Tài liệu Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU 2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM Hà Nội - 2014 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án của mình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh. Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị và các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ của bạn bè trong và ngoài Viện đã dành cho tôi. Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014 Lê Thiên Minh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014 Tác giả Lê Thiên Minh iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN ARN EDTA SDS-PAGE TCA v/p v/v vvm w/v X WHO Tm FDA TE PCR SDS TLC EtBr dNTP A. flavus A. parasiticus NOR AVN HAVN OAVN AVNN AVF VHA VAL VERB VERA DMST DHDMST ST DHST OMST DHOMST AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Axit deoxyribonucleic Axit ribonucleic Axit etylen diamin tetra axetic Điện di trên gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate Axit trichloroaxetic vòng / phút Thể tích/thể tích thể tích/thể tích/phút Trọng lượng /thể tích Axit amin bất kỳ Tổ chức Y tế thế giới Nhiệt độ tan chảy Cục quản lý Thực phNm và Dược phNm Hoa kỳ Tris EDTA Polymerase chain reaction Sodium dodecyl sulfate Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Ethydium bromit Deoxiribonucleotit triphosphat Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Norsolorinic acid Averantin 5’ hydroxyaverantin Oxoaverantin Averufanin Averufin Versiconal hemiacetal acetate Versiconal Versicolorin B Versicolorin A Demethylsterigmatocystin Dihydro demethylsterigmatocystin Sterigmatocystin Dihydro sterigmatocystin O-methylsterigmatocystin Dihydro-O-methylsterigmatocystin Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2 iv Danh môc c¸c b¶ng STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin 8 2 Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản thực ph m 12 3 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò 12 4 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi 13 5 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus 14 6 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A. flavus DA2 40 7 Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng A. flavus từ ngô, lạc ở một số tỉnh Việt 44 Nam 8 Bảng 3.2 Khả năng tạo aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập từ ngô và 45 lạc 9 Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô và lạc 47 10 Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô và lạc 48 11 Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các 49 mẫu ngô và lạc 12 Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các 50 mẫu ngô và lạc 13 Bảng 3.5 Khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus phân lập 52 14 Bảng 3.6 Hiệu quả giảm aflatoxin B1 của chủng A. flavus AF14 nuôi cấy trên 54 môi trường ngô bằng các chủng A. flavus không sinh aflatoxin 15 Bảng 3.7 Mật độ tế bào A. flavus DA2 và A. flavus AF14 khi nuôi hỗn hợp theo 55 tỉ lệ 1:1 16 Bảng 3.8 Trình tự các cặp mồi 58 17 Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả PCR với các mồi đã sử dụng 60 18 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của A. flavus DA2 đến trọng lượng cơ thể chuột 63 19 Bảng 3.11 Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 tạo được trên các môi 66 trường khác nhau v 20 Bảng 3.12 Khả năng tạo bào tử chủng A. flavus DA2 của nhiệt độ nuôi cấy 67 khác nhau 21 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của độ m môi trường đến khả năng tạo bào tử của 68 chủng A. flavus DA2 22 Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử của chủng A. flavus DA2 69 23 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A. flavus DA2 70 24 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A. flavus 71 DA2 25 Bảng 3.17 Mật độ bào tử A. flavus DA2 trong các chất mang ở các thời gian 72 bảo quản khác nhau 26 Bảng 3.18 Khả năng cạnh của chế ph m A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau 76 bằng sắc ký TLC 27 Bảng 3.19 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 khi bón vào đất ở các 77 tỷ lệ khác nhau 28 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sự phát triển 80 sinh khối của A.flavus DA2 29 Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô, lạc tại một số 82 tỉnh Việt Nam 30 Bảng 3.22 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 84 trong đất trồng ngô sử dụng chế ph m AF 31 Bảng 3.23 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên 86 ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch 32 Bảng 3.24 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin của chế ph m AF trên 89 ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng 33 Bảng 3.25 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 91 trong đất trồng lạc được bón chế ph m AF 34 Bảng 3.26 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên 92 lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch 35 Bảng 3.27 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên lạc sau thời gian bảo quản 6 tháng 93 vi Danh môc c¸c h×nh STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin 6 2 Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền 9 3 Hình 1.3 Khu n lạc A.flavus 15 4 Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát dưới kính hiển vi 15 5 Hình 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 17 6 Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin trên hạt bông giảm khi tỷ lệ AF36 tăng 29 7 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo bởi chủng A. flavus AF14 52 8 Hình 3.2 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus 53 DA2 9 Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.flavus 54 nuôi cấy trên cơ chất ngô bằng sắc ký bản mỏng (TLC) 10 Hình 3.4 Chủng A. flavus DA2 cạnh tranh và lấn át chủng A. flavus AF14 56 trên đĩa thạch 11 Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số trên gen agarose 1,5% 59 12 Hình 3.6 Sản ph m multiplex PCR của chủng A.flavus DA2 và A. flavus 59 AF14 13 Hình 3.7 Khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15 61 thế hệ 14 Hình 3.8 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A.flavus 61 DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ 15 Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của chủng A.flavus DA2 65 16 Hình 3.10 Khả năng cạnh tranh của A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau 75 17 Hình 3.11 Khả năng đối kháng của chế ph m A.flavus DA2 ở các thời điểm 78 cấy khác nhau 18 Hình 3.12 Khả năng đối kháng của chủng A.flavus DA2 khi có mặt của thuốc bảo vệ thực vật 81 vii 19 Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm trên đất trồng ngô 83 20 Hình 3.14 Khu n lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô 85 được bón chế ph m AF tại xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/20076/2008) 21 Hình 3.15 Khả năng kiểm soát aflatoxin trên ngô trước thu hoạch của chế 87 ph m AF 22 Hình 3.16 Bắp ngô ở ruộng sử dụng hai lần chế ph m AF 88 23 Hình 3.17 Bắp ngô ở ruộng không sử dụng chế ph m AF 88 24 Hình 3.18 Ngô sử dụng và không sử dụng chế ph m AF sau thời gian bảo 90 quản 6 tháng 25 Hình 3.19 Chủng A. flavus phát quang và không phát quang phân lập trên 92 đất trồng lạc 26 Hình 3.20 Lạc sử dụng và không sử dụng chế ph m AF sau thời gian bảo quản 6 tháng 94 CL C Trang L I M N………………………………………………………………………………….……i L I CAM OAN.……………………………………………………………………….…………ii DANH M C CÁC KÝ HI U VÀ CH VI T T T..………………………………..…………...iii DANH M C CÁC B NG.………………………………………………………………………..iv DANH M C CÁC HÌNH NH, TH ……………………………………………………..…..vi M U……………………………………………………………………………………….…...4 CH NG I. T NG QUAN TÀI LI U................................................................................ 6 1.1 T NG QUAN V AFLATOXIN ................................................................................... 