],[14],[15],[17],[19] 1.2.1. Thể da – bạch huyết: (Formes Cutanées – lymphangitique Sporochose) Đây là thể thường gặp nhất, bệnh bắt đầu từ 1 chi ở vùng da hở thường là tay phải dưới dạng cục sẩn gồ trên mặt da không đau, đặc biệt cục sẩn mọc trên đường bạch huyết, lúc đầu cứng di động sau đó trở nên dính, do có hoại tử nên quanh cục u đỏ rồi tím đen, sau đó các cục u mềm và loét có mũ sệt vàng dọc theo mạch bạch huyết, từ dưới lên trên xuất hiện các cục u mới, có diễn tiến giống cục u ban đầu, giữa các vết loét, u cục là mạch bạch huyết bị sưng như một sợi dây nhỏ dưới da có thể sờ thấy, đôi lúc như chuổi hạt trai, bệnh nhân không đau không sốt. 5 1.2.2 Thể đơn thuần khu trú ở da ( Formes cutanées ) Thể này rất hiếm, gặp ở người có sức đề kháng tốt. Sang thương thường dưới dạng bướu gai và mụn cóc, không lan theo mạch bạch huyết. 1.2.3 Thể bệnh lan tỏa ( Formes généralisées ) Thể này rất hiếm, dạng này tiếp theo dạng da – mạch bạch huyết hay thể nguyên phát ở phổi, triệu chứng giống như một sự nhiễm nấm huyết gặp ở những người có tình trạng sức khỏe xấu, suy giảm miễn dịch, nghiện rượu, bệnh lý về máu, ung thư, AIDS … Trên bề mặt da của cơ thể có rất nhiều cục u nhỏ, cứng, ít khi loét (rạch có thể thấy một mũ đặc, vết rạch loét và lâu lành) vi nấm xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp cơ thể : bề mặt các khớp xương, tủy xương, hệ thống thần kinh trung ương, phổi thận, và cơ quan sinh dục – dịch hoàn, vú. 1.2.4 Thể phổi nguyên phát (Formes pulmonaire primitive) Xẩy ra ở những người sống trong vùng dịch tể, do hít bào tử vi nấm vào phổi. Thể bệnh này khó chẩn đoán nên dể bỏ qua. Biểu hiện bệnh về lâm sàng và X-Quang khá giống bệnh lao, bệnh nhân có thể ho ra máu giống lao phổi, dần tạo thành hang ở phổi, triệu chứng toàn thân mệt mỏi sốt nhẹ. * Tiêu chuẩn chẩn đoán Sporotrichose:  Triệu chứng lâm sàng đặc trưng.  Xét nghiệm nuôi cấy (+) tính (nuôi cấy-phân lập,PCR…)  Giải phẩu bệnh (hình ảnh đặc trưng) *Tiêu chuẩn lành bệnh:các thương tổn lành và hóa sẹo hoàn toàn * Thuốc điều trị: [1],[2],[6],[7],[9],[12],[24] 6  Thuốc cổ điển KI: 1-5g/ngày dùng liều tăng dần, uống với nước hoa quả hoặc sữa  Kháng sinh diệt nấm: - Ketoconazole 200mg/ngày x vài tháng - Itraconazole (Sporal) 200mg/ngày x 3 tháng - Có thể kết hợp Griseofulvin với terbinafin hoặc Itraconazole * Tác dụng phụ của thuốc:[37],[38],[39],[40],[44] Kháng sinh diệt nấm Itraconazole (sporal): là một dẫn xuất Triazole, có hoạt tính đối với vi nấm Dermatophytes (các chủng Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton floccosum), nấm men (Cryptococus neoformans, các chủng Candida bao gồm C.albican, C.glabrata và C.Krusei, các chủng Pityrosporum) các Aspergillus, các chủng Histoplasma, Paracoccidioides, Sporothrix schenckii, các chủng Fonsecaea, các chủng Cladosporium, Blastomyces dermatitidis và các vi nấm men khác. Các nghiên cứu trong ống nghiệm đã xác nhận rằng Sporal gây rối loạn việc tổng hợp Esgosterol của tế bào vi nấm, Ergosterol là một thành phần thiết yếu của màng tế bào vi nấm. Sự rối loạn tổng hợp chất này cuối cùng dẫn đến một tác dụng kháng nấm. * Tác dụng phụ của Itraconazole: Đau bụng, buồn nôn, nôn mữa, tiêu chảy, biếng ăn, mệt mỏi, sốt, khó chịu chảy nước mũi, vàng da vàng mắt, phát ban, ngứa, nổi mề đay, nhức đầu chóng mặt, giảm ham