Tài liệu Nghiên cứu thu nhận vi thể và đánh giá khả năng mang dna của vi thể từ tế bào hồng cầu người

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẬU THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU THU NHẬN VI THỂ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG DNA CỦA VI THỂ TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đức Bách NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đậu Thị Hiền i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc thầy giáo TS. Nguyễn Đức Bách đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin được cám ơn chân thành đến các thầy cô trong Bộ môn sinh học phân tửCông nghệ sinh học ứng dụng, Bộ môn công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Bộ môn bệnh cây nông dược, Khoa Nông học đã tạo điều kiện thuận lợi trong việc sử dụng các trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy siêu ly tâm và các thiết bị khác mà tôi đã thực hiện luận văn tại Bộ môn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ (NAFOSTED) đã tài trợ cho đề tài nghiên cứu cơ bản mã số 106-YS.06-2013.16 để tôi có điều kiện thuận lợi thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đậu Thị Hiền ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix Thesis abstract ................................................................................................................. xi Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 0 1.1 Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2 Giả thuyết khoa học ............................................................................................ 1 1.3 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3.1 Mục tiêu chung: .................................................................................................. 2 1.3.2 Mục tiêu cụ thể: .................................................................................................. 2 1.4 Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.4.1 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.4.2 Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.4.3 Thời gian, địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 2 1.5 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn của đề tài ............................. 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1 Tổng quan về vi thể ............................................................................................ 4 2.2.1 Giới thiệu về vi thể ............................................................................................. 4 2.2.2 Đặc điểm của vi thể ............................................................................................ 5 2.2.3 Vi thể và khả năng tương tác giữa các tế bào ..................................................... 7 2.2.4 Khả năng vận chuyển protein của vi thể............................................................. 9 2.2.5 Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể ................................................... 10 2.2 Quá trình hình thành vi thể ở tế bào ................................................................. 10 2.3. Chức năng của vi thể ........................................................................................ 12 2.4. Các nghiên cứu về vi thể hiện nay .................................................................... 13 iii 2.4.1. Vi thể tham gia vào quá trình đông máu .......................................................... 13 2.4.2. Vi thể và ung thư .............................................................................................. 13 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 14 3.1. Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 14 3.2. Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 14 3.3. Đối tượng vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 14 3.3.1 Mẫu máu ........................................................................................................... 14 3.3.2 Hóa chất ............................................................................................................ 14 3.3.