Tài liệu Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây neem azadirachta indica a. juss trồng ở ninh thuận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ Ý NHI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIMONOID CỦA LÁ CÂY NEEM AZADIRACHTA INDICA A. JUSS TRỒNG Ở NINH THUẬN LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Tp. Hồ Chí Minh-Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ Ý NHI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIMONOID CỦA LÁ CÂY NEEM AZADIRACHTA INDICA A. JUSS TRỒNG Ở NINH THUẬN Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01 Phản biện 1: GS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Phản biện 2: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẠNH Phản biện 3: PGS.TS. TRẦN HÙNG Phản biện độc lập 1: GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC Phản biện độc lập 2: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. TRẦN LÊ QUAN 2. GS. TS. TRẦN KIM QUI Tp. Hồ Chí Minh-Năm 2012 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHŨ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ***** LỜI CAM ĐOAN Luận án Tiến sĩ Khoa học Hóa học “Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây neem Azadirachta indica A. Juss trồng ở Ninh Thuận” do tôi thực hiện. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ý Nhi năm 2012 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến: - GS.TS. Trần Kim Qui, Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học trong nhiều năm qua. - PGS.TS. Trần Lê Quan đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn, Thầy luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này. - GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng đã quan tâm, động viên và dành thời gian sửa chữa, đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp cho tôi hoàn thành luận án này. - GS.TSKH. Nguyễn Công Hào, PGS.TS. Trần Công Luận đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho các chuyên đề tiến sĩ và luận án. - PGS.TS. Trần Hùng, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh, GS.TS. Nguyễn Minh Đức, PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận án. - TS. Tôn Thất Quang đã động viên, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện luận án này. - Tất cả quý Thầy Cô trong Bộ Môn Hóa Hữu Cơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án. - Phòng NMR thuộc Viện KHCN Hà Nội, Phòng Phân Tích Trung Tâm và phòng Hợp chất Thiên nhiên thuộc trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM - Phòng Sau Đại Học trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM - Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, luôn bên cạnh động viên, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án này. Nguyễn Thị Ý Nhi MỤC LỤC Trang CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. iii DANH MỤC HÌNH ẢNH................................................................................................ v DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................. viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ix MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. MÔ TẢ THỰC VẬT ............................................................................................... 2 1.2. VÙNG PHÂN BỐ .................................................................................................... 3 1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC A. INDICA .................................................................. 4 1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC ...................................................................................... 26 1.5. ENZYM α-GLUCOSIDASE ................................................................................. 30 1.6. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ................................................................................. 32 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY NEEM TẠI VIỆT NAM ................................. 37 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ....................................................... 40 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 42 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC .................................................................... 