muốn, cao HA, đau cơ khớp. * Tác dụng phụ của Iodua Kali: Trứng cá, tiêu chảy, chán ăn, buồn nôn, đau bụng, nôn mữa…phát ban, nổi mày đay, khó thở, tức ngực, loét miệng,sưng 7 miệng, sưng tấy cổ họng, sưng mặt, phân đen, sốt, mạch tăng, tê ngứa bàn tay ban chân. 1.3 Cận lâm sàng 1.3.1. Hình ảnh nuôi cấy và đặc tính sinh vật hóa học của nấm Sporothrix. schenckii: [26],29],[31],[32],35] * Hình ảnh nuôi cấy của nấm Sporothrix.schenckii - Hình ảnh nấm S .schenkii trên môi trường Sabouraud có Chloramphenicol Sau 3 – 5 ngày ở nhiệt độ phòng, vi nấm mọc thành khúm nhỏ, phẳng, màu kem bề mặt khô và có tính chất dai. Để thêm một tuần khúm nấm sẽ trở nên nhăn nheo và có màu đen. Quan sát một mảnh khúm nấm dưới kính hiển vi, thấy những sợi tơ nấm mảnh mai, thanh tú, có bào đài ngắn, trên đầu có 8 các bào tử đính kích thước (2 – 4um) x (2 – 6um); ngoài ra còn có những bào tử đính mọc trực tiếp từ những sợi tơ nấm. - Hình ảnh nấm S .schenkii trên môi trường thạch BHI có Chloramphenicol Sau 2 – 4 ngày ở 280C vi nấm mọc thành khúm nhỏ, bề mặt khô trắng và mịn như bông gòn. Quan sát dưới kính hiển vi , ta thấy những tế bào hạt men kích thước (1 – 3) x (4 – 10um), đôi khi tế bào có hình tròn hay hình 9 trứng. Chúng sinh sản bằng cách nảy búp có hình dáng như điếu cigar, nên còn được gọi là thể cigar. - Hình ảnh nuôi cấy nấm S .schenkii trên môi trường thạch CandidaSelect - Hình ảnh nuôi cấy nấm S .schenkii trên môi trường CHROMagar 10 Trên các môi trường nuôi cấy Sporothrix .schenkii vừa có thể sợi tơ vừa có thể hạt men và giữa hai thể này có thể chuyển hóa cho nhau được, nên Sporothrix schenkii được xem là vi nấm nhị độ (Diphasis Fungus). * Các tích chất sinh vật hoá học của nấm Sporothrix.schenkii Test mầm giá: Kỹ thuật làm test mầm giá. - Hút 3 giọt huyết thanh vào một tube thuỷ tinh nhỏ. - Sử dụng pipette, nhẹ nhàng lấy một khóm nấm men cho vào tube huyết thanh và đánh thành huyền dịch. - Ở nhiệt độ 35 – 37 0C trong 3 giờ nhưng không được để lâu. - Nhỏ một giọt huyết thanh lên lam kính để kiểm tra. - Đậy lam kính và soi kính hiển vi với độ phóng đại ở vật kính x40. 11 Kết quả: + Test dương tính: ở đầu sợi nấm có một chồi tế bào nấm mọc ra (mầm giá) + Test âm tính: Chỉ có tế bào nấm men. Kết quả chạy giá đường API20 CAUX 12 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: 2.1.1. Bệnh nhân nghiên cứu: Tất cả BN Sporotrichose nội trú và ngoại trú tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương và phòng Khám Da liễu TT.PCBXH Lâm đồng từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 6 năm 2011 * Tiêu chuẩn chẩn đoán: - Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của Sporotrichose: Thể da – bạch huyết: thể thường gặp nhất, bệnh bắt đầu từ 1 chi thường là tay phải dưới dạng cục sẩn gồ trên mặt da không đau, mọc trên đường bạch huyết, lúc đầu cứng di động sau đó trở nên dính, màu đỏ rồi tím đen, sau đó loét có mũ sệt vàng, mạch bạch huyết bị sưng như một sợi dây nhỏ dưới da có thể sờ thấy, đôi lúc như chuổi hạt trai,BN không đau không sốt. Thể đơn thuần khu trú ở da: rất hiếm gặp, ở người có sức đề kháng tốt. Thương tổn dưới dạng bướu gai và mụn cóc, không lan theo mạch bạch huyết. Thể bệnh lan tỏa : rất hiếm, triệu chứng như nhiễm nấm huyết gặp ở những người có tình trạng sức khỏe xấu, nghiện rượu, bệnh lý về máu, ung