6 1.1.1 C u t o.................................................................................................................... 6 1.1.2 Tính ch t hóa lý...................................................................................................... 7 1.1.3 c tính c a aflatoxin............................................................................................ 8 1.1.4 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c ............................................................. 9 1.1.5 Gi i h n aflatoxin cho phép trong nông s n th c ph m .................................. 11 1.2 ASPERGILLUS FLAVUS ......................................................................................... 13 1.2.1 c m hình thái ............................................................................................... 13 1.2.2 Các y u t 1.2.3 nh h ng n s sinh tr ng c a A. flavus ................................ 15 u ki n sinh aflatoxin ....................................................................................... 16 1.3 PHÒNG CH NG S NHI M AFLATOXIN............................................................... 19 1.3.1 Bi n pháp canh tác nông nghi p ........................................................................ 19 1.3.2 Bi n pháp sau thu ho ch..................................................................................... 20 1.3.3 Bi n pháp sinh h c .............................................................................................. 21 1.4 PHÒNG CH NG AFLATOXIN B NG CH NG A.FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN ................................................................................................................... 22 1.4.1 C ch ki m soát n m m c và aflatoxin b ng các ch ng A.flavus không sinh aflatoxin......................................................................................................................... 22 1.4.2 Tuy n ch n các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân i kháng ....................................................................................................................................... 24 1.5 NGHIÊN C U NG D NG CH PH M N M A. FLAVUS KHÔNG SINH CT TRONG PHÒNG CH NG AFLATOXIN ......................................................................... 26 1 1.5.1 S n xu t ch ph m A. flavus không sinh aflatoxin ........................................... 26 1.5.2 ánh giá hi u qu c a ch ph m A. flavus không sinh aflatoxin quy mô phòng thí nghi m và nhà kính ..................................................................................... 27 1.5.2 ánh giá hi u qu c a ch ph m A. flavus không sinh aflatoxin quy mô ng ru ng.................................................................................................................... 28 1.5.3 ánh giá tác 1.5.4 Các y u t CH ng c a ch ph m ....................................................................... 30 nh h ng n hi u qu ch ph m................................................. 31 NG II. V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U......................................... 33 2.1 V T LI U, HÓA CH T VÀ THI T B NGHIÊN C U................................................ 33 2.1.1 V t li u nghiên c u.............................................................................................. 33 2.1.2 Hóa ch t, d ng c nghiên c u............................................................................ 33 2.1.4 Môi tr 2.2 PH ng nghiên c u ....................................................................................... 34 NG PHÁP NGHIÊN C U............................................................................... 34 2.2.1 Ph ng pháp l y m u ......................................................................................... 34 2.2.2 Ph ng pháp phân l p........................................................................................ 35 2.2.3 Sàng l c s b các ch ng sinh và không sinh aflatoxin b ng ph ng pháp phát quang .................................................................................................................... 