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 16 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 18 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 19 3.5.1 Chuẩn bị mẫu hồng cầu .................................................................................... 19 3.5.2 Đánh giá sự hình thành vi thể theo thời gian bảo quản .................................... 19 3.5.3 Cảm ứng hình thành vi thể................................................................................ 19 3.5.4. Xác định sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu.............................................. 19 3.5.5. Phương pháp thu nhận vi thể ............................................................................ 20 3.5.6. Xác định các đặc điểm của vi thể ..................................................................... 22 3.5.7. Xác định khả năng tương tác của vi thể với DNA ........................................... 22 Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 23 4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên sự hình thành vi thể ............................................ 23 4.2 Cảm ứng hình thành vi thể................................................................................ 25 4.2.1 Quá trình cảm ứng ............................................................................................ 25 4.2.2 Phân tích hình thái hình thái và kích thước tế bào cảm ứng ............................. 30 4.2.3 Phân tích bằng máy đếm tế bào ........................................................................ 31 4.3 Thu nhận và xác định các đặc điểm của vi thể ................................................. 32 4.3.1 Thu nhận vi thể ................................................................................................. 32 4.3.2 Phân tích vi thể bằng máy đếm tế bào .............................................................. 32 4.3.3 Phân tích kích thước vi thể bằng máy Nanosizer ............................................. 33 4.3.4 Phân tích điện tích vi thể bằng máy nanosizer ................................................. 35 4.4 Nghiên cứu tương tác giữa dna với vi thể ........................................................ 36 4.4.1 Ảnh hưởng của sốc nhiệt .................................................................................. 36 4.4.2 Ảnh hưởng của xung điện................................................................................. 37 iv Phần 5. Kết luận và kiến nghị..................................................................................... 39 5.1. Kết luận............................................................................................................. 39 5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 39 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 40 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt A23187 Calcium Ionophore Cai2+ Ca2+ nội bào DMSO Dimethyl sulfoxide EVs Extracellular vesicles HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid LPA Lysophosphatidic acid MV Vi thể (microvesicle) PKC Protein kinase C PMA Phorbol myristate acetate PS Phosphatydilserine TFs Các yếu tố mô (Tissue Factors) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các loại tế bào hình thành từ Evs ..................................................................... 7 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào ....................................................5 Hình 2.2. Con đường hình thành vi thể. ................................................................................6 Hình 2.3. Cơ chế tương tác giữa MV với tế bào ..................................................................9 Hình 2.4. Cơ chế hình thành vi thể ......................................................................................11 Hình 2.5. Cơ chế tương tác và truyền tín hiệu của vi thể với tế bào đích .......................12 Hình 3.1. Phân tử calcium ionophore (A23187) ................................................................14 Hình 3.2. Phân tử phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ..............................................15 Hình 3.3. Phân tử lysophosphatidic acid .............................................................................15 