thư, AIDS… nấm xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp cơ thể : bề mặt các khớp xương, tủy, thần kinh trung ương, phổi thận, sinh dục – dịch hoàn, vú. Thể phổi nguyên phát :Xẩy ra ở những người sống trong vùng dịch tể, do hít bào tử vi nấm vào phổi. Thể bệnh này khó chẩn đoán nên dể bỏ qua. Biểu hiện bệnh về lâm sàng và X-Quang giống bệnh lao, bệnh nhân có thể ho ra máu giống lao phổi,hang ở phổi, triệu chứng toàn thân mệt mỏi sốt nhẹ. 13 - Sinh thiết giải phẩu bệnh : sinh thiết nhuộm PAS có thể thấy những thể sao (asteroid bodies) là những tế bào nấm hình ovale hay điếu xì gà - Nhuộm soi, nuôi cấy, PCR (+) * Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: bệnh nhân Sporotrichose điều trị nội trú và ngoại trú tại Bệnh viện Da liễu TW và TTPCBXH tỉnh Lâm đồng.BN được giải thích và tự nguyện đồng ý hợp tác nghiên cứu điều trị. * Tiêu chuẩn loại trừ: - BN không đồng ý, không hợp tác . - BN chống chỉ định dùng Itraconazole: suy gan, suy thận nặng, dị ứng với Itraconazole. 2.1.2. Bệnh phẩm nghiên cứu: - Thương tổn trên da: sinh thiết làm giải phẩu bệnh tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương. Nhuộm soi, nuôi cấy làm PCR tại Bệnh viện Phong-Da liễu Trung Ương Qui Hòa - Máu : xét nghiệm công thức máu, sinh hóa, chức năng gan… - Các xét nghiệm khác : X quang xương, phổi (nếu cần) 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 06 năm 2011 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Da liễu Trung Ương và phòng Khám Da liễu TT.PCBXH tỉnh Lâm đồng. 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: - Nghiên cứu lâm sàng và yếu tố liên quan: Mô tả cắt ngang - Nghiên cứu hiệu quả điều trị : Thử nghiệm lâm sàng (tự chứng: so sánh trước và sau điều trị). 14 2.2.2 Cỡ mẫu: Mẫu tất cả bệnh nhân Sporotrichose đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương và phòng Khám Da liễu TTPCBXH Lâm đồng 2.2.3 Các kỷ thuật áp dụng trong nghiên cứu: 2.2.3.1 Nghiên cứu lâm sàng: - Lập phiếu nghiên cứu và làm bệnh án điều trị (xem phụ lục) - Chọn bệnh nhân theo các tiêu chuẩn đề ra - Phỏng vấn bệnh nhân, các thông tin cần thu thập: + Thông tin cá nhân: tên, tuổi, giới, dân tộc, trình độ học vấn, nơi cư trú, nghề nghiệp. + Điều kiện môi trường làm việc lao động của bệnh nhân: cây trồng, vật nuôi, phân bón, nguồn nước tưới, bảo hộ lao động … + Khảo sát quá trình nhiễm nấm: vị trí vết thương, thời gian ủ bệnh, cach xử trí vết thương, những nơi đã đến khám và điều trị, kết quả … + Triệu chứng lâm sàng và diễn biến của bệnh: triệu chứng cơ năng, triệu chứng thực thể, tỷ lệ các thể, diễn biến, quá trình lành bệnh, làm sẹo. + Tình trạng khám bệnh và điều tri trước đó: điều trị ở đâu? thuốc gì? - Các bệnh nhân đều được giải thích và đồng ý tham gia. 2.2.3.2 Quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Thu thập mẫu - Lập phiếu điều tra cá nhân, giải thích cho bệnh nhân trước khi tiến hành kỹ thuật rạch da. - Bệnh phẩm là mủ hoặc chất hoại tử tại thương tổn. Loại bỏ bớt chất hoại tử hoặc mủ ở bề mặt thương tổn, dùng tăm bông lấy chất dịch ở nền 15 thương tổn, có thể bóp nặn thương tổn để lấy được phần dịch từ trong mô chảy ra. - Hoặc cắt mảnh da tại thương tổn áp dụng cho bệnh nhân có thương tổn không điển hình, không có loét, lấy như quy trình cắt sinh thiết làm giải phẩu bệnh. - Bệnh phẩm dính trên