56 3.2.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 8...................................... 56 3.2.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 24.................................... 58 3.2.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 39.................................... 61 3.2.4. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 33.................................... 63 3.2.5. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 31.................................... 68 3.2.6. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 23.................................... 70 i 3.2.7. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 25.................................... 73 3.2.8. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 3...................................... 75 3.2.9. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 19.................................... 78 3.2.10. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 20.................................. 80 3.2.11. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 22 ................................. 83 3.2.12. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 5.................................... 88 3.2.13. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 1.................................... 90 3.2.14. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 17 ................................. 93 3.2.15. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 4.................................... 96 3.2.16. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 35 ................................. 98 3.2.17. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 14 ............................... 100 3.2.18. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 30 ............................... 102 3.2.19. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 28 ............................... 103 3.2.20. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 34 ............................... 108 3.2. NHẬN XÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM PHỔ NMR CỦA CÁC TRITERPEN THUỘC AZADIRACHTA INDICA.................................................................................... 111 3.3. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC ........................................ 119 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ...................................................................................... 124 KIẾN NGHỊ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................. 126 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ............................................................... 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 128 PHỤ LỤC ii CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN s : mũi đơn (singlet) br s : mũi đơn rộng (broad singlet) d : mũi đôi (doublet) dd : mũi đôi đôi (doublet – doublet) t : mũi ba (triplet) dt : mũi đôi ba (doublet of triplet) m : mũi đa (multiplet) J : hằng số ghép (coupling constant) SKC : sắc ký cột SKLM : sắc ký lớp mỏng RP-18 : Reversed Phase C-18 LC-MS : sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy) HR-ESI-MS : Khối phổ ion hóa bằng kỹ thuật phun điện phân giải cao (High Resolution-Electro Spray Ionization-Mass Spectrometry UV : Ultraviolet Spectroscopy NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HSQC : tương quan giữa H-C qua một nối (Heteronuclear Single Quantum Coherence) HMBC : tương quan giữa H-C qua 2,3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) H-H COSY : tương quan giữa H-H (H-H COrrelation SpectroscopY) NOESY : Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer iii DMSO : DiMetyl SulfOxid TMS : TetraMetylSilan Ac : Acetyl Bz : Benzoyl Cin : Cinnamoyl Me : Metyl Meth : Methacryloyl Sen : Senecioyl Tig : Tigloyl M : khối lượng phân tử [α]D : Năng lực triền quang (Specific Optical Rotation) Mp : Nhiệt độ nóng chảy (Melting point) IC50 : Nồng độ ức chế 50% (50% Inhibitory Concentration) iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Azadirachta indica A. Juss 2 Hình 1.2. Dạng khung sườn euphol và tirucallol 5 Hình 1.3. Các protolimonoid (1-8) và apo-protolimonoid (9-11) 9 Hình 1.4. Mononortriterpenoid 10 Hình 1.5. Dinortriterpenoid 10 Hình 1.6. Trinortriterpenoid 11 Hình 1.7. Các limonoid với nhánh là vòng furan 13 Hình 1.8. Các limonoid với nhánh là vòng furan hoặc vòng hemiacetal, Hình 1.9. tetrahydrofuran (tiếp theo). 