Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài tacca vietnamensis và loài tacca chantrieri ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Vũ Thị Quỳnh Chi NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI Tacca vietnamensis VÀ LOÀI Tacca chantrieri Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Vũ Thị Quỳnh Chi NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI Tacca vietnamensis VÀ LOÀI Tacca chantrieri Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm 2. TS. Phạm Hải Yến Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và TS. Phạm Hải Yến. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Vũ Thị Quỳnh Chi LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin trân trọng bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện về sự quan tâm, ủng hộ to lớn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa sinh biển, đặc biệt là PGS. TS Phan Văn Kiệm về sự quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin cảm ơn, sự cảm phục và kính trọng nhất tới TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và TS. Phạm Hải Yến - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungnam và Khoa Dược, Trường Đại học Wonkwang Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc đánh giá hoạt tính sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn tới chỉ huy, lãnh đạo Trung tâm Quan trắc - Phân tích Môi trường biển và các đồng nghiệp đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Việt Nam (NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 104.01-2012.22. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! i MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................. I DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................... V DANH MỤC BẢNG ..............................................................................................VII DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. VIII MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về chi Tacca ................................................................................................. 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Tacca................................................................................................ 3 1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Tacca ....................................... 4 1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tacca................................................ 6 1.1.3.1. Các hợp chất taccalonolide ...................................................................................................... 6 1.1.3.2. Các hợp chất withanolide và withanolide glycoside ............................................................. 9 1.1.3.3. Các hợp chất cholestan glycoside.......................................................................................... 10 1.1.3.4. Các hợp chất spirostanol và spirostanol glycoside ............................................................. 12 1.1.3.5. Các hợp chất furostanol glycoside ........................................................................................ 13 1.1.3.6. Các hợp chất pregnane glycoside.......................................................................................... 15 1.1.3.7. Các hợp chất diaryl heptanoid và diaryl heptanoid glycoside ........................................... 17 1.1.3.8. Các hợp chất khác ................................................................................................................... 18 1.1.4. Hoạt tính sinh học của chi Tacca ............................................................................................. 20 1.1.4.1. Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư ....................................................................................... 20 1.1.4.2. Hoạt tính kháng viêm .............................................................................................................. 21 1.1.4.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa và hạ huyết áp .................................. 21 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về chi Tacca ở Việt Nam .................................................................... 22 1.2. Giới thiệu về loài Tacca vietnamensis và Tacca chantrieri ...................................... 23 1.2.1. Loài Tacca vietnamensis............................................................................................................ 23 1.2.2. Loài Tacca chantrieri ................................................................................................................. 23 1.3. Giới thiệu về ung thư .................................................................................................. 24 1.3.1. Ung thư và một số phương pháp điều trị bệnh ....................................................................... 24 1.3.1.1. Các đặc tính cơ bản của bệnh ung thư .................................................................................. 24 1.3.1.2. Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư .......................................................................... 27 1.3.2. Một số loại thuốc điều trị ung thư hiện nay có nguồn gốc từ tự nhiên ............................... 29 1.4. Giới thiệu về kháng viêm............................................................................................ 31 1.4.1. Sơ lược về viêm ........................................................................................................................... 31 1.4.1.1. Giới thiệu về quá trình viêm ................................................................................................... 31 ii 1.4.1.2. Các giai đoạn của quá trình viêm.......................................................................................... 31 1.4.1.3. Các yếu tố tham gia quá trình viêm ....................................................................................... 32 1.4.2. Các thuốc kháng viêm................................................................................................................ 34 1.4.3. Một số sản phẩm từ tự nhiên có hoạt tính kháng viêm ......................................................... 35 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .............................................................. 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................. 37 2.1.1. Loài Tacca vietnamensis Thin et Hoat .................................................................................... 37 2.1.2. Loài Tacca chantrieri André ..................................................................................................... 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 37 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ....................................................................................... 