Hình 3.4. Phân tử Annexin V-FITC.....................................................................................16 Hình 3.5. Máy siêu ly tâm .....................................................................................................16 Hình 3.6. Máy nanosizer .......................................................................................................17 Hình 3.7. Kính hiển vi thường ..............................................................................................18 Hình 3.8. Kính hiển vi huỳnh quang....................................................................................18 Hình 3.9. Quy trình thu nhận vi thể .....................................................................................21 Hình 4.1. Thời gian ảnh hưởng lên quá trình hình thành vi thể .......................................25 Hình 4.2. Sự hình thành vi thể trên tế bào hồng cầu..........................................................27 Hình 4.3. Sự hình thành vi thể khi cảm ứng bằng PMA ...................................................30 Hình 4.4. Phân tích SEM hồng cầu khi bị kích thích và hình thành vi thể.....................31 Hình 4.5. Phân tích sự hình thành vi thể ở các tế bào cảm ứng .......................................32 Hình 4.6. Phân tích vi thể sau khi tách bằng siêu ly tâm ..................................................33 Hình 4.7. Phân tích kích thước vi thể bằng máy Nanosizer .............................................34 Hình 4.8. Ảnh hưởng của môi trường đến thế zeta của vi thể ..........................................35 Hình 4.9. Phân tích kích thước và hình dạng của vi thể....................................................36 Hình 4.10. Ảnh hưởng của sốc nhiệt đến khả năng tương tác giữa vi thể và DNA ........37 Hình 4.11. Ảnh hưởng của xung điện đến khả năng tương tác giữa vi thể và DNA ....................................................................................................... 39 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đậu Thị Hiền Tên Luận văn: “Nghiên cứu thu nhận vi thể và đánh giá khả năng mang DNA của vi thể từ tế bào hồng cầu người”. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các thành phần tiết có nguồn gốc từ tế bào còn gọi là extracellular vesicles (EVs). Nhiều thuật ngữ khác nhau của Evs cho đến nay đã được sử dụng và đôi khi có sự nhầm lẫn bao gồm exosomes, microvesicles (MV), shedding vesicles, apoptosomes hoặc thể apoptosis (apoptosis bodies) Dựa vào nguồn gốc và kích thước mà EVs chia thành 3 loại: exosome, vi thể (microvesicle/MV) và apotosis bodies Trong nghiên cứu này, sự hình thành của vi thể và khả năng mang DNA của vi thể được nghiên cứu từ các tế bào hồng cầu (RBCs). Dưới điều kiện bảo quản, việc hình thành của vi thể từ tế bào hồng cầu đã được quan sát . Ngoài ra, theo các điều kiện cảm ứng bởi A23187, LPA hoặc PMA sự hình thành và giải phóng vi thể đã được nghiên cứu. Các đặc điểm của vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu đã được nghiên cứu trong thời gian lưu trữ hoặc ở các điều kiện cảm ứng khác nhau. Bằng cách ly tâm khác nhau và phương pháp siêu ly tâm, hai quần thể vi thể đã được thu nhận. Phân tích số liệu bằng nanosizer cho thấy rằng kích thước của quần thể vi thể là 205,8 ± 51,4 nm và 125,6 ± 31,4 nm. Các hình thái của vi thể cũng đã được quan sát bởi SEM. Sự tương tác của vi thể với DNA được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp sốc nhiệt và xung điện. Kết quả cho thấy phương pháp sốc nhiệt không ảnh hưởng đến khả năng tương tác giữa MV và DNA. Tuy nhiên, trong sự hiện diện của các ion Ca2 + và xung điện, sự tương tác của vi thể và DNA đã được nghiên cứu và quan sát. Kết quả cho thấy rằng vi thể có thể sử dụng làm vật liệu cho việc chuyển DNA. Mục đích nghiên cứu Vi thể được hình thành hầu hết ở tất cả các tế bào, kể cả tế bào hồng cầu. Về nguyên tắc, những tế bào hồng cầu người không có nhân hoặc vật liệu di truyền. Ngoài ra, tế bào hồng cầu hiện nay chiếm số lượng rất lớn trong máu và không cần phải nuôi cấy tế bào. Hơn nữa, tế bào hồng cầu có thể liên hệ với tất cả các tế bào trong cơ thể. ix Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng vi thể hình thành từ các tế bào đã cảm ứng, đặc biệt từ các tế bào ung thư vi thể có khả năng mang vật liệu di truyền, các phân tử protein và tín hiệu, và chuyển đến các loại tế bào khác. Do đó, vi thể hình thành từ hồng cầu có thể được sử dụng như một vật liệu để chuyển DNA vào tế bào mục tiêu. Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, vi thể được thu nhận từ tế bào hồng cầu người bằng cách nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lưu trữ lên sự hình thành vi thể và cảm ứng hình thành vi thể bằng 4-bromo-A23187 (chứng dương), axit lysophosphatidic (LPA), hoặc phorbol-12 Myristate-13 acetate (PMA) trong sự hiện diện của 2 mM Ca2+ dẫn đến một sự thay đổi khối lượng tế bào và hình thái tế bào hồng cầu. Khi hồng cầu bị kích thích, sự tiếp xúc của phosphatidylserin (PS) và sự hình thành vi thể đã được quan sát bằng cách sử dụng Annexin V-FITC. Sự hình thành và giải phóng vi thể đã được quan sát bằng sử dụng chất cảm ứng PMA dưới kính hiển vi huỳnh quang ngược. Bằng cách sử dụng máy nanosizer và SEM để xác định hình dạng, đặc điểm, kích thước và điện tích vi thể. Sử dụng phương pháp sốc nhiệt và xung điện để nghiên cứu sự tương tác của vi thể với DNA. Kết quả chính và kết luận Dưới điều kiện bảo quản, hồng cầu bắt đầu hình thành vi thể từ ngày 14 ở 40C. Khi cảm ứng hồng cầu với LPA, PMA hoặc A23187 trong sự hiện diện của 2mm Ca2+ dẫn đến việc tiếp xúc của PS ngoài màng tế bào và hình thành vi thể. Kích thước của vi thể sau khi thu nhận trong khoảng 100 đến 1000 nm. Bằng cách ly tâm khác nhau, hai quần thể của vi thể đã được tách ra với kích thước của 205,8 ± 51,4 nm và 125,6 ± 31,4 nm. Xung điện là một phương pháp thích hợp để thúc đẩy sự tương tác của vi thể với DNA và được sử dụng cho các thí nghiệm chuyển DNA. Vi thể có thể được sử dụng như một vật liệu mới để mang DNA và chuyển DNA đến các loại tế bào khác nhau. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Dau Thi Hien Thesis title: “Study on microvesicles and the ability of carrying DNA of microvesicle released from human red blood cell”. Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA). Extracellular vesicles (EVs) are spherical fragments of cell membrane released from various cell types under physiological as well as pathological conditions. At present, many different terms for EVs have been used such as exosome, microvesicles (MV), shedding vesicles, apoptosomes or microparticles. Based on their size and orgin, EVs are classified as exosome, microvesiles (MVs) and apoptoic bodies. In this study, the formation of MVs and its ability in carrying DNA has been investigated in human red blood cells (RBCs). Under storage condition, the release of MVs in human RBCs have been observed. In addition, under the stimulation conditions by A23187, LPA or PMA the formation and release of MVs has been also investigated. The characteristics of MVs released from human RBCs under storage or stimulating conditions were characterized. By using differential centrifugation and ultracentrifuge method, two populations of MVs were obtained. Data analysis by nanosizer showed that the size of the populations of MVs were 205,8 ± 51,4 nm and 125,6 ± 31,4 nm. The morphology of MVs were also observed by SEM. The interaction of MVs with DNA was carried out by using heatshock and electroporation. The results indicated that heatshock has shown no effect on the intereaction between MVs and DNA. However, in the presence of Ca2+ and under electroporation, the intereaction of MVs and DNA has been clearly observed. The results suggested that MVs are able to used as material for DNA transfer. Research Objectives: MV can be formed in almost all cells, including red blood cells. In principle, matural human have no nucleus or genetic material. In addition, RBCs present at very large number in blood and do not require cell culture. Moreover, RBCs can contact with cells type in the body. The previous study showed that MVs released from stimulated cells, especially cancer cells can carry genetic material, protein and signal molecules xi and transfer them to other cell types. Therefore, MVs released from RBCs can be used as a vehicle for