36 2.2.4 Phân tích aflatoxin b ng s c ký n m ng ........................................................ 36 2.2.5 Phân tích aflatoxin b ng s c ký l ng cao áp ..................................................... 36 2.2.6 Nuôi c y n m m c A. flavus cho vi c nghiên c u kh n ng t o aflatoxin ...... 36 2.2.6 Xác nh kh n ng c nh tranh c a các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin i v i ch ng A. flavus sinh aflatoxin......................................................................... 37 2.2.7 Nghiên c u kh n ng t o bào t c a ch ng A. flavus DA2 các u ki n nuôi y khác nhau ............................................................................................................... 37 2.2.8 Quy trình nuôi c y n m m c A. flavus DA2 qui mô phòng thí nghi m......... 38 2.2.9 T o ch ph m ch a bào t ch ng A. flavus DA2 (ch ph m AF)..................... 38 2.2.10 A. flavus trong ch ph m...................................... 38 nh l 2.2.11 Xác ng m t nh s bào t có m t c a m t s gen trong c m gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a các ch ng A. flavus b ng k thu t multiplex PCR...................................................................................................... 38 2.2.12 Th nghi m tính an toàn c a ch ng A.flavus DA2 .......................................... 40 2.2.13 Xác nh t l gi a ch ng sinh aflatoxin v i ch ng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin......................................................................................................................... 41 2 2.2.14 Xác nh th i 2.2.15 ánh giá nh h ms d ng ch ph m ............................................................ 41 ng c a m t s lo i thu c b o v th c v t.......................... 41 2.2.16 ánh giá s c nh tranh c a A.flavus DA2 trong t tr ng ngô, l c............... 41 2.2.17 ánh giá hi u qu ph m AF trên ngô giai gi m m t A.flavus sinh c t và aflatoxin c a ch n tr c và sau thu ho ch............................................. 42 2.2.18 gi m m t ánh giá hi u qu ph m AF trên l c 2.2.19 Ph CH giai ng pháp x n tr A.flavus sinh c t và aflatoxin c a ch c và sau thu ho ch .............................................. 43 lý th ng kê s li u: theo ph n m m Microsoft Excel............. 43 NG III. K T QU VÀ TH O LU N...................................................................... 44 3.1 PHÂN L P, TUY N CH N CH NG A. FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM CH NG S N XU T CH PH M AF.............................................................................. 44 3.1.1 Phân l p các ch ng Aspergillus flavus trên ngô, l c ........................................ 44 3.1.2 Sàng l c các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin........................... 45 3.1.3 Phân lo i các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin phân l p c 46 3.1.4 Tuy n ch n các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin ..................................... 51 3.1.5 ánh giá kh n ng c nh tranh c a các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin 53 3.1.6 Ki m tra s có m t m t s gen trong c m gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a ch ng A. flavus DA2......................... 57 3.1.7 Tính n nh v kh n ng không sinh aflatoxin c a ch ng A. flavus DA2 ...... 61 3.1.8 ánh giá tính an toàn c a ch ng A. flavus DA2 trên ng v t thí nghi m ...... 62 3.2 NGHIÊN C U S N XU T CH PH M A. FLAVUS DA2 ........................................ 65 3.2.1 Nghiên c u công ngh nuôi c y b m t s n xu t bào t ch ng A. flavus DA2 quy mô phòng thí nghi m ............................................................................................ 65 3.2.2 Nghiên c u s n xu t bào t ch ng A.flavus DA2 quy mô pilot.................... 70 3.2.3 Nghiên c u hoàn thi n ch ph m AF t ch ng A.flavus DA2 .......................... 