Tài liệu Nghiên cứu tính đa hình protein trong một số loại dịch chọc dò của người và tìm giới hạn phát hiện định lượng protein nhằm thay thế các phản ứng định tính

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS LƯƠNG THỊ HỒNG VÂN 2. TS. NGUYỄN GIA BÌNH Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cơ thể ngƣời có khoảng 40 lít dịch trong đó 25 lít nằm trong các tế bào gọi là dịch nội bào, 15 lít nằm bên ngoài tế bào gọi là dịch ngoại bào. Dịch ngoại bào gồm có huyết tƣơng, dịch kẽ, dịch bạch huyết, dịch ổ mắt, dịch tiêu hóa, dịch não tủy (DNT)… Dịch ngoại bào đƣợc vận chuyển trong máu tuần hoàn, có sự trao đổi giữa máu và các mô qua thành mao mạch [6]. Trong các dịch cơ thể nói trên đều chứa các chất vô cơ và hữu cơ hòa tan nhƣ protein, glucose, canxi, photpho, kali... Khi các trị số về hàm lƣợng của những chất này vƣợt khỏi giới hạn sinh lý cho phép (cao hoặc thấp hơn) thì chúng phản ánh những trạng thái bệnh lý nào đó của cơ thể con ngƣời [2], [6]. Ngoài các dịch cơ thể bình thƣờng kể trên, có một số dịch xuất hiện với lƣợng nhiều hơn bình thƣờng biểu hiện bệnh lý nhƣ dịch màng phổi (DMP), dịch màng bụng (DMB), dịch màng tim… gây hiện tƣợng tràn dịch. Dựa trên chỉ số protein là chính và các chất khác có trong dịch mà phân biệt là dịch thấm (transsudat) hoặc dịch tiết (exsudat). Dịch thấm gặp trong các trƣờng hợp thận hƣ, xơ gan có tràn dịch phúc mạc, suy tim. Dịch tiết thƣờng do nguyên nhân nhiễm khuẩn, lao, ung thƣ. Vì vậy khi chẩn đoán một bệnh nào đó có dựa vào xét nghiệm dịch chọc dò (là các dịch đƣợc lấy ra từ màng phổi, màng tim, dịch khoang phúc mạc hoặc dịch tràn từ các khớp lớn), ngƣời ta thƣờng quan tâm nhiều đến chỉ số protein trong đó có hay không có và có bao nhiêu trong một đơn vị tính (ví dụ g/l hoặc mg/dl). Trƣớc đây các nhà chuyên môn chỉ sử dụng phƣơng pháp định tính trong quy trình xét nghiệm dịch chọc dò, những phƣơng pháp này chỉ cho phép trả lời câu hỏi có hay không có protein trong dịch chọc dò mà thôi. Hơn nữa, chỉ một nhiễm tạp nhỏ trong quá trình xét nghiệm cũng sẽ dẫn tới làm sai lệch kết quả, làm mất thời gian, gây tâm lý lo ngại cho bệnh nhân. Hiện nay, với nhiều thành Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 tựu của khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật xét nghiệm nói riêng đã cho phép các nhà sinh học có thể định lƣợng protein nhằm xác định chính xác hàm lƣợng protein có mặt trong bất cứ một sinh phẩm nào, trong đó có các dịch chọc dò của ngƣời. Hay việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu các chỉ thị protein bệnh trong chẩn đoán. Các kỹ thuật này nếu đƣợc nghiên cứu thành công và áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm của các bệnh viện sẽ giúp các bác sĩ chẩn đoán bệnh chính xác hơn và từ đó đƣa ra biện pháp điều trị bệnh phù hợp, kịp thời có hiệu quả hơn. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình protein trong một số loại dịch chọc dò của người và tìm giới hạn phát hiện định lượng protein nhằm thay thế các phản ứng định tính”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xác định đƣợc tính đa hình của hệ protein trong từng loại dịch chọc dò nhằm hƣớng tới chỉ thị protein trong chẩn đoán bệnh. - Xác định đƣợc giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong các dịch chọc dò nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho các phản ứng định tính protein đang dùng tại các bệnh viện của Việt Nam. 3. Nội dung nghiên cứu: - Phân tích hàm lƣợng protein trong các loại dịch chọc dò: DNT, DMP và DMB của nhóm bệnh nhân đƣợc nghiên cứu. - Định tính protein trong DNT bằng phản ứng Pandy, trong DMP và DMB bằng phản ứng Rivalta. - Xác định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DNT nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho phản ứng Pandy. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 - Xác định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DMP và DMB nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho phản ứng Rivalta. - Xác định tính đa hình của protein trong các loại dịch chọc dò đƣợc nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di. 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Sử dụng đặc điểm hóa sinh về protein trong các dịch chọc dò làm cơ sở khoa học cho các chẩn đoán cận lâm sàng của các bệnh liên quan đến dịch chọc dò. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về các dịch chọc dò nghiên cứu 1.1.1. Khái niệm về dịch chọc dò Dịch chọc dò là các dịch đƣợc lấy ra từ màng phổi, màng tim, khoang của não và tủy, khoang phúc mạc hoặc dịch tràn từ các khớp lớn... Có 2 loại dịch khác nhau về bản chất là dịch tiết và dịch thấm. Dịch thấm gặp trong các trƣờng hợp thận hƣ, xơ gan có tràn dịch phúc mạc, suy tim. Dịch tiết thƣờng do nguyên nhân nhiễm khuẩn, lao, ung thƣ [2]. 1.1.2. Dịch não tủy - Nguồn gốc DNT Toàn bộ các khoang của não và tủy có thể tích vào khoảng 1600 ml và khoảng 150 ml thể tích này chứa DNT. DNT có trong các não thất, trong các bể chứa quanh não, trong các khoang chứa màng nhện của não và tủy [6]. DNT đƣợc bài tiết bởi các đám rối màng mạch của các não thất, chủ yếu là hai não thất bên. Ngoài ra DNT cũng đƣợc bài tiết bởi màng ống nội tủy, màng nhện và một phần do não bài tiết qua các khoang mạch đi vào trong não. Các đám rối màng mạch bài tiết DNT thông qua sự vận chuyển tích cực ion Na+ qua các tế bào biểu mô nằm ở phía ngoài của đám rối [6]. - Đặc điểm, tính chất, chức năng của DNT DNT là dịch không màu. DNT có hàm lƣợng protein rất thấp khoảng 20 đến 30 mg/dl và hầu nhƣ không có tế bào (5 bạch cầu lympho/mm3), nồng độ ion Na+ bằng nồng độ ion Na+ của huyết tƣơng, nồng độ ion Cl- cao hơn 15%, nồng độ K+ thấp hơn 40% và nồng độ glucose thấp hơn 30%. Bình thƣờng áp suất DNT của ngƣời ở tƣ thế nằm nghiêng là 100 đến 200 mm H2O, ở tƣ thế ngồi là 200 mm H2O [6]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5 Chức năng quan trọng nhất của DNT là đệm cho não ở trong hộp sọ cứng. Vì tỷ trọng của não và DNT tƣơng tự nhau nên não nổi trong dịch, vì vậy một va chạm vào đầu sẽ làm toàn bộ não chuyển động đồng thời và không một phần nào của não bị xoắn lại vào lúc đó. DNT cũng đóng vai trò của một bình chứa để thích nghi với những thay đổi thể tích của hộp sọ. Trong một chừng mực nào đó, DNT cũng là nơi trao đổi chất dinh dƣỡng của hệ thần kinh. Tuy nhiên phần lớn quá trình trao đổi chuyển hóa của não đƣợc thực hiện trực tiếp với máu [6]. 1.1.3. Dịch màng phổi - Nguồn gốc DMP Khoang màng phổi gồm một lá tạng bao phủ bên ngoài phổi và một lá thành phủ mặt trong thành ngực. Bình thƣờng trong khoang màng phổi có 10 20 ml dịch lỏng để hai lá trƣợt lên nhau dễ dàng, dịch lỏng này đƣợc tiết ra từ màng phổi lá thành, và đƣợc hấp thu chủ yếu ở bạch mạch lá thành màng phổi và một phần lá tạng. Loại dịch lỏng này gọi là DMP [21]. - Đặc điểm, tính chất và chức năng DMP Ở ngƣời bình thƣờng, DMP có thể tích khoảng 0,1 - 0,2 ml/kg. Trong DMP có khoảng 1000 - 5000 tế bào/mm3. Trong đó, 3 - 70 % mesothelial, 30 75% monocytes, 2 - 30% lymphocytes, 10% granulocytes. Hàm lƣợng protein không quá 2 g/dl. Hàm lƣợng glucose tƣơng đƣơng hàm lƣợng glucose trong huyết tƣơng. LDH nhỏ hơn 50% nồng độ trong huyết tƣơng [21]. DMP có tác dụng bôi trơn hai lá màng phổi khi chúng trƣợt lên nhau trong chu kỳ thở. Khi DMP có nhiều gọi là tràn dịch màng phổi (TDMP), xảy ra do thay đổi chênh lệch thuỷ tĩnh hoặc do thay đổi tính thấm màng phổi [21]. - Hiện tƣợng TDMP TDMP là sự tích tụ dịch bất thƣờng trong khoang màng phổi. TDMP đƣợc chia thành TDMP dịch thấm và TDMP dịch tiết. TDMP dịch thấm xuất Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 6 hiện khi có sự thay đổi các yếu tố toàn thân có ảnh hƣởng đến sự hình thành và hấp thu DMP làm cho DMP tích tụ. TDMP dịch tiết xuất hiện khi có sự thay đổi bề mặt của màng phổi hoặc thay đổi tại các mao mạch màng phổi làm tích tụ DMP [23]. 