Tài liệu Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành (glycine max)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -------------------- PHẠM KIM NGÂN NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME CHITINASE TỪ VỎ HẠT ĐẬU NÀNH (GLYCINE MAX) Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60 54 02 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2014 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Trần Bích Lam Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS Đồng Thị Thanh Thu Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Phan Thế Đồng Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 13 tháng 01 năm 2015. Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1. PGS. TS Lê Văn Việt Mẫn Chủ tịch 2. PGS. TS Đồng Thị Thanh Thu Phản biện 1 3. TS. Phan Thế Đồng Phản biện 2 4. TS. Võ Thị Bạch Huệ Ủy viên 5. TS. Trần Thị Ngọc Yên Ủy viên, Thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ------------------------ ----------------------------------- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phạm Kim Ngân MSHV: 12110204 Ngày sinh: 18/11/1988 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 605402 I. Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME CHITINASE TỪ VỎ HẠT ĐẬU NÀNH (GLYCINE MAX) II. Nhiệm vụ và nội dung Nhiệm vụ Khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành; tạo chế phẩm enzyme thô và xác định các thông số tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme. Nội dung nghiên cứu: - Xác định phương pháp chuẩn bị nguyên liệu để trích ly chitinase; - Xác định các thông số của quá trình trích ly; - Xác định các tác nhân kết tủa và cô đặc enzyme; - Tạo chế phẩm và xác định các tính chất của enzyme. III. Ngày giao nhiệm vụ: 20/01/2014 IV. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 20/06/2014 V. Cán bộ hướng dẫn: TS. Trần Bích Lam Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 01 năm 2015 Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm bộ môn Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học                   LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô TS. Trần Bích Lam, người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, những người đã nuôi dưỡng, dạy bảo, luôn luôn bên cạnh, khuyên nhủ, động viên tôi. Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong học tập cũng như trong cuộc sống. Cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn những người bạn đã gắn bó, động viên và chia sẻ những khó khăn trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tại trường. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 01 năm 2015 Học viên Phạm Kim Ngân ii   TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong nghiên cứu này, chitinase được trích ly từ vỏ hạt đậu nành (Glycine max) chuẩn bị theo phương pháp ướt. Các thông số của quá trình trích ly được khảo sát nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để hoạt tính chitinase thu được là cao nhất. Kết quả chọn được đệm citrate pH 5.5, với tỷ lệ giữa khối lượng nguyên liệu và dung dịch đệm là 1:20 (w/v), thời gian trích ly 210 phút ở nhiệt độ 36oC. Để thu chế phẩm, đã khảo sát phương pháp kết tủa chitinase bằng các tác nhân acetone, ethanol và muối amonium sulfate với các tỷ lệ khác nhau; phương pháp cô đặc bằng siêu lọc qua màng có kích thước 25 kDa cũng được thực hiện. Kết quả, enzyme kết tủa bởi acetone với tỉ lệ giữa dịch trích ly và dung môi là 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi (74.567%) và độ tinh sạch (1.560 lần) cao nhất. Chitinase sau kết tủa được sấy đông khô trong 24h, chế phẩm thu được có hoạt tính 12.552 U/mg. Nghiên cứu tính chất của enzyme cho thấy chitinase thu được từ vỏ hạt đậu nành có nhiệt độ xúc tác tối ưu là 40oC; pH tối ưu là 6.0; bị ức chế bởi các ion Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+ và hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+. Các hằng số Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù là 0.435 g/L và 6.410 g/L.phút, tương ứng. iii   ABSTRACT In this study, chitinase was extracted from soybean seed coats (Glycine max), prepared by the wet method. The parameters of the extraction process were examined in order to find optimal conditions that chitinase activity was the highest. The results showed that pH of citrate buffer solution at 5.5, ratio of material to buffer (w/v) at 1:20, extraction time at 210 minutes and extraction temperature at 36oC were appropriate parameters for chitinase extraction. To obtain crude enzyme, acetone, ethanol and ammonium sulfate were tested; enzyme was also concentrated by ultrafiltration (25 kDa membrane). As a result, using acetone (ratio of extracted solution to solvent at 1:4) for enzyme precipitation provided better results than using other methods. Yield and purification fold of chitinase after precipitating by this method were 74.567% and 1.560 times. After precipitating, enzyme was dried for 24 hours by freeze dryer, chitinase activity of obtained preparation was 12.552 U/mg. Some properties of chitinase were determined: optimum pH was at 6.0, optimum temperature was at 40oC and Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+ were chitinase inhibitors; Mn2+, Cu2+ increased chitinase activity. The Km and Vmax values of chitinase on colloidal chitin were 0.435 g/L and 6.410 g/L.min, respectively. iv   LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu. Tác giả luận văn Phạm Kim Ngân     v   MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................................ii ABSTRACT .............................................................................................................. iii LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... iv MỤC LỤC ................................