72 3.3 NGHIÊN C U NG D NG CH PH M AF............................................................. 75 3.3.1 Nghiên c u quy mô phòng thí nghi m ........................................................... 75 3.3.2 Nghiên c u quy mô ng ru ng ..................................................................... 82 T LU N VÀ KI N NGH ............................................................................................ 95 KI N NGH ..................................................................................................................... 95 TÀI LI U THAM KH O .................................................................................................. 96 3 U Aflatoxin là nh ng ch t chuy n hóa có các loài n m m c Aspergillus. Các nh ng làm gi m giá tr dinh d c tính cao, c t này t n t i trong nông s n th c ph m, không ng c a th c ph m mà còn là m t trong nh ng nguyên nhân gây nên nh ng c n b nh nguy hi m cho ng gan, suy dinh d ng c sinh t ng h p ch y u b i i và ng v t nh viêm gan c p tính, ung th tr em. Vi c ki m soát hàm l ng aflatoxin có m t trong nông s n th c ph m ã nghiên c u t r t lâu v i nhi u bi n pháp khác nhau, m i bi n pháp nh c m nh t nh nh ng ch a có bi n pháp nào t c u có nh ng u c hi u qu nh mong i. M t bi n pháp truy n th ng nh x lý sau thu ho ch, ch n t o gi ng cây tr ng kháng n m sinh aflatoxin… ch cho phép phát hi n n m m c tri n sinh n mu n, khi n m m c ã phát c t và t n t i trong các s n ph m th c ph m. Nh ng n m g n ây, xu h d ng chính nh ng ch ng n m i kháng Aspergillus flavus không sinh nh tranh cao làm tác nhân ki m soát ang ph m n m Aspergillus flavus ch , giai ng c t có tính c phát tri n và t ra khá hi u qu . Ch i kháng ã c nghiên c u, ng d ng và c p b ng sáng c s d ng r ng rãi trong nông nghi p m t s qu c gia nh M , n , Trung Qu c... Ví d : ch ng NRRL 21882 và AF36 do các nhà khoa h c thu c b Nông nghi p t o ra ã có tác d ng gi m trên 90% hàm l thu nh n c các ch ng A. flavus ng aflatoxin trên ngô và bông. i kháng không sinh bi n pháp phân l p truy n th ng d a trên các ph ng pháp m i d a trên k thu t PCR ã c c t , bên c nh nh ng m sinh lý, sinh hóa, còn có m t c phát tri n h tr cho công vi c sàng c này. H u h t các gen trong c m gen tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a mm c ã c sáng t và trình t ADN c a chúng c ng ã c r t thu n l i cho vi c áp d ng ph c xác nh là c s khoa ng pháp này trong sàng l c các ch ng m c tiêu. Vi t Nam n m trong mi n khí h u nhi t i nóng, m là u ki n r t thu n l i cho các loài n m m c phát tri n, xâm nhi m vào cây tr ng ngay t giai n canh tác, trong su t quá trình b o qu n và ch bi n n u không có bi n pháp ki m soát nghiêm ng t. Cho n nay, Vi t Nam ch a có công trình nghiên c u nào v A. flavus không sinh khác, kh n ng ct phòng ch ng n m m c và ng d ng các ch ng n m m c c t aflatoxin trên ngô, l c. M t i kháng c a các ch ng n m m c không sinh c t th ng thay i theo u ki n khí h u và h sinh thái t ng vùng nên vi c ng d ng các ch ph m n m kháng c s n xu t n c ngoài trên i ng ru ng Vi t Nam không d dàng và em l i 4 hi u qu không cao. Do ó, vi c t o l p m t ch ph m n m A. flavus ch ng phân l p c trên các ngu n t nhiên b n i kháng t nh ng a ch c ch n s mang l i hi u qu gi m thi u s nhi m aflatoxin. Xu t phát t nh ng lý do trên, chúng tôi ã th c hi n kháng c a Aspergillus flavus không sinh ct tài: Nghiên c u tính i phòng ch ng aflatoxin trên ngô và c , v i các m c ích và n i dung nghiên c u chính sau ây: c ích nghiên c u Ki m soát s nhi m aflatoxin trên ngô, l c b ng ch ph m Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. i dung nghiên c u 1. Phân l p, tuy n ch n các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có kh n ng nh tranh cao và n nh v i các ch ng A. flavus sinh aflatoxin. 2. Nghiên c u quy trình nuôi c y và t o ch ph m bào t t ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. 