1.1.4. Dịch màng bụng - Nguồn gốc DMB DMB hay còn gọi là dịch báng hoặc dịch phúc mạc. Phúc mạc là một thanh mạc phủ tất cả các thành của ổ bụng, bao bọc các tạng thuộc bộ máy tiêu hoá và che phủ phía trƣớc, hoặc phía trên các tạng tiết niệu và sinh dục. Phúc mạc gồm có 2 lớp, lớp thanh mạc và lớp dƣới thanh mạc. Lớp thanh mạc là lớp tế bào thƣợng mô trơn láng óng ánh và tiết ra một lớp dịch mỏng làm thấm ƣớt phúc mạc để trƣợt lên nhau dễ dàng. DMB là loại dịch có đƣợc do sự tích tụ các chất lỏng tự do trong khoang phúc mạc [7], [28]. - Đặc điểm, tính chất và chức năng DMB DMB có thể là dịch thấm hoặc dịch tiết. DMB bình thƣờng không vƣợt quá 5ml dịch thấm. DMB thƣờng có màu vàng rơm, xuất hiện vẩn đục là do sự hiện diện của các bạch cầu trung tính. Ngoài ra trong dịch còn có các chất béo trung tính. DMB là một chất lỏng có vai trò nhƣ một chất bôi trơn trong khoang bụng. DMB có tác dụng làm ẩm bên ngoài của các cơ quan và giảm ma sát các nhu động của cơ quan trong quá trình tiêu hóa [7]. - Hiện tƣợng tràn dịch màng bụng (TDMB) TDMB là một dấu hiệu lâm sàng phổ biến có nhiều nguyên nhân nhƣ: xơ gan (75%), các bệnh ác tính (10%), suy tim (5%) và các nguyên nhân khác (10%) [28]. 1.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu protein dịch chọc dò 1.2.1. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu định tính protein Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 7 - Định tính protein bằng phản ứng Xantoprotein Dinitrotyrozin (màu vàng) Thể quinoit của dinotrotyrozin Muối natri của dinitrotyrozin (màu da cam) Hình 1.1. Sơ đồ cơ chế của phản ứng Xantoprotein [9] Đây là những phản ứng đặc trƣng cho những protein có chứa acid amin vòng nhƣ phenilalanin, tirozin, tryptophan. Khi đun nóng dung dịch protein với HNO3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất nitơ màu vàng. Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có cấu tạo quinoit màu da cam. Ngƣợc lại, các protein không chứa acid amin vòng nhƣ gelatin không cho phản ứng này [9]. - Định tính protein bằng phản ứng Millon Thủy ngân – nitrotyrozin(màu đỏ) tyrozin Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế của phản ứng Millon [9] Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 8 Thuốc thử millon là hỗn hợp các muối nitrat và nitric thủy ngân đƣợc hòa tan trong HNO3. Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợp chất nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ. Phản ứng Millon đƣợc dùng để phát hiện protein chứa tyrozin và các hợp chất phenol [9]. - Định tính protein bằng phản ứng Adamkievic Bis – 2-tryptophanalilmetan Tryptophan Hình 1.3. Sơ đồ cơ chế của phản ứng Adamkievic [9] Trong môi trƣờng acid, tryptophan phản ứng với nhiều loại andehit tạo thành những sản phẩm ngƣng kết có màu đỏ tím đặc trƣng. Phản ứng Adamkievic đƣợc dùng để phát hiện protein chứa tryptophan [9]. - Định tính protein bằng phản ứng tủa với TCA (acid tricloacetic) TCA là một acid hữu cơ có khả năng làm kết tủa protein trong dung dịch. Khi cho TCA vào dung dịch thì nó làm kết tủa protein sau đó ta đem lọc và rửa kết tủa sẽ thu đƣợc protein. Phƣơng pháp này chỉ dùng cho các protein tan trong nƣớc và có độ chính xác tƣơng đối cao [9]. 1.2.2. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu định lƣợng protein - Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử folin. Phƣơng pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thủ folin tác dụng lên gốc tyrozin, tryptophan, histidin, để tạo phức màu xanh đặc trƣng có độ hấp thu Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 9 cực đại ở bƣớc sóng 750 nm và dựa vào đƣờng chuẩn protein để từ đó định lƣợng hàm lƣợng protein. Cƣờng độ màu tỉ lệ với nồng độ protein. Hình 1.4. Mô hình phƣơng pháp Lowry [5], [9] Phƣơng pháp Lowry có độ nhạy tƣơng đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg protein/ml, thƣờng nhạy trong khoảng từ 2 - 5 µg protein/ml [5], [9]. - Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford Trong môi trƣờng acid, Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với protein, tƣơng tác với nhóm kỵ nƣớc và nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh. Dựa vào đƣờng chuẩn của protein suy ra hàm lƣợng protein trong mẫu. Hình 1.5. Mô hình phƣơng pháp Bradford [5], [9] Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 10 Phƣơng pháp này dùng cho protein tan trong nƣớc, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng. Phƣơng pháp này nhạy hơn 2 - 3 lần so với phƣơng pháp Lowry, nhanh và đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác định tới vài µg protein/ml, đồng thời làm giảm ảnh hƣởng của muối, đệm, các chất khử [5], [9]. - Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp quang phổ Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bƣớc sóng 280 nm do các acid amin tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin. Sự hấp thu ở bƣớc sóng 280 nm của chúng cũng thay đổi tùy loại protein nhƣng hệ số tắc đo đƣợc cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch. Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch. Phƣơng pháp này không dùng đƣợc cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím. So với phƣơng pháp so màu thì phƣơng pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn, mẫu dùng lại thƣờng ổn định hóa phần lớn protein [9]. - Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Biure Dựa vào phản ứng tạo màu giữa protein và Cu+2 trong môi trƣờng kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 540 nm. Cƣờng độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lƣợng Cu và số lƣợng liên kết peptid trong chuỗi polypeptid. Phƣơng pháp này nhạy hơn phƣơng pháp Lowry nhƣng không bằng phƣơng pháp Bradford vì nó đƣợc sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lƣợng protein tƣơng đối lớn (2 - 20 µg/ml) [9]. 1.2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử nghiên cứu protein - Điện di biến tính protein (SDS-PAGE) Phƣơng pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn đƣợc gọi là phƣơng pháp điện di trên gel acrylamide không Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 11 liên tục và mẫu protein đƣợc gây biến tính. SDS là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2-mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay DTT thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S-S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc 1 và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, dƣới tác động của điện trƣờng sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng. Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục. Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp là lớp gel cô và gel tách [12]. Lớp gel cô: Thông thƣờng lớp gel này có nồng độ gel thấp (4 - 5%), và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu. Khi có tác động của điện trƣờng các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này. Nhờ đó, các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein [12]. Lớp gel tách: Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel cô, và nằm phía dƣới. Có tác dụng trong việc tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu [12]. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10000 - 200000 Da (daltons). Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200000 Da thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5% [12]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 12 Hình 1.6. Cấu trúc protein trƣớc và sau khi biến tính bởi SDS [12] - Điện di hai chiều protein (2-DE) Kỹ thuật điện di hai chiều (Two Dimensional Electrophoresis, 2-DE) là một trong những công cụ phân tách protein và đƣợc sử dụng trong nghiên cứu về hệ protein [32]. Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI, 1kDa về khối lƣợng phân tử và có thể phát hiện vệt protein có hàm lƣợng < 1 ng. Tùy thuộc vào kích thƣớc lỗ gel và giải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [27]. Nhờ đó mà nó ngày càng trở thành một công cụ đƣợc ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và các dịch cơ thể [34]. Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein đƣợc phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bằng một trong các phƣơng pháp sau: điện di gradien pH cố định, điện di hội tụ theo điểm đẳng điện hoặc điện di gradien pH không cân bằng [4]. Chiều thứ hai, các phân tử protein đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid. Do đó, thực chất 2-DE là phƣơng pháp Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 13 phân tách protein theo 2 chiều, chiều thứ nhất theo điện tích và chiều thứ hai theo trọng lƣợng phân tử. Hình 1.7. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE [4] Một trong những ƣu điểm nữa của phƣơng pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với các hệ thống phân tích hình ảnh gel hoàn toàn tự động. Tuy nhiên, điện di 2-DE cũng gặp phải một số vấn đề trong đó phổ biến nhất là tính lặp lại tƣơng đối của thí nghiệm điện di. Kết quả điện di của cùng một mẫu có thể có những sai lệch giữa các lần chạy khác nhau [41], [42]. Vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng khi sử dụng 2-DE cho mục đích so sánh sự khác biệt giữa hai mẫu khác nhau [41]. - Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE–MS) Khối phổ (Mass spectrometry - MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lƣợng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trƣờng. Mẫu đƣợc ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và đƣợc phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu đƣợc tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học [4]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 14 Hình 1.8. Sơ đồ kết hợp 2-DE và MS/MS trong xác định protein [4] Phƣơng pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một trong những cách tiếp cận thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong nghiên cứu proteomics [32], [33]. 1.3. Một số xét nghiệm sinh hóa dịch chọc dò và ý nghĩa của việc nghiên cứu protein dịch chọc dò 1.3.1. Một số xét nghiệm sinh hóa dịch chọc dò dùng trong chẩn đoán Xét nghiệm đạm và LDH (lactic dehydrogenase): Đây là một trong những xét nghiệm sinh hóa ban đầu giúp phân biệt dịch thấm và dịch tiết đối với dịch chọc dò. Hàm lƣợng urê trong DNT ngƣời bình thƣờng dao động trong khoảng 2,5 - 6,7 mmol/l. Xét nghiệm LDH thƣờng đƣợc quan tâm nhiều đối với DMP và DMB. Đối với hai loại dịch này, dịch tiết thƣờng có LDH và đạm tăng nên đạm và LDH đƣợc sử dụng trong việc phân biệt dịch thấm và dịch tiết [2], [17], [21], [23]. Xét nghiệm glucose: Glucose DNT bằng 2/3 nồng độ glucose máu. Sự tăng hay giảm glucose DNT phụ thuộc vào nồng độ của glucose máu. Glucose Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 15 DNT tăng ở những bệnh nhân hôn mê đái tháo đƣờng. Ngoài ra, glucose còn tăng ít trong viêm não, tăng áp lực sọ não, động kinh, uốn ván, trong