tăm bông, dao rạch da, hoặc mảnh sinh thiết được trước hết được cấy trên môi trường nuôi cấy nấm, sau đó làm một phết tiêu bản để khảo sát trực tiếp, cuối cùng cho vào ống nghiệm chứa cồn etanol 70%, giữ ở nhiệt độ phòng tối đa 1 tháng cho đến khi sử dụng để chiết tách DNA. Kỹ thuật cắt sinh thiết da : Chuẩn bị dụng cụ: - Bông, băng keo, gạc, kẹp phẩu tích không mấu, khoan sinh thiết đường kính 2mm, dao rạch da (dao mổ số 11) vô trùng. Cán dao mổ số 11. - Ống nghiệm efpendorf chứa sẵn 1ml cồn ethanol 70% . - Thuốc gây tê tại chỗ Lidocaine . - Cồn sát trùng Tiến hành lấy mẫu: - Dùng khoan sinh thiết nhấn nhẹ vào vị trí thương tổn đã gây tê, cho khoan sinh thiết đi sâu hết thượng bì vào trung bì thì ngưng. Mảnh sinh thiết dính trong lòng khoan, nhẹ nhàng đẩy picton ở đầu trên khoan sinh thiết để đẩy mẩu da ra ngoài. - Mảnh da cắt được cho vào ống nghiệm vô trùng để cấy, hoặc ống nghiệm chứa cồn ethanol 70% nếu làm PCR, folmol 10% nếu làm GPB… - Chuyển ống nghiệm chứa bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm. 16 Lý tưởng nhất, mẫu mô cần lấy bao gồm cả các mô lấy tại vị trí bình thường, trung tâm và rìa của tổn thương. mẫu mô cần được giữ ẩm với nước muối hoặc nước dùng BHI và được vận chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt. Mẫu mô cần được giữ trong một đĩa petri vô trùng. Nếu bệnh phẩm có mủ và chất hoại tử, cấy trực tiếp lên môi trường nuôi cấy. Ngoài ra thực hiện thêm một tiêu bản để kiểm tra trực tiếp. Cắt mẫu thành từng miếng nhỏ với một lưỡi dao vô trùng, Cấy mẫu bệnh phẩm đã cắt nhỏ lên môi trường. - Cấy vào Sabouraud dextrose agar có chứa chloramphenicol và gentamicin và nuôi cấy ở 26oC và 35oC, - Hoặc cấy vào thach dinh dưỡng (BHIA), bổ sung máu cừu 5% và ủ tại 35oC. Duy trì nuôi cấy trong 4 tuần. Lưu ý: Tránh nhiễm khuẩn cho đĩa cấy vào túi nilon vô trùng hoặc dán kín nắp đĩa petri, duy trì ở 260C quan sát trong 4 tuần, một số nấm phát triển chậm. Xét nghiệm soi tươi quan sát trực tiếp vảy da, tóc và móng tay hoặc cho các thành phần khác của nấm Chuẩn bị Kali Hydroxide - Dimethyl Sulfoxide (KOH-DMSO).. Phương pháp: Sử dụng một pipette an toàn, thêm DMSO với nước cất và sau đó hòa tan trong dung dịch KOH. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 40 ml Nước cất 60 ml Kali hydroxit 10 gam Làm gắn kết cho kính hiển vi: 17 1. Mẫu bênh phẩm hòa trong một giọt KOH-DMSO trên một lam kính sạch. 2. Đậy lamen. Không cần làm nóng nếu dùng hỗn hợp KOH +DMSO. 3. Khảo sát dưới kính hiển vi trong vòng 20 phút. Nuôi cấy nấm trên lam để quan sát hình dạng và cách thức sinh bào tử, nhằm định danh S schenckii: Để xác định chính xác nhiều loại nấm, điều cần thiết là quan sát sự sắp xếp của các cuống đính bào tử (conidiophores) và cách thức sinh bào tử (conidial ontogeny). Phương pháp đơn giản của Riddel là nuôi cấy trên lam (42:265 Mycologia, 1950), nấm được phát triển tại chỗ hạn chế thấp nhất sự xáo trộn. Phương pháp đơn giản được cải tiến chỉ sử dụng một mẩu thạch dinh dưỡng nhỏ như là thạch khoai tây đường (potato dextrose) , tuy nhiên, một số loại nấm khó mọc có thể dùng thạch bột ngô hoặc thạch Dox Czapek. để kích thích hình thành bào tử. 1. Sử dụng một lưỡi dao vô trùng cắt một khối thạch (7 x 7 mm) từ đĩa thạch, Lấy khối thạch đặt bên trên đĩa thạch. 2. Đặt một lamen lên bề mặt của tấm thạch. 