Tài liệu Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ lactobacillus fermentum.

FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HUẾ - NĂM 2019 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy HUẾ - NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh Trần Thị Ái Luyến i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt BMM C CFU/mL COSY DMSO DPPH EPS EPS-TC13 EPS-TC16 EPS-TC21 EPS-MC3 EtOH FDA Fruc FTF HePS HMBC HoPS HPLC HSQC Gal GalNAc GalT GC-MS GDP Glc Glc-1-P Glc-6-P GlcNAc Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt basal minimum medium Môi trường tối ưu cơ bản Carbon Cacbon colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL Correlated Spectroscopy Dimethyl sulfoxide 1, 1-diphenyl-2picrylhydrazyl Exopolysaccharide Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC13 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC16 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum TC21 Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 Ethanol Cồn etylic Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ Fructose fructosyltransferase heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp Heteronuclear multiple - Bond Correlation homopolysaccharide Polysaccharide thuần High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence galactose N-acetyl-D-galactosamine galactose 1-phosphateuridyltransferase Gas Chromatrography Mass Sắc ký khí ghép khối phổ Spectometry guanosine diphosphate glucose glucose-6-phosphate glucose-1-phosphate N-acetyl-D-glucosamine ii GlcA GRAS GTF La. LAB Lac Lb. Leu. Man-6-P Man-1-P MeOH MRS MTTH N NDP NMR NOESY P. PEP-PTS PGM PMM PS Rha S. Suc TCA TDP TFA TGP TMS UDP WPC glucuronic acid Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn glycosyltransferase Lactococcus Lactic Acid bacteria Vi khuẩn lactic Lactose Lactobacillus Leuconostoc Mannose-6-Phosphate Mannose-1-Phosphate Methanol Man Rogosa Sharpe Môi trường thích hợp Nitrogen Nitơ diphosphate nucleoside Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Pediococcus phosphoenolpyruvatephosphotransferase phosphoglucomutase phosphomannomutase Polysaccharide Rhamnose Streptococcus Sucrose trichloroacetic acid tyrosine diphosphate Trifluoroacetic acid TDP-glucose pyrophosphorylase Tetramethylsilan Uridine diphosphate whey protein concentration iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... vii CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 1.1. Tổng quan về polysaccharide ...........................................................................3 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide ..........................................................3 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ...................................................................4 1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum ...........................................................5 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic ........................................6 1.3.1. Khái niệm ..................................................................................................6 1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa ..........................................6 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng ...........................................................14 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB ....................................20 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS .......................................................20 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS ..................................................23 1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc .. ...........................................................................................................................24 1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe ................................34 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 37 3.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................37 3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .......................................................................37 2.2.1. Hóa chất ...................................................................................................37 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................37 3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................38 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD)...................................................................................................38 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ........................................38 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ........................................................39 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum ................................................................40 2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] ........43 2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ........44 iv 2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm .................................................................................................45 2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS ...........................................................................................................................47 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN......................................... 52 3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum ..............................................................................................................52 3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao . ...........................................................................................................................52 3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ...................................54 3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3........................................66 3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ............................82 3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước ..................................................................89 3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu ..................................................91 3.2.3. Khả năng chống oxy hóa .........................................................................95 3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 ...........................................................99 3.3.1. Khối lượng phân tử .................................................................................99 3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 .....................................................103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 128 1. Kết luận ...........................................................................................................128 2. Kiến nghị .........................................................................................................130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ ................................................................................................................................................. 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 133 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các loài Lactobacillus đã được công bố ..........................................................................22 Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng ...................27 Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố .............................................................................................................29 Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố ...........................................................................................35 Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS ..........50 Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án .......................................................................................................................81 Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb. fermentum trong luận án............................................................................................89 Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum .................90 Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ................92 Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum .........................93 Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) ....................................................................96 Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 ......................................................................................................103 Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 ...................................................................................103 Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3...................110 Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO .....................................................................................................................118 Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC .................................................................................................................................119 Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án ....................................................................123 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (b) của fructose ............................................................................................................3 Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum ..........................................................5 Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS ..............7 Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan ..............................7 Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB .....9 Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ............10 Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ...........................11 Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDPglactose ......................................................................................................................12 Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB ...................................................................................................................................14 Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB ....15 Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối ...........................................................38 Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS .....................................................................39 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS ...................40 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm .......................................................................................45 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside ...................................................................................................................................48 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS ........................................49 Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic ..............53 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum .................55 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum .............................................61 Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ............................................................................66 Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ...........................................................................................................69 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum .................................................................................................72 vii Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum .................................................................................................77 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 .............................................83 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 .............................................83 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 .............................................83 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 ..............................................84 Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS ...................................................................................................................................87 Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS .......88 Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel ...........................................................................................................100 Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR ...................................................111 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ...............................................................112 Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 ..............................................................113 Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 .......................................................116 Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ...............................................................117 Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 .............................................................118 Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ............................................................119 Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần .........................................................................................................................120 viii MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình 1 lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được: 1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; 2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; 3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về polysaccharide 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật),... [29]. Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan. Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngoài ra, vòng 5 cạnh (furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật. b) a) Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (a) (b) (b) của fructose [29] 3 Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67]. 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,… Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67]. Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114]. Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film, tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất 4 chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography (HPLC)) [67], [114]. Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS. 1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose... Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …), các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). Lb. fermentum có thể tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a). Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b). Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không di động [143]. b) a) Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143] 5 Từ lâu, Lb. fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132]. Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên và an toàn. Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều hơn. Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB thuộc loài Lb. fermentum. 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.3.1. Khái niệm Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào hoặc ngoại bào. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của chúng [87]. 1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa 6 Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115]. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào. Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme [69], [90]. - Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS) b) a) Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13] HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như Dglc hoặc D-fruc (Hình 1.3). Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.), Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS. Phần ngoại bào Màng plasmid Tế bào chất Chất xúc tác Tín hiệu xuất Glc Fruc Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13] 7 Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase (FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ tín hiệu xuất. Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59]. Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS. Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên các PS [27]. Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh, độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106]. Tùy vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5) [13], [92], [106]. Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các monome là các phân tử glc và fruc. Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28]. 8 HoPS 10 – 106 Da 5 Fructosyltransferase Fructan: liên kết β - Lb. panis - Lb. pontis - Lb. frumenti Glucansucrase Glucan Các liên kết α Inulin: liên kết β(1,2) Mạch thẳng hoặc phân nhánh - Lb. reuteri Levan: liên kết β-(2,6) Mạch thẳng - Lb. reuteri 121 - Lb. sanfranciscensis Dextran α-(1,6) - Lb. fermentum - Lb. sakei - Lb. parabuchneri - Lb. hilgardii Mutan α-(1,3) - Lb. reuteri ML1 Các liên kết β - Lb. suebicus - Lb. G77 Reuteran α-(1,4) - Lb. reuteri 121 - Lb. reuteri ATCC 55730 Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13] 9 - Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS) Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6). Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13] Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp. lactis, La. lactis subsp. cremoris, Lb. casei, Lb. sake, Lb. rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa nhiệt (Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus và S. thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27] [29]. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7). Đó là một chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và (c) quá trình tổng hợp PS [59], [66]. (1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a) Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất. Sau khi vào trong tế bào, hầu hết các nguồn C đều được chuyển thành glc. Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp lại. Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động. Các hệ thống tham gia vào quá trình vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS) của LAB [98]. (2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường. 10