37 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................................................... 37 2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) ........................................................................................................................ 37 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................................................... 37 2.2.2.1. Phổ khối lượng (MS) ............................................................................................................... 38 2.2.2.2. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS)........................................................................ 38 2.2.2.3. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) ........................................................................................... 38 2.2.2.4. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) ........................................................................................................ 38 2.2.2.5. Điểm nóng chảy (Mp) ............................................................................................................. 38 2.2.2.6. Độ quay cực ([α]).................................................................................................................... 38 2.2.2.7. Phương pháp xác định đường ................................................................................................ 38 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học .............................................................................. 39 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư ................................................... 39 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm....................................................................... 41 2.3. Phân lập các hợp chất................................................................................................. 43 2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài T. vietnamensis ....................................................................... 43 2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài T. chantrieri ............................................................................ 46 2.4. Thông sô vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được....................... 48 2.4.1. Các thông số vật lý của các hợp chất phân lập được từ loài T. vietnamensis ..................... 48 2.4.1.1. Hợp chất TV1: Taccavietnamoside A (mới)......................................................................... 48 2.4.1.2. Hợp chất TV2: Taccavietnamoside B (mới)......................................................................... 48 2.4.1.3. Hợp chất TV3: Taccavietnamoside C (mới) ........................................................................ 48 2.4.1.4. Hợp chất TV4: Taccavietnamoside D (mới) ........................................................................ 49 2.4.1.5. Hợp chất TV5: Taccavietnamoside E (mới)......................................................................... 49 2.4.1.6. Hợp chất TV6: (24S,25R)-spirost-5-en-3β,24-diol3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[αL-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside ........................................................................... 49 iii 2.4.1.7. Hợp chất TV7: (24S,25R)-spirost-5-en-3β,24-diol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[βD-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside........................... 49 2.4.1.8. Hợp chất TV8: Chantrieroside A .......................................................................................... 50 2.4.1.9. Hợp chất TV9: Plantagineoside A ........................................................................................ 50 2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài T. chantrieri ........................... 51 2.4.2.1. Hợp chất TC1: Chantriolide D (mới) ................................................................................... 51 2.4.2.2. Hợp chất TC2: Chantriolide E (mới) .................................................................................... 51 2.4.2.3. Hợp chất TC3: Chantriolide A .............................................................................................. 51 2.4.2.4. Hợp chất TC4: Chantriolide B .............................................................................................. 51 2.4.2.5. Hợp chất TC5: Chantriolide C .............................................................................................. 52 2.4.2.6. Hợp chất TC6: (3R,5R)-3,5-Dihydroxy-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)heptane ............... 52 2.4.2.7. Hợp chất TC7: (3R,5R)-3,5-Dihydroxy-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)heptane 3-O-β-Dglucopyranoside .................................................................................................................................... 52 2.4.2.8. Hợp chất TC8: (3R,5R)-3,5-Dihydroxy-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)heptane 3-O-β-Dglucopyranoside .................................................................................................................................... 53 2.4.2.9. Hợp chất TC9: (3R,5R)-3,5-Dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)heptane 3-O-β-D-glucopyranoside ...................................................................................................... 53 2.4.2.10. Hợp chất TC10: (6S,9R)-Roseoside .................................................................................... 54 2.4.2.11. Hợp chất TC11: 2-hydroxyphenol-1-O-β-D-glucopyranoside ......................................... 54 2.4.2.12. Hợp chất TC12: 1-O-syringoyl-β-D-glucopyranoside ...................................................... 54 2.4.2.13. Hợp chất TC13: Benzyl-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-O-β-D-glucopyranoside.......... 55 2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được ........................... 55 2.5.1. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài T. vietnamensis ................ 55 2.5.2. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài T. chantrieri ..................... 57 2.5.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư các hợp chất phân lập được từ loài T. chantrieri ........................................................................................................................................... 58 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ........................................................................... 60 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được ................................................. 