DNA transfer into target cells. Materials and Methods In this study, MV is obtained from human red blood cells by increase storage time or stimulating by 4-bromo-A23187, lysophosphatidic acid (LPA), or phorbol-12 Myristate-13 acetate (PMA) in the presence of 2 mM extracellular Ca2+. Under stimulating condition, RBCs have changed their volume, morphology and released MVs. In stimulated red blood cells, exposure of phosphatidylserine coupled with the formation of MVs were observed by using annexin V-FITC. The shedding of MVs was also observed in the case of PMA treatment under the transmitted bright field illumination. By using nanosizer and SEM analysis, the shape and characteristics (size and zeta potential) of MVs were clarified. Heatshock and electroporation were used to investigate the interaction of MVs with DNA. Main findings and conclusions Under storage condition, RBCs began to release MVs from the 14th day at 4C. Treatment of RBCs with LPA, PMA or A23187 in the presence of 2mM Ca2+ led to the exposure of PS on the outer cell membrane leaflet and the release of MVs. The size of released MVs varied from 100 to 1000 nm. By differential centrifugation, two populations of MVs were separated with size of 205.8 ± 51.4 nm and 125.6 ± 31.4 nm. Electroporation is a suitable method for stimulating the intereaction of MVs with DNA and it can be used for DNA transfer expriments. MVs can be used as a new vehicle for carrying DNA and for DNA transfer into different cell types. xii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngày nay, để chuyển gene và protein vào tế bào động vật, người ta thường thông qua hai phương pháp làlyposome (lipofectin), virus và DEAE-dextran. Các kỹ thuật này có hiệu quả khá cao với nhiều loại tế bào. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định, chẳng hạn lipofectin cho hiệu quả cao nhưng khả biểu hiện của gen chuyển thường không ổn định hoặc gây đáp ứng miễn dịch. Còn chuyển gen thông qua virus có hiệu quả cao tuy nhiên khả năng kiểm soát tương đối khó khăn. Kĩ thuật DEAE-dextran chỉ áp dụng được với một số loại tế bào và nhìn chung hiệu quả còn thấp. Cho đến nay, các vấn đề hiệu quả chuyển gene còn thấp, không ổn định, gây đáp ứng miễn dịch và độc với tế bào luôn là vấn đề được quan tâm khi chuyển gen vào tế bào động vật. Chính vì vậy các nghiên cứu để tìm ra các phương pháp chuyển gen mới đang được tiến hành nhằm khắc phục các hạn chế trên. Đề tài nghiên cứu sử dụng vi thể, là một thành phần được tạo ra từ tế bào trong một số điều kiện cảm ứng, nhằm khảo sát và đánh giá khả năng mang DNA của vi thể từ đó phát triển kỹ thuật chuyển gen mới. 1.2. GIẢ THUYẾT KHOA HỌC Vi thể (microvesicle/MVs) có nguồn gốc từ màng tế bào, có kích thước từ 100 nm-1 µm, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau (Anderson et al., 2005,). Nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy, vi thể đóng một vai trò trong giao bào và có thể vận chuyển mRNA, miRNA, và protein giữa các tế bào. Ngoài ra, trong điều kiện in vivo, vi thể có thể mang các phân tử như protein, nucleic acid bao gồm DNA, mRNA và miRNA đến tế bào đích thông qua cơ chế dung hợp màng (EL Andaloussi et al., 2013; Lee et al., 2011; Van Doormaal et al., 2009; Yuan et al., 2009). Vì tế bào hồng cầu chiếm số lượng rất lớn, có khả năng vận chuyển đi khắp các mô và tế bào trong cơ thể và dễ dàng thu nhận do không phải nuôi cấy, vì vậy các vi thể có nguồn gốc từ tế bào hồng cầu người có thể được dùng để mang axit nucleic và chuyển gene. Để nghiên cứu khả năng mang DNA và chuyển gene của vi thể từ tế bào hồng cầu cần xác định được các điều kiện để tạo thành các vi thể. Trên cơ sở này, đề tài: “Nghiên cứu thu nhận vi thể và đánh giá 1 khả năng mang DNA của vi thể từ tế bào hồng cầu người” nhằm xác định điều kiện hình thành vi thể, thu nhận vi thể và đánh giá khả năng mang DNA của vi thể nhằm phát triển quy trình chuyển gen nhờ vi thể. 1.3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3.1. Mục tiêu chung: Nghiên cứu nhằm xác định điều kiện cảm ứng, thu nhận vi thể và đánh giá khả năng mang DNA của vi thể từ tế bào hồng cầu người để phát triển vật liệu sinh học mới có khả năng mang DNA để chuyển gene. 1.3.2. Mục tiêu cụ thể: i.Cảm ứng tế bào hồng cầu và quá trình thu nhận vi thể - Cảm ứng hình thành và phát triển của vi thể - Quá trính kích thích tế bào hồng cầu và thu nhận vi thể ii. Phân tích các đặc điểm của vi thể - Xác định kích thước (Nanosizer) - Xác định hình dạng (SEM) - Xác định điện tích Nanosizer (Zeta-protetial) iii.Xây dựng quy trình thu nhận vi thể iv.Nghiên cứu khả năng dung hợp với DNA –plasmid với vi thể - Phương pháp xung điện - Phương pháp sốc nhiệt 1.