các cơn co giật khác, nhƣng sự tăng này ít có ý nghĩa trong việc chẩn đoán. Sự tăng bạch cầu và sự xuất hiện của các vi khuẩn trong DNT là nguyên nhân làm giảm nồng độ glucose có trong DNT. Glucose giảm nhiều trong viêm màng não mủ, đôi khi chỉ còn ở dạng vết, trong khí đó glucose máu vẫn ở mức bình thƣờng. Glucose cũng giảm trong viêm não do lao. Glucose trong DMP, DMB bình thƣờng hoặc dịch thấm tƣơng đƣơng glucose huyết tƣơng. Glucose < 60 mg/dl có thể gặp trong viêm đa khớp dạng thấp, tràn mủ màng phổi, ác tính, lao, lupus. Nếu glucose rất thấp (< 30 mg/dl) nguyên nhân thƣờng là viêm đa khớp dạng thấp, tràn mủ màng phổi, ác tính [2], [17], [21], [23]. Xét nghiệm hàm lƣợng protein: Trong DNT của ngƣời bình thƣờng, hàm lƣợng protein dao động trong khoảng 0,25 - 0,4 g/l. Protein DNT tăng trong viêm màng não do lao, viêm màng não mủ, viêm màng não, ép tuỷ, viêm đa rễ thần kinh, viêm màng nhện tuỷ. Đối với DMP và DMB, ở những trƣờng hợp dịch tiết nhận thấy hàm lƣợng protein tăng cao [2], [17], [21], [23]. Xét nghiệm clorua: Trong DNT của ngƣời bình thƣờng, hàm lƣợng clorua dao động trong khoảng 120 -130 mmol/l. Clorua giảm nhiều trong viêm màng não do lao, kèm theo sự thay đổi của protein và glucose trong DNT. Clorua còn có thể giảm trong viêm màng não, u não [2], [17], [23]. Xét nghiệm tế bào học: Nếu trong DMP có 5000 - 10000 hồng cầu/mm3 dịch có màu hồng đỏ. Nếu > 100000 hồng cầu/mm3: chấn thƣơng lồng ngực, ác tính, nhồi máu phổi. Dịch thấm thƣờng có bạch cầu < 1000 tế bào/mm3. Dịch tiết thƣờng có bạch cầu > 1000 tế bào/mm3. Nếu > 10000 tế bào/mm3 thƣờng do TDMP cận viêm phổi nhƣng cũng gặp trong viêm tụy cấp, nhồi máu phổi. Nếu > 50000 tế bào/mm3 thƣờng là tràn mủ màng phổi. Nếu là lao, viêm mạn tính, bệnh lý ác tính thƣờng < 5000 tế bào/mm3. Lymphocyte nhỏ > 50% thƣờng là Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 16 viêm mạn tính nhƣ lao hoặc ung thƣ. Bạch cầu đa nhân trung tính ƣu thế thƣờng là viêm cấp nhƣ viêm phổi, viêm tụy cấp, nhồi máu phổi, lao giai đoạn sớm. Bạch cầu đa nhân ái toan tăng > 10% thì 2/3 trƣờng hợp là do có khí hoặc máu trong màng phổi dẫn tới tràn máu màng phổi, tràn khí màng phổi, TDMP cận viêm phổi. Bạch cầu ái toan thƣờng không tăng trong ung thƣ và lao. DMB bình thƣờng chứa < 500 bạch cầu/µl và < 250 bạch cầu đa nhân/µl. Bất kỳ tình trạng nhiễm trùng nào cũng có thể gây tăng bạch cầu. Lƣợng bạch cầu đa nhân > 250 /µl gợi ý viêm phúc mạc do vi trùng. Bạch cầu lympho thƣờng chiếm ƣu thế trong viêm phúc mạc do lao và ung thƣ di căn phúc mạc [2], [21], [23]. 1.3.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu protein dịch chọc dò Nghiên cứu về hệ protein trong các dịch của cơ thể là một hƣớng nghiên cứu mới và nhiều triển vọng trong việc tìm ra những protein chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [3]. DNT, DMP và DMB là những loại dịch của cơ thể đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong việc chẩn đoán nguyên nhân bệnh lý. Các loại dịch chọc dò này mang hai đặc trƣng quan trọng giúp cho quá trình nghiên cứu thuận lợi đó là các thủ thuật chọc dò hiện nay rất phổ biến trong ngành y nên việc lấy mẫu rất dễ dàng và an toàn, mẫu đƣợc lấy phản ánh trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó (thời điểm biểu hiện bệnh lý) [4]. Trong các loại dịch chọc dò kể trên, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của dịch chọc dò bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein dịch chọc dò hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau. Những thay đổi bất thƣờng về thành phần protein trong từng loại dịch chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý. Nói cách khác, dịch chọc dò là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 17 cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng các loại dịch chọc dò cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang đƣợc minh chứng qua những thành tựu thu đƣợc trong nhiều thập kỷ qua. Lƣợng thông tin phong phú do các nghiên cứu về protein dịch chọc dò thu đƣợc hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome. Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tƣơng lai. 1.4. Sơ lƣợc tình hình nghiên cứu sinh hóa các dịch chọc dò ở Việt Nam và trên thế giới 1.4.1. Tình hình nghiên cứu sinh hóa DNT ở Việt Nam và trên thế giới DNT là một trong số các dịch chọc dò đƣợc nhiều nhà khoa học trong nƣớc và thế giới quan tâm nghiên cứu. Hầu hết các nghiên cứu đều coi đây là một đối tƣợng cần phân tích để đƣa ra những dấu hiệu trong chẩn đoán. DNT là thành phần liên quan tới hầu hết các hoạt động của hệ thống thần kinh trung ƣơng. Hiện nay, DNT đƣợc sử dụng để nghiên cứu các bệnh liên quan tới việc mất cân bằng các thành phần phân tử đặc biệt là các thành phần ngoại bào [45]. Các nhà khoa học Phần Lan đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí kết hợp khối phổ trong việc xác định những tính chất của DNT. Nghiên cứu cho thấy nồng độ 21 acid amin và hydroxyl thay đổi từ 0,04 - 77 ng/µl. Nhờ kỹ thuật khối phổ đã xác định đƣợc 91 chất chuyển hóa thuộc các nhóm chức năng khác nhau. Các chức năng này liên quan mật thiết tới chức năng của DNT [36]. Năm 2011, các nhà khoa học Mỹ đã tiến hành nghiên cứu sự khác biệt về thành phần protein trong DNT của nhóm bệnh nhân mắc hội chứng mệt mỏi mạn tính và nhóm bệnh nhân bị bệnh Lyme đang điều trị giai đoạn cuối so với Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 18 những ngƣời bình thƣờng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong DNT của nhóm bệnh nhân mắc hội chứng mệt mỏi mạn tính phát hiện 2783 loại protein, nhóm bệnh nhân mắc bệnh Lyme phát hiện 2768 loại protein và những ngƣời khỏe mạnh thì thấy 2630 loại protein. Đây là những cơ sở dữ liệu hữu ích để đƣa ra những giả thiết về cơ chế sinh bệnh, cho phép tiến hành những nghiên cứu tiếp theo trong việc chẩn đoán sớm và can thiệp điều trị kịp thời [48]. Xét nghiệm DNT là một trong những căn cứ quan trọng trong việc chẩn đoán viêm màng não. Hàm lƣợng protein, hàm lƣợng đƣờng, lƣợng bạch cầu và lƣợng neutrophil trong DNT là những tiêu chí quan trọng của tiêu chuẩn Thome trong việc phân biệt viêm màng não mủ hay viêm màng não siêu vi [30]. Các nhà khoa học của Mỹ gần đây đã tập trung nghiên cứu phân tích DNT nhằm hƣớng tới xây dựng cơ sở dữ liệu về protein DNT phục vụ chẩn đoán bệnh. Bƣớc đầu đã có những kết quả nhất định chứng tỏ protein DNT có liên quan tới nhiều bệnh nhƣ Parkinson, bệnh Alzheimer, chấn thƣơng sọ não, teo cơ. Phát hiện nhiều loại protein chỉ có ở DNT, do vậy đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu nhiều triển vọng cho việc tìm ra các protein chỉ thị bệnh [54]. Cùng nghiên cứu về DNT của bệnh nhân Alzheimer, tại phòng thí nghiệm Đại học Toronto Canada, các nhà khoa học đã bƣớc đầu nghiên cứu chỉ thị phân tử protein trong DNT trong chẩn đoán sớm bệnh Alzheimer. Kết quả đã xác định đƣợc 40 loại protein có liên quan tới bệnh Alzheimer có mặt trong DNT. Hầu hết chúng là các protein ngoại bào [29]. Nghiên cứu phân tích protein trong DNT của bệnh nhân Parkinson cho thấy 21 protein đƣợc xác định có liên quan tới cơ chế của bệnh. Đây là những kết quả do các nhà khoa học Đại học Fudan Trung Quốc mới công bố, nó mở ra những hƣớng nghiên cứu mới trong chữa trị bệnh Parkinson [53]. Tại Việt Nam, những nghiên cứu về DNT còn nhiều hạn chế so với thế giới. Hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam chỉ hƣớng tới xác định sự thay đổi các Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/