60 3.1.1. Đặc trưng phổ của các hợp chất taccalonolide và withanolide ............................................ 62 3.1.2. Đặc trưng phổ của hợp chất spirostanol saponin................................................................... 63 3.1.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài T. vietnamensis....................... 64 3.1.3.1. Hợp chất TV1: Taccavietnamoside A ................................................................................... 64 3.1.3.2. Hợp chất TV2: Taccavietnamoside B ................................................................................... 71 3.1.3.3. Hợp chất TV3: Taccavietnamoside C ................................................................................... 78 3.1.3.4. Hợp chất TV4: Taccavietnamoside D................................................................................... 85 iv 3.1.3.5. Hợp chất TV5: Taccavietnamoside E ................................................................................... 91 3.1.3.6. Hợp chất TV6: (24S,25R)-spirost-5-en-3β,24-diol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[αL-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside ........................................................................... 98 3.1.3.7. Hợp chất TV7: (24S,25R)-24-hydroxyspirost-5-en-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside .......... 101 3.1.3.8. Hợp chất TV8: Chantrieroside A ........................................................................................ 104 3.1.3.9. Hợp chất TV9: Plantagineoside A ...................................................................................... 107 3.1.4. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài T. chantrieri .......................... 108 3.1.4.1. Hợp chất TC1: Chantriolide D (mới) ................................................................................. 108 3.1.4.2. Hợp chất TC2: Chantriolide E (mới) .................................................................................. 115 3.1.4.3. Hợp chất TC3: Chantriolide A ............................................................................................ 121 3.1.4.4. Hợp chất TC4: Chantriolide B ............................................................................................ 123 3.1.4.5. Hợp chất TC5: Chantriolide C ............................................................................................ 125 3.1.4.6. Hợp chất TC6: (3R,5R)-3,5-dihydroxy-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)heptane .............. 127 3.1.4.7. Hợp chất TC7: 3,5-dihydroxy-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)heptane 3-O-β-D- glucopyranoside .................................................................................................................................. 128 3.1.4.8. Hợp chất TC8: 3,5-dihydroxy-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)heptane 3-O-β-D- glucopyranoside .................................................................................................................................. 128 3.1.4.9. Hợp chất TC9: 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-heptane 3O-β-D-glucopyranoside ...................................................................................................................... 129 3.1.4.10. Hợp chất TC10: (6S,9R)-roseoside ................................................................................... 130 3.1.4.11. Hợp chất TC11: 2-hydroxyphenol-1-O-β-D-glucopyranoside ....................................... 132 3.1.4.12. Hợp chất TC12: 1-O-syringoyl-β-D-glucopyranoside .................................................... 133 3.1.4.13. Hợp chất TC13: Benzyl O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside........ 133 3.2. Hoạt tính của các hợp chất phân lập được ............................................................. 134 3.2.1. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được ...................................................... 134 3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài T. chantrieri .......... 136 KẾT LUẬN ............................................................................................................138 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................139 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................141 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................142 PHỤ LỤC ...............................................................................................................150 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu 13 C-NMR 1 H-NMR A-431 A-549 BV2 CD COSY COX CS DEPT Tiếng Anh Carbon -13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Epidemoid carcinoma cell Lung carcinoma cell Mouse microglial cell IC50 Circular dichroism spectroscopy 1 H-1H- correlation spectroscopy Cyclooxygenase Cell survival Distortionless enhancement by polarization transfer Dimethyl sulfoxide Ethylene diamine tetracetic acid Ethylene glycol-bis(βaminoethyl ether)-N,N,N',N'tetraacetic acid Electrospray ionization mass spectrum Fetal bovine serum Gas chromatography Glucose Granulocyte colony stimulating factor Granulocyte macrophage colony stimulating factor Human cervical cancer cell Human embryonic kidney 293 cell Hepatocyte carcinoma cell Human promyelocytic leukemia cell Heteronuclear mutiple bond correlation High resolution electrospray ionization mass spectrum Heteronuclear single quantum correlation Inhibitory concentration at 50% iNOS Inducible nitric oxide synthase DMSO EDTA EGTA ESI-MS FBS GC Glc G-CSF CM-CSF HeLa HEK 293 HepG2 HL-60 HMBC HR-ESI-MS HSQC Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Tế bào ung thư biểu mô Tế bào ung thư phổi Tế bào tiểu thần kinh đệm của chuột Phổ lưỡng sắc tròn Phổ 1H-1H COSY Sự sống sót của tế bào Phổ DEPT Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử Huyết thanh bò Sắc ký khí Tế bào ung thư cổ tử cung Tế bào thận phôi người Tế bào ung thư gan Tế bào ung thư máu người Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Enzym tạo ra oxit nitơ từ vi KB Human epidemoid carcinoma KH LPS LU-1 LD50 LNCaP MCF-7 MDA-MB-231 MDA-MB-435 Lipopolysaccharide Lung carcinoma cell Lethal dose 50 Human prostatic carcinoma cell Human breast carcinomacell Metastatic breast cancer cell MIC MTT NCI-H460 NO NOESY NF-B NSAIDs OD PC-3 PARP PPARs Rha RP18 ROESY SF-268 (CNS) SRB PG TLC TLTK TMS TNF TT Human melanoma cell Minimum inhibitory concentration 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-Diphenyltetrazolium bromide Human lung cancer cell Nitric oxide Nuclear overhauser enhancement spectroscopy Nuclear factor-kappa B Non-steroidal anti-inflammatory drugs Optical density Prostate adenocarcinoma cell Poly (ADP-ribose) polymerase