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ix DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... x MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1 Tổng quan về đậu nành ...................................................................................... 3 1.1.1 Đặc điểm của hạt đậu nành ......................................................................... 3 1.1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu nành ........................................................ 5 1.2 Chitin ................................................................................................................. 6 1.2.1 Cấu trúc phân tử .......................................................................................... 7 1.2.2 Tính chất của chitin ..................................................................................... 8 1.2.3 Ứng dụng của chitin .................................................................................... 8 1.3 Enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) ........................................................................ 9 1.3.1 Định nghĩa ................................................................................................... 9 1.3.2 Cấu trúc, phân loại....................................................................................... 9 1.3.2.1 Cấu trúc ................................................................................................. 9 1.3.2.2 Phân loại..............................................................................................10 1.3.3 Cơ chế tác động của enzyme chitinase ......................................................12 1.3.4 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase ...........................................13 1.3.4.1 Trọng lượng phân tử ...........................................................................13 1.3.4.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis ....................................................14 1.3.4.3 Nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme ...............................................14 1.3.4.4 Chất ức chế..........................................................................................14 vi   1.3.5 Nguồn thu nhận .........................................................................................15 1.4 Vai trò của chitinase trong phản ứng phòng vệ thực vật .................................16 1.5 Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein enzyme .......................18 1.5.1 Phá vỡ tế bào .............................................................................................18 1.5.2 Ổn định protein trong dịch chiết thô .........................................................18 1.5.3 Phân riêng protein enzyme ........................................................................18 1.5.4 Tinh sạch enzyme ......................................................................................22 1.6 Ứng dụng của enzyme chitinase ......................................................................23 1.6.1 Trong nông nghiệp ....................................................................................23 1.6.2 Trong y học ...............................................................................................23 1.6.3 Kiểm soát muỗi .........................................................................................24 1.6.4 Sản xuất protein đơn bào ...........................................................................24 1.6.5 Các ứng dụng khác ....................................................................................24 1.7 Các nghiên cứu về enzyme chitinase trên thực vật..........................................25 1.7.1 Các nghiên cứu trên hạt đậu nành .............................................................25 1.7.2 Các nghiên cứu trên một số thực vật khác ................................................25 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 28 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng .......................................................28 2.1.1 Nguyên liệu ...............................................................................................28 2.2.2 Hóa chất .....................................................................................................28 2.2.3 Dụng cụ - Thiết bị .....................................................................................28 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu.............................................................28 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................28 2.2.2 Quy trình thu nhận enzyme chitinase ........................................................30 2.2.2 Phương pháp thực hiện .............................................................................31 2.2.2.1 Khảo sát phương pháp xử lí nguyên liệu ............................................31 2.2.2.