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.4.1. Đối tượng nghiên cứu - Tế bào hồng cầu người - Vi thể tách chiết từ tế bào hồng cầu người. - DNA từ vi khuẩn plasmid 1.4.2. Phạm vi nghiên cứu 1.4.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu - Đề tài tiến hành từ tháng 10/2015 – 8/2016. - Phòng thí nghiệm – Bộ môn SHPT và CNSH Ứng dụng – Khoa Công nghệ Sinh Học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 2 1.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đây là đề tài mới về nghiên cứu quá trình ảnh hưởng của thời gian và các chất cảm ứng lên sự hình thành vi thể từ tế bào hồng cầu người. Đề tài nhằm xây dựng quy trình thu nhận vi thể cụ thể và đánh giá khả năng mang DNA plasmid của vi thể từ tế bào hồng cầu người. Từ những nghiên cứu này, việc xác định được khoảng thời gian và sự kích thích của các chất cảm ứng lên sự hình thành vi thể góp phần giải thích các cơ chế dẫn đến sự hình thành vi thể ở hồng cầu người cũng như ở tất cả các tế bào khác trong các điều kiện sinh lí cũng như bệnh lí. Dựa trên những kết quả thu được, các vi thể được giải phóng trên tế bào hồng cầu đã được xác định hình dạng, đặc điểm và điện tích để sử dụng làm công cụ vận chuyển protein, DNA và các chất đến tế bào đích, góp phần xác định các trình trạng bệnh lí ở người để chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ VI THỂ 2.2.1. Giới thiệu về vi thể Các thành phần tiết có nguồn gốc từ tế bào còn gọi là extracellular vesicles (EVs). Nhiều thuật ngữ khác nhau của Evs cho đến nay đã được sử dụng và đôi khi có sự nhầm lẫn bao gồm exosomes, microvesicles (MV), shedding vesicles, apoptosomes hoặc thể apoptosis (apoptosis bodies) (Holme et al., 2011; Tramset al., 1981). Dựa vào nguồn gốc và kích thước mà EVs chia thành 3 loại: exosome, vi thể (microvesicle/MV) và apotosis bodies (Akerset al., 2013). Exosomes là các túi màng kín nhỏ kích thước đồng đều gần 30-100 nm đã được mô tả bởi Johnstone trong nuôi cấy in vitro của hồng cầu lưới cừu. Họ cũng quan sát thấy được trong một loạt các tế bào nuôi cấy như tế bào lympho, tế bào đuôi gai, tế bào T gây độc tế bào, tế bào mast, tế bào thần kinh, tế bào ít nhánh, các tế bào Schwann, và các tế bào biểu mô ruột. (Simons et al., 2009; Thery et al., 2001). Trong các tế bào này, exosomes có nguồn gốc từ mạng lưới nội mô nằm trong túi lớn trong tế bào chất. Việc hình thành của exosomes với môi trường ngoại bào được thực hiện bởi sự hợp nhất của các túi vào màng plasma (Raposo et al., 2013; Simons et al., 2009; Thery et al., 2009). Apoptosis là một dạng cấu trúc có kích thước lớn có kích thước lớn hơn 1000 nm, được tách ra khỏi tế bào đang trong giai đoạn chết lập trình (apoptosis). Apoptosis được xem như một phần của các quá trình sinh học như thay thế tế bào bình thường, các hoạt động của hệ thống miễn dịch, sự phát triển của phôi thai. Các thể apotosis có thể được xem như là các mảnh tế bào chết lớn được bao bọc bởi màng tế bào (Comelli et al., 2014). Khác biệt với exosome và apoptosis, vi thể (MV) được phát sinh thông qua các chồi bên ngoài trực tiếp và tách ra khỏi màng plasma sau khi tế bào được hoạt hóa (Inal et al., 2013). Thông thường, MV có kích thước (từ 50 đến 1000 nm) lớn hơn so với exosomes (Hess et al., 1999; Inal et al., 2013). Tuy nhiên, việc phân loại dựa vào kích thước vẫn còn nhiều tranh cãi, do đó nguồn gốc phát sinh được sử dụng làm tiêu chí để phân biệt các MV và exosomes (Allan et al., 1989; Allan et al., 1980;Nguyen et al., 2016). Sự hình thành và phát sinh MV là kết quả của quá trình phân giải của các protein trong bộ khung nâng đỡ tế bào và sự thay đổi phân bố lại các thành phần phospholipid màng (Holme et al., 1994). 