3. Nghiên c u ng d ng ch ph m Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nh m gi m thi u s nhi m aflatoxin trên ngô, l c quy mô phòng thí nghi m và trên ng ru ng. Nh ng óng góp m i c a lu n án 1. Là công trình nghiên c u u tiên Vi t Nam s d ng c ch c nh tranh sinh h c b ng ch ng A. flavus không sinh aflatoxin trong ki m soát aflatoxin nhi m trên ngô và l c. 2. Lu n án nghiên c u s d ng k thu t multiplex PCR làm sáng t b n ch t sinh h c phân t c a ch ng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân l p t ngô (Vi t Nam). Ch ng A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong c m gen sinh t ng h p aflatoxin. 3. Lu n án ã nghiên c u t o ch ng A. flavus DA2 ts nl c công ngh nuôi c y b m t cho s n xu t ch ph m bào ng cao (109CFU/g) v i công ngh n gi n, giá thành . Ch ph m có tác d ng gi m s nhi m n m m c và aflatoxin trên ngô, l c ng ru ng và trong quá trình b o qu n t 86,55% a ra ng d ng quy mô l n. 5 n 97%, giai n m b o tính kh thi cao khi CH NG I. T NG QUAN TÀI LI U 1.1 T NG QUAN V AFLATOXIN 1.1.1 C u t o Aflatoxin là nhóm các h p ch t có nhân difuranocumarin, là s n ph m trao i ch t ch y u c a hai loài n m m c Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Theo Reddy và Farid có kho ng 18 c u trúc hóa h c g n nhau c a aflatoxin ã c tính lý hóa và tính c khác nhau các aflatoxin c xác nh. D a trên c chia thành nhi u nhóm: B ( B1 , B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1. Các lo i aflatoxin này khác bi t v hóa h c không nhi u nh ng khác bi t v ung th c tính là r t l n. Aflatoxin B1 và G1 có kh n ng gây cao h n nhi u so v i các lo i aflatoxin còn l i. Trong các lo i aflatoxin thì aflatoxin B1 ph bi n nh t trong nông s n và gây tác h i nhi u nh t, ti p theo là G1, trong khi ó B2 và G2 t n t i n ng th p h n [115]. Công th c c u t o c a m t s aflatoxin [11]: O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin B1 O O O O O OH OH OCH3 O O Aflatoxin M2 O O O O OCH3 O Aflatoxin M1 O OCH3 Aflatoxin B2 O O O O O O O O OCH3 O Aflatoxin G2 Aflatoxin G1 Hình 1.1 Công th c c u t o c a m t s d ng aflatoxin 6 O OCH3 1.1.2 Tính ch t hóa lý Các aflatoxin c hoà tan trong các dung môi phân c c nh nh chloroform, methanol, acetone, acetonitrile và trong n c dao c bi t dimetylsulfoxit. hòa tan c a aflatoxin ng là 10-20mg/lít. Aflatoxin tinh khi t r t b n v i nhi t. Tuy nhiên, s có m t cao có th phá h y trong d u n, trong chi ti t nh ng d Các aflatoxin t tia t ngo i, c aflatoxin sau m t th i gian nh t c rang ho c trong dung ng nh nhi t ng c và nhi t nh nh s phá h y aflatoxin ch có pH 7. M c dù ch a c nghiên c u cao ã m vòng lacton v i ph n ng decacboxyl hóa. i không b n khi c bi t ah in c trong không khí d các dung môi có i ánh sáng m t tr i và phân c c cao nên vi c kh nhi m aflatoxin trong th c ph m s có nhi u bi n pháp h n [98, 99]. Các aflatoxin ít ho c không b phân h y trong không b phân h y khi un n u phút m i m t tác d ng tc an mm ct nhi t thông th u ki n làm nóng khi thanh trùng, ng ( nhi t 120oC, ph i un 30 c). Do v y, nó có th t n t i trong th c ph m mà không c n s có ng ng, ng th i nó r t b n v i các men tiêu hóa. Tuy nhiên, các aflatoxin có th b phá h y hoàn toàn v i vi c x lý b ng amoniac hay hypochlorit [98]. có m t c a vòng lacton tr ng ki m. phân t aflatoxin làm chúng d b th y phân trong môi c tính này là quan tr ng trong quá trình ch bi n th c ph m vì quá trình x lý ki m làm gi m s nhi m aflatoxin c a các s n ph m. Tuy nhiên, n u x lý ki m là nh thì vi c axit hóa s làm ph n ng ng c tr l i t o aflatoxin ban o cao (100 C), ph n ng decacboxyl m vòng lacton hóa OCH3 c a vòng th m. Ph n ng ng y ra t y ra d n u [22, 11]. nhi t n s m t nhóm - ng t v i amoniac và các h p ch t amin khác [101]. M t s tác nhân oxy hóa nh NaClO, KMnO4 , Cl, H2O2, O3... ph n aflatoxin làm thay i c u trúc phân t c a aflatoxin, c ch c a ph n ng ch a nh, tuy nhiên s thay i c u trúc phân t ã ng v i c xác c th hi n qua s m t tính ch t phát quang [101]. Các aflatoxin phát quang m nh khi cho phép phát hi n các h p ch t này p nh l d n ng i ánh sáng c c tím sóng dài. Tính ch t này th p ( 0,5 ng trên s c kí b n m ng). Nó cung m c b n v m t th c hành cho t t c các ph ng pháp hóa lý cho vi c phát hi n và ng [6, 7]. M t s tính ch t lý, hóa c a các aflatoxin [115]. 