14 Các limonoid với nhánh là vòng furan và có vòng D lactone 16 Hình 1.10. Limonoid với vòng -hydroxybutenolid 17 Hình 1.11. Limonoid mở vòng C 21 Hình 1.12. Các limonoid mở vòng C với nhánh -hydroxybutenolid 22 Hình 1.13. Limonoid mở vòng C với nhánh -hydroxybutenolid 24 Hình 1.14. Một số pentanortriterpenoid 24 Hình 1.15. Một số hexanortriterpenoid 25 Hình 1.16. Một số octanortriterpenoid 25 Hình 1.17. Một số nonanortriterpenoid 26 Hình 1.18. Phân loại bệnh đái tháo đường 36 Hình 1.19. Cấu trúc phân tử các hoạt chất trong các thuốc trị đái tháo đường 36 Hình 3.1. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 8 56 Hình 3.2. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 24 59 Hình 3.3. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 39 62 Hình 3.4. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 39 63 Hình 3.5. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 33 65 Hình 3.6. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 33 65 Hình 3.7. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 31 69 v Hình 3.8. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 31 70 Hình 3.9. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 23 71 Hình 3.10. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 25 74 Hình 3.11. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 25 74 Hình 3.12. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 3 77 Hình 3.13. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 3 77 Hình 3.14. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 19 79 Hình 3.15. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 19 80 Hình 3.16. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 20 82 Hình 3.17. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 20 83 Hình 3.18. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 22 85 Hình 3.19. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 22 85 Hình 3.20. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 5 89 Hình 3.21. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 1 92 Hình 3.22. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 1 92 Hình 3.23. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 17 94 Hình 3.24. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 17 95 Hình 3.25. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 4 98 Hình 3.26. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 35 99 Hình 3.27. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 35 100 Hình 3.28. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 14 101 Hình 3.29. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 30 104 Hình 3.30. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 30 105 Hình 3.31. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 28 106 Hình 3.32. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 28 106 Hình 3.33. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 34 109 Hình 3.34. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 34 110 Hình 3.35. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất limonoid không mở vòng C và hợp chất mở C. vi 112 Hình 3.36. Các nhóm thế thường gặp trong các hợp chất limonoid 113 Hình 3.37. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất có nối đôi liên hợp dạng en-on trong vòng A. 114 Hình 3.38. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất có liên kết eter giữa C-6 với C-28 và C-7 với C-15. 115 Hình 3.39. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng cho các hợp chất có liên kết eter giữa C-6 với C-28 và C-7 với C-15 116 Hình 3.40. Hợp chất limonoid với nhánh vòng furan 117 Hình 3.41. Hợp chất limonoid với nhánh vòng tetrahydrofuran 117 Hình 3.42. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng cho các hợp chất có nhánh vòng γ-hydroxybutenolid 119 Hình 3.43. Công thức các hợp chất limonoid không mở vòng C và giá trị IC50 122 Hình 3.44. Công thức các hợp chất limonoid mở vòng C và giá trị IC50 123 vii DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1. Sinh tổng hợp các limonoid trong cây neem Azadirachta indica 6 Sơ đồ 1.2. Con đường sinh tổng hợp protolimonoid được đề nghị 7 Sơ đồ 1.3. Sự chuyển vị -Apo 8 Sơ đồ 1.4. Cơ chế đề nghị cho dạng khung sườn azadirone (G1) và homoazadirone (H) 12 Sơ đồ 1.5. Cơ chế đề nghị cho những dạng khung sườn vilasinin (I) và gedunin (J) 15 Sơ đồ 1.6. Cơ chế đề nghị cho sự tạo thành các triterpen mở vòng C với vòng hemiacetal và khung sườn của azadirachtin 18 Sơ đồ 1.7. Cơ chế đề nghị cho khung sườn mở vòng C 19 Sơ đồ 1.8. Cơ chế đề nghị cho những limonoid mở vòng C 20 Sơ đồ 1.9. Cơ chế đề nghị cho sự tạo thành các limonoid mở vòng C với nhánh -hydroxybutenolid 22 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ điều chế các cao 42 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ cô lập các hợp chất limonoid từ cao etyl acetat 45 Sơ đồ 2.3. Sơ đồ cô lập các hợp chất limonoid từ cao etyl acetat (tiếp theo) 46 Sơ đồ 2.4. Qui trình thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase 49 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1. Sắc ký cột trên cao etyl acetat 44 Bảng 2.2. Baûng theå tích söû duïng trong qui trình thöû hoaït tính 49 ức chế α-glucosidase Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của NEEM 8 và odoraton 57 Bảng 3.2. So sánh số liệu phổ NMR của NEEM 24 và 23-deoxyazadirachtolid 60 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR của NEEM 39, NEEM 33 và NEEM 31 66 Bảng 3.4. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất NEEM 39, NEEM 33 và NEEM 31 67 Bảng 3.5. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 23 và azadirachtolid 72 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 25 và NEEM 3 76 Số liệu phổ 1H-NMR của NEEM 19, NEEM 20 và NEEM 22 86 Bảng 3.8. Số liệu phổ 13C-NMR của NEEM 19, NEEM 20 và NEEM 22 87 Bảng 3.7. Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 5 và azadirachtolid A 90 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 1 và NEEM 17 95 Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 4 và NEEM 5 97 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 35 và NEEM 14 102 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 30 và NEEM 28 107 Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 34 110 3.15. 3.16. Bảng 3.17. 50 acarbose ết và cao phân đoạn 50 50 120 120 các hợp chất limonoid phân lập từ cao etyl acetat 121 ix MỞ ĐẦU Cùng với những thành quả mà ngành hóa học hữu cơ đạt được, hóa học các hợp chất tự nhiên cũng ngày càng khẳng định vị trí của mình với những đóng góp vượt trội trong đời sống con người. Từ xưa con người đã biết sử dụng các loại thảo mộc để làm thuốc trị bệnh, chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thấu đáo một loại cây, đặc tính thực vật, vùng phân bố, thành phần hóa học và dược tính đã và đang đóng vai trò then chốt trong quá trình khám phá các loại thuốc mới cũng như tổng hợp các hợp chất mới để giải quyết vấn đề kháng thuốc, tiếp tục điều trị các bệnh chưa chế ngự được… Họ Xoan (Meliaceae) có khoảng 50 chi với khoảng 550 loài, trong đó chi Azadirachta là một chi thuộc họ này, nó có ba loài là A. indica, A. excelsa và A. siamensis. A.indica là một loài được biết đến nhiều nhất trong chi với tên thường gọi là cây neem (neem Ấn Độ). Hai loài còn lại thường thấy ở khu vực Đông Nam Á là A.excelsa hay còn gọi là marrango (cây neem Philippine) và A. siamensis (cây neem Thái). Ở Việt Nam hiện nay, cây neem được trồng đại trà ở các vùng ven biển miền Trung, đặc biệt nhiều nhất ở huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận. Cây neem từ lâu đã xuất hiện trong nhiều bài thuốc dân gian, được xem là loại thảo dược quen thuộc trong y học cổ truyền với những công dụng trị liệu hết sức thiết thực như trị ho, sốt rét, da liễu, viêm loét, đái tháo đường…Ngoài ra, người ta còn quan tâm đến những hợp chất có hoạt tính tiêu diệt sâu bệnh, bảo vệ mùa màng, dùng lá neem khô trộn lẫn với hạt để chống sâu mọt… Việc nghiên cứu thành phần hóa học cây neem đã bắt đầu từ rất lâu, cho đến nay, người ta đã cô lập được hàng trăm hợp chất từ cây neem với thành phần chủ yếu là các tetranortriterpenoid hay còn gọi là các limonoid. Các hợp chất limonoid là những hợp chất chính gây nên tính đắng trong các bộ phận của cây neem, trong đó bộ phận hạt là đắng nhất. Với tinh thần mong muốn góp phần tìm hiểu mối liên hệ giữa thành phần hóa học và dược tính của cây neem thuộc chi Azadirachta, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ly trích các hoạt chất limonoid từ lá cây neem trồng ở Ninh Thuận và khảo sát khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các cao trích và các hợp chất cô lập được. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. MÔ TẢ THỰC VẬT2,61,101 Tên khoa học: Azadirachta indica A. Juss còn gọi là Melia indica (A. Juss), Melia azadirachta L. Các tên gọi khác theo các nước: lianshu, kulian, lian zao zi (Trung Quốc); yin du lian shu (Đài Loan); mind (Indonesia); cha-tang, sadao (Thái Lan); sầu đâu (Việt Nam); margosa, neem, chinabery, neem tree (Anh); niembaum, nimbaum (Đức); balnimb, nim, nind (Hindi); bevinmar (Canada); veppu (Malaysia); nim (Nepal) … Hình 1.1. Azadirachta indica A. Juss Cây to cao từ 15-20 m, ở điều kiện thích hợp có thể cao tới 40 m. Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, gồm 6-7 đôi chét lá mọc đối, hình mác, dài 3-8 cm, rộng 23 cm, phiên lệch, nhẵn, đầu nhọn, mép khía răng (lá non có mép nguyên). Cụm hoa mọc ở kẽ lá, ngắn hơn lá, gồm nhiều hoa kết thành những xim nhỏ, hoa màu trắng giống hoa xoan, thơm, dài 5-6 mm, rộng khoảng 8-11 mm, mặt ngoài có lông, tràng năm cánh thuôn hẹp, uốn cong, phình ở gốc, hơi thắt lại ở đầu. Quả hạch (hình bầu dục) dài khoảng 2 cm chứa một hạt, nhân hạt màu trắng, thịt đắng. Rễ gồm có rễ cọc ngắn và nhiều rễ bên mọc khá dài. 2 1.2. VÙNG PHÂN BỐ28,101 Cây neem (A. indica) là cây đặc biệt ưa sáng, chịu hạn, có thể phát triển trong những vùng bán khô hạn, bán sa mạc, có lượng mưa trung bình hằng năm từ 4001200 mm. Cây thích hợp ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có nhiệt độ trung bình hằng năm từ 21-32 oC. Cây có thể chịu được nhiệt độ cao nhưng không thể chịu được nhiệt độ dưới 4 oC. Cây neem có thể phát triển trên nhiều loại đất, nhưng tốt nhất là trên vùng đất cát. Neem là loài cây sinh trưởng tốt, kể cả những miền duyên hải khô cằn, những vùng đất phía nam, và cả những vùng đất dốc khô. Cây neem được xem là có nguồn gốc ở vùng tiểu lục địa Ấn Độ-Pakistan. Ngày nay, nó được tìm thấy ở khu vực phía nam Châu Á như ở Ấn Độ, Pakistan, Bangla Desh, Burma và vùng khô cằn của Sri Lanka. Ở Đông Nam Á, đặc biệt tập trung ở Thái Lan, miền nam Malaysia và Indonesia. Nó cũng được tìm thấy ở một số nước khác như Phillipines, FiJi, Mauritius và các đảo ở Nam Thái Bình Dương. Ở Vùng Trung Đông, nó có ở các nước Yemen và Saudi Arabia. Ở Châu Phi, cây neem mọc rộng rãi ở vùng Sahelian như Ghana, Nigeria và Sudan, ở phía Đông Phi nó xuất hiện ở các nước Ethiopia, Somalia, Kenya, Tanzania và Mozambique và ở phía Tây Phi có các nước Ivory Coast, Togo, Cameroon. Ngoài ra, nó cũng đã được trồng ở Haiti và Surinam. Ở Việt Nam, năm 1981, một số hạt giống A. indica (xoan Ấn Độ) được đưa về trồng thử nghiệm ở khuôn viên Sở Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Ninh Thuận. Sau nhiều năm, cây được nhân giống để nhân trồng tiếp và đến năm 1998, hàng loạt cây con chính thức được đem trồng trên vùng cát khô cằn thuộc xã Phước Dinh, huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận. Cho đến nay, cây sinh trưởng và phát triển tốt, không cần chăm sóc nhiều. Xoan Ấn Độ có triển vọng là cây trồng rừng quan trọng trên các vùng cát khô cằn ven biển, phủ xanh đồi trọc. 3 1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC AZADIRACHTA INDICA Việc nghiên cứu thành phần hóa học A. indica bắt đầu từ năm 1942, khi S. Siddiqui36 cô lập ba hợp chất đắng là nimbin, nimbidin và nimbinin từ dầu neem. Sau đó, hàng trăm hợp chất khác đã được cô lập từ các bộ phận khác nhau của cây neem và cấu trúc cũng được xác định. Trong đó các hợp chất tetranortriterpenoid (limonoid) chiếm nhiều nhất, và được xem là thành phần quan trọng và đặc trưng của cây neem. Vấn đề sinh tổng hợp các hợp chất này cũng đã được nghiên cứu. Thành phần hóa học của cây neem gồm nhiều loại hợp chất và có thể chia thành hai nhóm chính