4 Ngoài ra, nhiềuu công trình nghiên ccứu cho thấy vi thể có mặt m ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể ngư người như: nước tiểu, huyết tương, sữa, a, dịch d não tủy, nước bọt, dịch khớp, tiểuu huy huyết cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầuu trung tính, tính các tế bào khốii u và nhau thai. Trong hhệ tuần hoàn, phần lớn MV có nguồồn gốc từ tiểu cầu, phần ít hơn có nguồnn ggốc từ các tế bào máu khác, mức độ MV từ t hồng cầu tăng lên trong quá trình củaa m một số bệnh lý như bệnh sốt rét và bệnh nh tế t bào hình liềm (Barteneva et al.,., 2013). Đ Đối với tế bào hồng cầu, những tế bào chưa trưởng thành tiếtt ra exosome trong khi đó ttế bào trưởng thành tiếtt ra các microvesicle (Lee et al., 2011; Dee Vooght et al., 2013). Sự giảii phóng vi thể th từ tế bào hồng cầu người cũng đã đượ ợc phát hiện và đượcc cho là có liên quan tới t sự hình thành các cụcc máu đông và ssự loại bỏ các tế bào đang ở trạng ng thái apoptosis bởi b đại thực bào (Antwi-Baffour Baffour et al., 2010; Nguyen et al.,., 2011). Tuy nhiên, cơ chế ch hình thành và giảii phóng MV ttừ tế bào hồng cầu cũng như ư vai trò tr của chúng vẫn chưa được làm sáng tỏỏ. Hình 2.1. .1. Các d dạng cấu trúc màng được tiết ra từ ừ tế bào Ghi chú: Các EV bao ggồm exosome; thể apotosis và vi thể MVs (Gyorgy et al., 2011) 2.2.2. Đặc điểm củaa vi th thể Vi thể có cấuu trúc ddạng hình cầu được hình thành từ màng plasma có chứa 5 thành phần protein màng (Hình. 2.2). MVs có kích thước lớn hơn exosomes, dao động từ 100 nm đến 1 µm (Gyorgy et al., 2011; Heijnen et al., 1999) (Bảng 2.1). Trong điều kiện kích thích hoặc cảm ứng MVs được hình thành từ bề mặt tế bào. Nhiều nghiên cứu cho thấy,MVs có chứa protein, RNA và microRNA (miRNA) (Camussi et al., 2010;Del Conde et al., 2005). Ngoài ra, MVs cũng có thể chứa integrins, các cytokine, chemokine, metalloproteinase và phosphatidylserine (PS) trên lớp màng ngoài (Al-Nedawi K et al., 2009; Dolo et al., 2005; Ginestra et al., 1998;Lee et al., 2011; Pizzirani et al., 2007; Schiera et al., 2007). Các MVđược tạo thành dosự phối hợp hoạt động của các protein, enzym như translocase aminophospholipid (flippase), scramblase, floppase, và calpain (Piccin et al., 2007;Shen et al., 2011). Hình 2.2. Con đường hình thành vi thể. Đối với các tế bào đang trải qua giai đoạn tự chết apoptosis, các MVs được hình thành ở trong giai đoạn đầu trước khi tế bào hình thành các thể apoptosis có kích thước lớn. 6 Bảng 2.1. Các loại tế bào hình thành từ Evs Exosomes MVs Thể apoptosis Kích thước (nm) 30-120 100-1000 ≥1000 Đặc điểm sinh học Hình thành bởi các cấu trúc màng bên trong tế bào. Hình thành từ màng tế bào. Hình thành bởi màng tế bào sau khi tế bào bị phân giải. Các cụm biệt hóa trên bề mặt Thành phần của các yếu tố bên trong Quá trình phụ thuộc vào kích hoạt khung tế bào và Ca2+. Quá trình phụ thuộc vào Ca2+, calpain và tổ chức lại bộ khung tế bào. Số lượng cụm biệt hóa (cluster of differencitation CD) hạn chế. Có các phospho lipid màng, protein màng, và các thụ thể. Thành phần PS trên bề mặt tế bào hạn chế Thành phần PS phân bố trên bề mặt ngoài. Protein, lipid, mRNA và microRNA, hiếm khi chứa DNA Protein, lipid, mRNA và microRNA, hiếm khi chứa DNA Có PS ở trên bề mặt ngoài và thụ thể Mảnh DNA bị đứt gãy Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3854311/ 2.2.3. Vi thể và khả năng tương tác giữa các tế bào Cơ chế tương tác của các vi thểvới các tế bào bề mặt tế bào cụ thể vẫn chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên gần đây các minh chứng cho thấy vi thể đóng vai trò trong việc truyền tín hiệu đến một số tế bào đích thông qua tương tác và dung hợp màng. Sự tương tác giữa vi thể và các tế bào nhân chuẩn đã được nghiên cứu ở một số tế bào bị nhiễm vi khuẩn và virus (Parker et al., 2010; Chatterjee và Chaudhuri, 2011; Elmi et al., 2012; Rompikuntal et al., 2012;Bielaszewska et al., 2013 ). Các nghiên cứu cũng cho thấy vai trò của các protein của vi thể tham gia vào quá trình tương tác tế bào (Kesty et al., 2004; Bauman et al., Kuehn, 2009; Parker et al., 2010 ) những nghiên cứu này cho thấy có thể ứng dụng vi thể làm công cụ để vận chuyển thuốc đến tế bào (Gujrati et al., 2014 ). 7