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme .....................................................31 2.2.2.3 Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme .........................................32 2.2.2.4 Sấy đông khô.......................................................................................34 2.2.2.5 Khảo sát các tính chất của enzyme .....................................................34 vii   2.4 Phương pháp phân tích ....................................................................................35 2.4.3. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry ..............35 2.4.3.1 Nguyên tắc ..........................................................................................35 2.4.3.2 Hóa chất ..............................................................................................35 2.4.3.3 Tiến hành ............................................................................................36 2.4.4 Xác định hoạt tính chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS ....................................................................................................37 2.4.4.1.Nguyên tắc ..........................................................................................37 2.4.4.2 Định nghĩa đơn vị hoạt tính chitinase: ................................................37 2.4.4.3 Hoá chất ..............................................................................................37 2.4.4.4 Xác định hoạt tính chitinase ................................................................38 2.5 Phân tích số liệu ...............................................................................................39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 40 3.1 Khảo sát hoạt tính enzyme ở các bộ phận khác nhau của nguyên liệu............40 3.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme chitinase ...................................................42 3.2.1 Ảnh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích ly enzyme ....................42 3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch đệm đến trích ly enzyme................................................................................................................44 3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến trích ly enzyme ..........................................46 3.2.5 Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme từ vỏ đậu nành bằng phương pháp 49 quy hoạch thực nghiệm ......................................................................................49 3.3. Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme .....................................................54 3.3.1 Kết tủa enzyme bằng acetone ....................................................................54 3.3.2 Kết tủa enzyme bằng ethanol ....................................................................56 3.3.3 Kết tủa enzyme bằng amonium sulfate .....................................................57 3.3.3.1 Trước khi thẩm tích.............................................................................57 3.3.3.2 Sau khi thẩm tích ................................................................................59 3.3.4 Cô đặc enzyme bằng siêu lọc ....................................................................59 3.3.5 Chọn phương pháp kết tủa enzyme ...........................................................61 3.4. Kết quả sấy đông khô .....................................................................................62 viii   3.5. Tính chất enzyme ............................................................................................63 3.5.1 Nhiệt độ tối ưu ...........................................................................................63 3.5.2 pH tối ưu ....................................................................................................64 3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme ............................65 3.5.4 Xác định động học enzyme .......................................................................67 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 69 4.1 Kết luận ............................................................................................................ 69 4.2 Kiến nghị.......................................................................................................... 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 71 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 79 ix   DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần chính trong vỏ hạt đậu nành (trên 100g) ................................ 4  Bảng 1.2: Thành phần hóa học của hạt đậu nành........................................................ 6  Bảng 2.1: Các thông số của thiết bị và đặc tính kỹ thuật của màng sử dụng........... 33  Bảng 3.1: Các yếu tố ảnh hưởng với các giới hạn và miền khảo sát ........................ 50  Bảng 3.2: Ma trận và kết quả quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly enzyme .... 