là isoprenoid và không-isoprenoid, Trong đó, các hợp chất loại isoprenoid chiếm nhiều nhất và là thành phần chính của cây neem.59,81,101 - Thành phần isoprenoid trong cây neem là nhóm hợp chất triterpenoid, bao gồm các triterpen bốn vòng (protolimonoid), triterpen bốn vòng có chuyển vị apo (apo-protolimonoid), các nortriterpen như mononortriterpenoid, dinortriterpenoid, trinortriterpenoid, hexanortriterpenoid, tetranortriterpenoid (limonoid), heptanortriterpenoid, pentanortriterpenoid, octanortriterpenoid và nonanortriterpenoid. Ngoài ra, các hợp chất loại isoprenoid khác cũng đã được nghiên cứu từ cây neem như sterol (isopren cải biến) và các diterpenoid.48,59,81,101 - Thành phần các hợp chất không-isoprenoid là các hợp chất như polyphenol (flavonoid và coumarin), carbohydrat, protein, hydrocarbon, acid béo và các ester của nó cũng đã được nghiên cứu.81,101 ● Thành phần các triterpen theo sự sinh tổng hợp Theo Connolly và Taylor,23,98 các limonoid (tetranortriterpenoid) trong cây neem được phân loại theo quá trình sinh tổng hợp (sơ đồ 1.1). Khởi đầu từ triterpen bốn vòng hay còn gọi là protolimonoid hoặc protomeliancin hoặc melian (nhóm 1) và từ đó chuyển hóa thành nhiều limonoid khác nhau và có thể chia thành các nhóm khác nhau như apo-protolimonoid hay còn gọi là apo-tetracylic triterpen (nhóm 2, sơ đồ 1.1), tetranortriterpenoid với nhánh là vòng -hydroxybutenolid (nhóm 3a, sơ 4 đồ 1.1), tetranortriterpenoid với nhánh là vòng furan (nhóm 3b, sơ đồ 1.1), tetranortriterpenoid mở vòng C với nhánh là vòng -hydroxybutenolid (nhóm 4a, sơ đồ 1.1), tetranortriterpenoid mở vòng C với nhánh là vòng furan (nhóm 4b, sơ đồ 1.1) và tetranortriterpenoid có vòng D-lacton với nhánh là vòng furan (nhóm 5, sơ đồ 1.1). Như vậy, sinh tổng hợp limonoid trong cây neem bắt đầu từ tiền chất triterpen bốn vòng thuộc nhóm tirucallol với C-20 có cấu hình . Tuy nhiên một số nghiên cứu cho rằng tiền chất triterpen bốn vòng thuộc nhóm euphol với C-20 có cấu hình tổng hợp ra nimbolid ở lá có hiệu quả hơn nhóm tirucallol, như trình bày trong hình 1.2.101 HO HO Euphol (20β-H) 7-Euphol (20β-H) Tirucallol (20α-H) 7- Tirucallol (20α-H) Hình 1.2. Dạng khung sườn euphol và tirucallol Từ tiền chất triterpen bốn vòng thuộc nhóm tirucallol với nhóm metyl ở C-14 và nối đôi ở C-7 bị chuyển hóa thành dẫn xuất của 7 -hydroxy-8-metyl với nối đôi ở C-14(15) gọi là apo-tirucallol (nhóm 2, sơ đồ 1.1). Buchanan (1970)21 và S. Siddiqui (1986)85 cho rằng limonoid là tetranortriterpenoid được hình thành khi mạch nhánh tại C-17 mất đi bốn nguyên tử carbon, sau đó đóng vòng thành vòng -hydroxybutenolid (nhóm 3a) hoặc vòng furan (nhóm 3b). Trong khi đó, Kraus (1980)49 và Connolly (1983)23 cho rằng sinh tổng hợp limonoid với vòng furan (nhóm 3b) có thể được tạo trực tiếp từ apo-protolimonoid (nhóm 2), còn vòng -hydroxybutenolid (nhóm 3a) được tạo ra sau nhờ quá trình oxy hóa vòng furan của các limonoid tương ứng. 5 21 H 18 11 19 1 A 3 C 9 10 24 H 26 25 23 27 D 15 B 5 29 13 22 20 17 30 7 OH 28 Apo-tetracylic triterpen (Nhóm 2) Tetracylic triterpen (Nhóm 1) O O O OH OH OH Nortriterpen năm vòng với vòng furan (Nhóm 3b) Nortriterpen năm vòng với vòng -hydroxybutenolid (Nhóm 3a) O O OH 21 O 20 12 HOOC HOOC Oxid hóa vòng D thành vòng lacton Oxid hóa vòng C Oxid hóa vòng C 18 11 13 O 23 22 17 C O 14 8 10 D 15 O A B O O 7 6 C-seco nortriterpen với vòng -hydroxybutenolid (Nhóm 4a) C-seco nortriterpen với vòng furan (Nhóm 4b) Nortriterpen có vòng D lacton với vòng furan (Nhóm 5) Sơ đồ 1.1. Sinh tổng hợp các limonoid trong cây neem A. indica101 6 Nhóm 4a được hình thành từ quá trình oxy hóa các hợp chất nhóm 3a tại vòng C, tạo thành C-seco nortriterpenoid (nortriterpenoid mở vòng C) với vòng hydroxybutenolid. Oxy hóa các hợp chất nhóm 3b tại vòng C tạo thành C-seco nortriterpenoid với vòng furan (nhóm 4b) và tại vòng D tạo thành D lacton triterpen (sơ đồ 1.1) 1.3.1. Tetracyclic triterpen và apo-tetracyclic triterpen (protolimonoid và apo-protolimonoid) 1.3.1.1. Protolimonoid (nhóm 1, sơ đồ 1.1) O Squalene Squalene epoxid (A) HO (A1) HO HO (C) Euphol (20-H ) Tirucallol (20-H ) Lanosterol (B) HO Butyrospermol (D) Sơ đồ 1.2. Con đường sinh tổng hợp protolimonoid được đề nghị56,81 7