3. Cấy vào bốn mặt của khối thạch với các bào tử hoặc các mảnh sợi nấm cần nuôi cấy. 4. Đậy đĩa thạch 5. Ủ các đĩa ở 26oC cho đến khi bào tử hình thành và phát triển (4-7 ngày). 6. Khi nấm đã mọc và bám lên lamen, nhấc nhẹ nhàng lamen ra khỏi mẩu thạch. 7. Nhỏ một giọt cồn 95% như một chất làm ướt lên lamen 18 8. Nhẹ nhàng nhỏ một giọt nhỏ Lactophenol Coton màu xanh trên một slide thủy tinh sạch. 9. Âp nhẹ nhàng lamen lên giọt Lactophenol cotton để lại qua đêm cho khô và sau đó gắn lamen vào lam thủy tinh bằng sơn bóng. 10. Quan sát dưới kính hiển vi Mô tả khúm nấm và bào tử của S.schenckii Tại 25oC, khuẩn lạc nấm chậm phát triển, mắt khuẩn lạc trông ẩm và nhẵn , bề mặt nhăn nheo nhiều nếp gấp. Một số chủng có thể sinh sợi nấm ngắn trên không và sắc tố có thể thay đổi từ trắng đến kem sang màu đen. Các bào tử đính phát sinh ở các góc từ vách mỏng của sợi nấm và thường chỉ có một, mọc thẳng và nhỏ dần về phía đỉnh (như điếu xì gà). Bào tử nấm được phát triển thành cụm có nhiều mấu nhỏ, với nhiều gố nhỏ chứa bào tử đính trông như một bông hoa (hoa đào). Tùy vào thời gian nuôi cấy, bào tử nấm được hình thành bào tử đính và sợi nấm không khác biệt. Bào tử nấm có hình trứng 3-6 x 2-3 um, trong suốt, có một vách ngăn và rất mỏng. Trên thạch máu BHI ở 37 oC, khúm nấm nhẵn, trắng xám vàng và giống khúm nấm men, có các tế bào nấm men hình cầu hay hình bầu dục vừa chớm nở. 19 Tách chiết DNA và phản ứng PCR Kỹ thuật tách chiết DNA: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất - Hoá chất và sinh phẩm để ở nhiệt độ phòng - Chuẩn bị bồn ủ nhiệt 56o C và 70o C. - Hoá chất gồm AL, AE, AW1, AW2 và ethanol 100%. - Ống nghiệm và cột lọc DNA được cung cấp trong bộ hoá chất. Tiến trình tách chiết DNA : - Ly tâm ống nghiệm có chứa mẫu 1000rpm/30 giây để làm lắng mẫu trên nắp ống nghiệm. - Thêm vào ống nghiệm 200l dung dịch AL, trộn đều 15 giây, sau đó cho vào bồn ủ 70oC trong 10 phút. Ly tâm ống nghiệm có chứa mẫu 1000rpm/30 giây để làm lắng mẫu trên nắp ống nghiệm. - Thêm vào ống nghiệm 200l Ethanol 100%, trộn đều, thật mạnh trong 15 giây, sau đó ly tâm ống nghiệm có chứa mẫu 1000rpm/30 giây để làm lắng mẫu trên nắp ống nghiệm. 20 - Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên vào cột lọc DNA, Ly tâm 8000rpm/1 phút. Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm khác, thêm vào cột lọc 500l dung dịch AW1. Ly tâm 8000rpm/1 phút. - Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm khác, thêm vào cột lọc 500l dung dịch AW2. Ly tâm 13.000rpm/3 phút. - Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm khác. Ly tâm 13.000rpm/1 phút để loại bỏ toàn bộ hóa chất còn dính trên màng lọc. - Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm có nắp, ghi mã số mẫu, thêm vào cột lọc 100l dung dịch thôi DNA, để ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 8000rpm/1 phút. Phần dịch li tâm là dung dịch có chứa DNA. - Giữ mẫu DNA trong tủ lạnh -20o C, cho đến khi sử dụng. Phản ứng PCR và Nested PCR Gen đích: - M85053  18S rRNA gene of S. schenckii Trình tự các mồi SS1, 5’-CTC GTT CGG CAC CTT ACA CG-3’, (1007-1026) SS2, 5’-CGC TGC AGC CAA AAC GCG GG-3’, (1311-1292) Sản phẩm PCR: 305-nucleotide. SS3, 5-ACT CAC CAG GTC CAG ACA CGA TG-3’; (1146-1168) SS4, 5’-CGC TTT GGG AGG TTA AGC AG-3’, (1297-1275) Sản phẩm PCR 152-nucleotide.