51  Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hoạt tính enzyme chitinase ............ 52  Bảng 3.4: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa......... 59  bằng muối amonium sulfate và sau khi thẩm tích..................................................... 59  Bảng 3.5: Hiệu suất thu hồi enzyme, protein và độ tinh sạch ................................... 60  enzyme chitinase sau khi cô đặc bằng siêu lọc ......................................................... 60  Bảng 3.6: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme ............................. 62  thu nhận bằng các phương pháp khác nhau .............................................................. 62  Bảng 3.7: Hoạt tính enzyme và hàm lượng protein qua các giai đoạn ..................... 63  Bảng 3.8: Tính chất enzyme chitinase từ một số nguồn thu nhận khác nhau ........... 66  Bảng 3.9: Các thông số xác định động học enzyme ................................................. 67  x   DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hạt đậu nành ............................................................................................... 3  Hình 1.2: Cấu trúc của vỏ hạt đậu nành ...................................................................... 5  Hình 1.3: Cấu trúc của chitin ...................................................................................... 7  Hình 1.4: Trình tự sắp xếp các chuỗi của α, β, γ – chitin .......................................... 7  Hình 1.5: Vị trí phân cắt của enzym chitinase ............................................................ 9  Hình 1.6: Cấu trúc chitinase của Saccharomyces cerevisiae (a) và ChiA1 của Bacillus circulans (b) ................................................................................................ 10  Hình 1.7: Cơ chế tác động của enzyme chitinase ..................................................... 12  Hình 1.8: Cơ chế thủy phân tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase ............... 13  Hình 1.9: Trình tự axit amin của protein chitinase ................................................... 25  Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 29  Hình 2.2: Quy trình thu nhận enzyme chitinase........................................................ 30  Hình 3.1: Hoạt tính enzyme chitinase của hạt đậu nành ở các bộ phận khác nhau và phương pháp thu nhận khác nhau. ............................................................................ 40  Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích ly enzyme chitinase .... 43  Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch đệm đến trích ly enzyme ...................................................................................................................... 45  Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến quá trình trích ly enzyme .............. 47  Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly enzyme ............................ 49  Hình 3.6: Đồ thị đáp ứng bề mặt hoạt tính enzyme theo phương trình hồi quy trên không gian ba chiều (a) và hai chiều (b) ................................................................... 53  Hình 3.7: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa bằng dung môi acetone ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................... 55  Hình 3.8: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa bằng dung môi ethanol ở các tỷ lệ khác nhau .................................................................... 57  Hình 3.9: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa bằng muối amonium sulfate ở các % độ bão hòa khác nhau ............................................. 58  xi   Hình 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chitinase ........................ 64  Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chitinase ................................ 65  Hình 3.12: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitinase ................. 66  Hình 3.11: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme .. 67  Hình 3.12: Đồ thị Lineaweaver Burk thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme ....................................................................................................... 68  1   MỞ ĐẦU Đậu nành (Glycine max) là loại cây ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao, được trồng phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Sản phẩm của nó được sử dụng làm thực phẩm cho con người, thức ăn gia súc và nguyên liệu cho các ngành công nghiệp. Phế phẩm từ các ngành này, vỏ hạt, thường được loại bỏ, ít được tận thu. Nghiên cứu của Gijzen và cộng sự (2001) trên đậu nành cho thấy có sự hiện diện của enzyme chitinase nhóm I có trọng lượng phân tử 32 kDa trong vỏ hạt, có vai trò quan trọng trong phản ứng tự phòng vệ chống lại nấm bệnh và côn trùng gây hại, xuất hiện trong giai đoạn phát triển của hạt ở giai đoạn trưởng thành và chín. Ở các bộ phận khác như rễ, lá, phôi và trong mô nhiễm mầm bệnh của hạt cũng có sự hiện diện của chitinase; tuy nhiên hàm lượng enzyme đặc biệt cao ở vỏ hạt. Chitinase là enzyme thủy phân chitin, được tìm thấy ở hầu hết các loài sinh vật với chức năng khác nhau. Hiện nay, chitinase đang được nghiên cứu và có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất thuốc cho người, dùng chẩn đoán sớm các bệnh cơ hội do vi nấm gây ra, tiềm năng sử dụng trong nông nghiệp như một loại thuốc trừ sâu sinh học, sản xuất protein đơn bào và các ứng dụng quan trọng khác. Tuy nhiên, các chế phẩm enzyme chitinase hiện nay khá đắt nên việc ứng dụng còn hạn chế. Trên thế giới, các nghiên cứu về enzyme chitinase đã được thực hiện trên nhiều đối tượng khác nhau. Tuy nhiên, nghiên cứu trong nước về enzyme này chưa nhiều, chủ yếu tập trung trên đối tượng là vi sinh vật, đặc biệt là vi nấm và một vài nghiên cứu về chitinase trên mủ cao su, khoai lang, chưa có nghiên cứu nào về enzyme này trên vỏ hạt đậu nành. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành (Glycine max)”.   2   Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành; tạo chế phẩm enzyme thô và xác định các thông số tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme. Nội dung nghiên cứu: - Xác định phương pháp chuẩn bị nguyên liệu để trích ly chitinase; - Xác định các thông số của quá trình trích ly; - Xác định các tác nhân kết tủa và cô đặc enzyme; - Tạo chế phẩm và xác định các tính chất của enzyme.   3   CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về đậu nành Đậu nành thuộc chi Glycine, họ đậu Leguninosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae, có tên khoa học là Glycine max (L) Merr. là cây trồng cạn, ngắn ngày có nguồn gốc từ Đông Á. Thân cây mảnh, cao từ 0.8 đến 0.9m, có lông, cành hướng lên phía trên. Lá mọc cách, có 3 lá chét hình trái xoan, mũi lá gần nhọn không đều ở gốc. Hoa có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách cành. Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông màu vàng, thắt lại ở giữa (Trần Văn Điền, 2007). Trên thế giới, đậu nành là cây trồng lấy hạt quan trọng, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô; tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ (trên 70%) tiếp đến là châu Á. Trong nước, đậu nành cũng là cây trồng phổ biến, tập trung nhiều ở Đông Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long. 1.1.1 Đặc điểm của hạt đậu nành Hạt đậu nành có nhiều hình dạng và màu sắc khác nhau như: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt...; màu vàng, đỏ, xanh lục, nâu đen.... Trong đó, giống đậu nành màu vàng có giá trị thương phẩm cao. Kích thước của hạt cũng khác nhau tùy loại giống, trung bình có trọng lượng từ 150-300gram/1000 hạt. Hạt đậu nành gồm 3 bộ phận chính là: vỏ hạt, phôi và tử diệp (Trần Văn Điền, 2007). Chồi mầm Trụ trên lá mầm Tử diệp Trụ dưới lá mầm Rễ mầm Vỏ ngoài Rốn hạt Lỗ noãn   Hình 1.1: Hạt đậu nành   4   1.1.1.1 Vỏ hạt Vỏ hạt đậu nành chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng hạt với các thành phần được thể hiện ở bảng 1.1. Bảng 1.1: Thành phần chính trong vỏ hạt đậu nành (trên 100g) Thành phần Protein Số lượng Tham khảo 9g Liu, 1997 Fat (total lipid) 21.0 g Liu, 1997 Carbohydrates 21 g Liu, 1997 Fiber 65 g Cole et al., 1999 Isoflavones Trypsin inhibitors Phytic acid Saponins Isoflavones 90-600 µg 44 mg/g 0.12-0.50 g/100g 0 Phommalth et al., 2008 Sessa & Wolf, 2001 Lehrfeld, 1989; Sutardi & Buckle, 1985 Anderson & Wolf, 1995 0.11-0.20 mg/g Eldridge & Kwolek, 1983 Nguồn: Tổng hợp bởi O’Bryan và cộng sự (2014) Vỏ hạt có chức năng bảo vệ phôi và các thành phần bên trong, đảm bảo cho sự nẩy mầm của phôi, chúng gồm nhiều lớp tế bào, thể hiện ở hình 1.2. Ngoài cùng là lớp sáp không ngấm nước. Kế tiếp là lớp tế bào rào, macrosclereids, các tế nào này có vách dày, thon dài và vuông góc với bề mặt của hạt, đóng vai trò quan trọng cho sự cứng chắc của vỏ hạt. Bên trong lớp tế bào rào là lớp tế bào đồng hồ cát (hourglass), osteosclereids, lớp tế bào này lớn hơn các lớp tế bào lân cận, khoảng gian bào rộng. Các tế bào có không bào lớn và chứa nhiều loại protein đặc biệt là peroxidase (5% tổng protein hòa tan) (Gijzen và cộng sự, 1993). Cũng như các tế bào rào, vách tế bào đồng hồ cát cũng có vai trò trong tạo độ cứng chắc cho vỏ hạt. Tiếp giáp với lớp tế bào đồng hồ cát là nhu mô bên trong, hình thành bởi 6-8 lớp mỏng, các tế bào nhu mô được kéo dài, chúng phân bố đều khắp các vỏ hạt,   5   ngoại trừ ở rốn. Trong lớp hạt trưởng thành, khi phôi được mở rộng lớp nhu mô thường bị chèn ép (Miller và cộng sự, 1999). Ngay sau lớp nhu mô của vỏ hạt là lớp tế bào aleurone và lớp nhu mô của nội nhũ.   Hình 1.2: Cấu trúc của vỏ hạt đậu nành (Carlson và Lersten, 1987) cut: lớp cu-tin; pal (palisade): tế bào rào; hyp: các tế bào đồng hồ cát (hourglass) của hạ bì; int sp: khoảng gian bào; par: tế bào nhu mô; al: tế bào aleurone; par end: tế bào nhu mô của nội nhũ. 1.1.1.2 Phôi Phôi chiếm 2% trọng lượng hạt, chứa hai lá mầm, trụ trên lá mầm, trụ dưới lá mầm và rễ, có chức năng hấp thu dinh dưỡng và nẩy chồi. 1.1.1.3 Tử diệp Tử diệp chiếm 90% trọng lượng hạt, hình thẳng tới hình ovan, chứa lượng protein và lipid cao nhất trong toàn hạt, có thể ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất và lượng nước trong phôi. Tử diệp có chức năng dự trữ và cung cấp dinh dưỡng cho phôi. 1.1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu nành Đậu nành là loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu protein, glucid, lipid, muối khoáng và vitamin (Nguyễn Danh Đông, 1982; Ngô Thế Dân và cộng sự, 1999).