7 c trình bày theo b ng 1.1 ng 1.1 Aflatoxin t s tính ch t lý, hóa c a các aflatoxin Công th c Kh i l phân t ng Nhi t nóng ch y phân t ( C) B1 C17H12O6 312 268-269 Xanh da tr i(B) B2 C17H14O6 314 268-289 Xanh da tr i(B) G1 C17H12O7 328 244-246 Xanh lá cây(G) G2 C17H14O7 330 229-231 Xanh lá cây(G) M1 C17H12O7 328 297-299 Xanh tím M2 C17H14O7 330 293 Xanh tím 1.1.3 c tính c a aflatoxin Aflatoxin là các ch t có kh n ng gây ung th , gây gi m kh n ng mi n d ch. Ng nhi m ho c n th t các u Màu hu nh quang o t bi n gen, là tác nhân làm i có th b nhi m aflatoxin do n ph i các lo i ng c c b ng v t c nuôi b ng ng c c b nhi m aflatoxin. Các nghiên nh ng vùng có t l ung th cao trên th gi i u cho th y nhi m c aflatoxin là nguy c chính gây ung th gan [99]. Do c u trúc hóa h c có vòng dihydro-furan nên aflatoxin B1 liên k t v i m t s enzym làm c n tr trao aflatoxin B1 còn t ng tác u trúc di truy n d n n t vong. Ngoài ra, ng hóa tr v i v t ch t di truy n (DNA, RNA) làm r i lo n n t n th ng gan và ung th gan [95]. Cho ch ng khoa h c công nh n kh n ng tác sau: (1) i ch t d n n nay, các lu n ng lên t bào gan c a aflatoxin qua 5 giai n c ch các polymerase là enzyme tham gia vào t ng h p DNA và RNA. (2) Làm ch m ho c ng ng h n s t ng h p DNA. (3) Ng n c n c ch sinh t ng h p RNA thông tin. (4) Bi n i hình d ng nhân t bào. (5) H n ch quá trình sinh t ng h p protein [63]. ch tác ng c a aflatoxin trong c th ng nh rõ ràng. Các nghiên c u g n ây ch tìm th y s ns t bi n codon 249 c a gen p53. Hi n t i nhi m nh h ng này d n n nay v n ch a ng c a các aflatoxin nhóm B n nguy c gây ung th cao do gen p53 là m t gen có tác d ng ch ng vi c t ng lên không bình th hình thành nên các d ng u, b u trong c th [95]. 8 c xác ng c a các t bào, Hình 1.2 Aflatoxin t ng tác ng hóa tr v i v t ch t di truy n 1.1.4 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c 1.1.4.1 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c c a các n Theo ánh giá c a t ch c nông l c trên th gi i ng th gi i (FAO) hàng n m có t 25-50% nông n sau thu ho ch b nhi m mycotoxin trong ó ch y u là aflatoxin. T l này còn cao h n i v i các n c n m trong vùng khí h u nhi t i, có n i 80% ngô b nhi m mycotoxin. Ngoài các nông s n th c ph m thì các lo i th c ph m có ngu n g c t th b nhi m mycotoxin do s d ng các th c n có Các G1 c t [67]. u tra c a M v i trên 1500 m u ngô thu ho ch 1970, ch y u t các ngu n th v mùa c a các n m 1969- ng m i, ã cho th y t 2-3% m u nhi m aflatoxin B1 và kho ng t 3-37 ppb. Trong nghiên c u ti p theo v i 60 m u t aflatoxin B1 ã c tìm th y trong 21 m u ngô nghiên c u nhi m aflatoxin B1 nhi m là 40% v i hàm l này là 97% v i hàm l ng v t c ng có i hàm l m c t 6-308 ppb. ông - nam c a M Thái Lan, 35% m u ng trung bình 400 ppb. ng trung bình là 133 ppb. c bi t Uganda t l o Sebu (Philippin), t l ng trung bình là 213 ppb [131]. Theo Goto và công s , trong mùa m a n m 1984-1985 thu th p t các kho b o qu n ã nhi m aflatoxin B1 v i l Thái Lan, 85% s m u ngô ng 6,30-1310 ppb và 0,6 -767 ppb, theo th t [74]. Trong kh o sát c a Makun và c ng s cho th y 29/50 m u u thu nh n Nigeria nhi m aflatoxin m c 63,5 - 106,2 g/kg, 54% các m u b t m ch bi n nhi m c t v i hàm l ng 102,9 - 198,4 g/kg [97]. 9 các ch Trong n m 1973, nghiên c u v l c bóc v aflatoxin gi i h n t v t n 50 µg/kg. Stoloff ã tìm th y aflatoxin trong các s n ph m l c nh p vào Các aflatoxin ã tìm th y M cho th y 15% c a 361 m u có an M ch làm th c n gia súc, m t m u có 3.465µg/kg. 41% c a 173 s m u l c 9% s m u có trên 1000 µg/kg. 86,5% c a 52 m u Sudan, 16 m u có trên 250 µg/kg và Philippin, t t c các m u b l c c ki m tra n m 1967- 1969, có aflatoxin v i giá tr 155 µg/kg và giá tr trung bình 500 µg/kg [123]. 1.1.4.2 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c Vi t Nam, ngô là cây l quan tr ng nh t c tr ng Vi t Nam ng th c quan tr ng th hai sau cây lúa và là cây màu nhi u vùng sinh thái khác nhau, a d ng v mùa v gieo tr ng và h th ng canh tác. Cây ngô không ch cung c p l mà còn là cây tr ng xóa ói gi m nghèo t i các t nh có xu t ngô c n ng th c cho ng i, v t nuôi u ki n kinh t khó kh n. S n c qua các n m không ng ng t ng v di n tích, n ng su t, s n l 2001 t ng di n tích ngô là 730.000 ha, di n tích ngô c n ng: n m n n m 2005 ã t ng trên 1 tri u ha; n m 2010, c 1126,9 nghìn ha, n ng su t 40,9 t /ha, s n l Bên c nh ó, trong s các cây công nghi p ng n ngày ang ng trên 4,6 tri u t n. c tr ng Vi t nam, l c là cây th c ph m, cây có d u quan tr ng trong s các lo i cây có d u hàng n m trên th gi i, n ph m l c có ngu n protein cao làm th c n cho ng i và gia súc, làm nguyên li u cho công nghi p ch bi n. N m 2012 di n tích gieo tr ng l c trong c n ng c t 220.000ha, s n t 470.600 t n. Hàng n m Vi t Nam xu t kh u kho ng 40.000-45.000 t n l c t kim ng ch xu t kh u 24-26 tri u USD [17]. n th t sau thu ho ch i v i cây ngô, l c là khá l n, trung bình t 13 - 15%. vi c s n xu t ngô, l c trong v Xuân th qu n, s ch ngô, l c trong u không tr ng, ch t l ng g p r t nhi u khó kh n cho vi c thu ho ch, b o u ki n m a kéo dài trong giai n cu i v thu ho ch. Ngô, l c c b o qu n ho c b o qu n không úng qui trình s gi m ch t l c bi t s phát sinh các lo i n m Aspergillus sp. Sinh ng c ng nh hi u qu kinh t c bi t ng nghiêm c t aflatoxin làm gi m ng th i gây b nh ung th gan cho ng i và ng t. n c ta c ng ã có m t s tác gi nghiên c u v m c nhi m n m m c và aflatoxin trên ngô, l c. Nguy n Phùng Ti n và c ng s [9] ã nghiên c u m c c trên ngô, k t qu là 38 m u b o qu n trong kho l nhi m ng th c c a thành ph Thanh Hóa ã nhi m n m m c thu c các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium, Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum. Tuy nhiên ch a có s li u v 10 c nhi m mycotoxin trong công trình này. u Ng c Hào và c ng s ã nghiên c u m c nhi m m c và aflatoxin trên ngô c a các t nh S n La và Thanh Hóa. K t qu phân tích c a 24 m u ngô h t và 24 m u ngô b t cho th y các m u này ã nhi m A.flavus v i l cao, 50-80%. Trong ó, có 33% s m u ngô h t ã nhi m aflatoxin B1 t 10-40ppb, 8,3% s u nhi m aflatoxin B2 t 10-20ppb, 72% s m u ngô b t ã nhi m aflatoxin B1 t 25250ppb, 9,5% s m u ngô nhi m aflatoxin B2 t 10-20ppb, 74,7% m u khô l c nhi m aflatoxin[4]. Nguy n Thùy Châu và c ng s aflatoxin trên ngô và g o m ts a ph ã nghiên c u m c nhi m n m m c và ng cho th y t n xu t nhi m aflatoxin trên ngô mi n Nam và mi n B c Vi t Nam là cao t 73,3% - 95,8% trong ó hàm l trung bình là 63,8ppb [10, 11]. N m 1990-1995 Vi n Dinh D ng aflatoxin ng ã ki m tra 387 m u ng th c th c ph m nh n th y có 73 m u (19%) b nhi m aflatoxin, trong ó có 68% u l c và các s n ph m t l c c ng có ch a lo i c t này [16]. Phan Th Kim và C ng ã ti n hành kh o sát phân tích trên 243 m u ngô, l c và s n ph m ch bi n làm th c n gia súc t i 03 xã thu c huy n Tân K Ngh An tháng 6/2002 ã phát hi n m c nhi m Aflatoxin khá cao trên 90% s m u l y t i các h gia ình ang nhi m aflatoxin, t l v t gi i h n cho phép theo quy nh gi i h n hàm l và nguy c b o qu n b ng aflatoxin có trong th c ph m c a B Y t là trên 23% (56/243m u) [14]. 1.1.5 Gi i h n aflatoxin cho phép trong nông s n th c ph m Tr c th c tr ng nhi m aflatoxin trên m t s nông s n c c a aflatoxin i v i s c kh e con ng m c i và v t nuôi, gây thi t v y, nhi u qu c gia trên th gi i ã có nh ng quy cao c ng nh tính i v kinh t . Chính vì nh gi i h n aflatoxin nhi m trong ng th c, th c ph m và th c n ch n nuôi. Theo tiêu chu n c a c quan qu n lý Th c ph m và D quy nh c ph m M (FDA) gi i h n aflatoxin cho phép trong l c m c 15 ppb (8 ppb cho B1), trong các lo i h t khác và qu khô là 10 ppb (5 ppb cho B1). ng i v i ng c c, qu khô và các lo i h t dùng i, tiêu chu n nghiêm ng t h n và quy nh ch bi n c ch bi n ti p n ngay cho m c 4 ppb (2 ppb cho B1) [67]. Codex a ra tiêu chu n riêng cho aflatoxinB1 là 7,5-10,5 ppb [33]. Gi i h n aflatoxin cho phép trên nông s n th c ph m c trình bày b ng 1.2. 11