Peroxisomeproliferatoractivated receptors Rhamnose Reversed-phase C18 Rotating frame nuclear overhauser effect spectroscopy Central nervous system cancer cell Sulforhodamine B Prostaglandin Thin layer chromatography Tetramethylsilane Tumor necrosis factor amino L-arginine acid Tế bào ung thư biểu mô người Kí hiệu Tế bào ung thư phổi Liều gây chết 50% Tế bào ung thư tuyến tiền liệt Tế bào ung thư vú người Tế bào ung thư vú người Tế bào ung thư vú ác tính người Nồng độ ức chế tối thiểu Tế bào ung thư phổi người Phổ NOESY Yếu tố nhân kappa B Thuốc chống viêm không steroid Mật độ quang Tế bào ung thư tuyến tiền liệt Protein PARP Pha đảo C18 Phổ ROESY Tế bào ung thư hệ thần kinh trung ương Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Yếu tố hoại tử khối u Thứ tự vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Tacca ở Việt Nam............................................................. 3 Bảng 1.2. Công dụng của các loài thuộc chi Tacca ở Việt Nam ..................................................... 5 Bảng 1.3. Các hợp chất taccalonolide (1-32) từ chi Tacca.............................................................. 6 Bảng 1.4. Các hợp chất withanolide và withanolide glycoside (33-49)......................................... 9 Bảng 1.5. Các hợp chất cholestan glycoside (50-60) từ loài T. chantrieri ..................................10 Bảng 1.6. Các hợp chất spirostanol và spirostanol glycoside (61-72) từ chi Tacca ..................12 Bảng 1.7. Các hợp chất furostanol glycoside từ chi Tacca ............................................................13 Bảng 1.8. Các hợp chất pregnane glycoside (86-92) từ chi Tacca ...............................................15 Bảng 1.9. Các hợp chất diaryl heptanoid glycoside (93-104) .......................................................17 Bảng 1.10. Các hợp chất khác từ chi Tacca (105-115) ..................................................................18 Bảng 2.1.% Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất TV1-TV9 tại nồng độ 80 µM .....................................................................................................56 Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 của các hợp chất TV3-TV5.......................................................................................................................................56 Bảng 2.3. % Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất TC1-TC13 tại nồng độ 80 µM...................................................................................................57 Bảng 2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 của hợp chất TC1 và TC2...........................................................................................................................................57 Bảng 2.5. Kết quả gây độc tế bào ung thư của các hợp chất tại nồng độ 100 µM.....................58 Bảng 2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất ...............................59 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất TV1 và hợp chất tham khảo ......................................66 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất TV2 và hợp chất tham khảo ......................................73 Bảng 3.3.Số liệu phổ NMR của hợp chất TV3 và hợp chất tham khảo .......................................79 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất TV4 và hợp chất tham khảo ......................................87 Bảng 3.5.Số liệu phổ NMR của hợp chất TV5 và hợp chất tham khảo .......................................93 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất TV6 và hợp chất tham khảo ....................................100 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất TV7 và hợp chất tham khảo ....................................103 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất TV8 và hợp chất tham khảo ....................................105 Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất TC1 và hợp chất tham khảo ....................................110 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất TC2 và hợp chất tham khảo ..................................116 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất TC3 và hợp chất tham khảo ..................................122 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất TC4 và hợp chất tham khảo ..................................124 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất TC5 và hợp chất tham khảo ..................................126 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Tacca .............................................................................. 4 Hình 1.2. Ký hiệu viết tắt của các phần đường và nhóm thế............................................................ 7 Hình 1.3.Cấu trúc các hợp chất taccalonolide (1-32) từ chi Tacca................................................ 8 Hình 1.4. Cấu trúc của các withanolide và withanolide glycoside (33-49) .................................10 Hình 1.5.Cấu trúc các hợp chất cholestan glycoside (50-60) từ loài T. chantrieri.....................11 Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất spirostanol và spirostanol glycoside (61-72) ..........................13 Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất furostanol glycoside (73-85)......................................................15 Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất pregnane glycoside (86-92).......................................................16 Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất diaryl heptanoid và diaryl heptanoid glycoside (93-104) ................................................................................................................................................18 Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khác (105-115) ..........................................................................19 Hình 1.11. Chu kỳ tế bào .....................................................................................................................25 Hình 1.12. Quá trình phát triển tế bào ung thư................................................................................26 Hình 1.13. Cấu trúc một số hợp chất đã được dùng làm thuốc chống ung thư ..........................30 Hình 1.14. Cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính kháng viêm......................................................36 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài T. vietnamensis.....................................................45 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài T. chantrieri ..........................................................47 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từloài T. vietnamensis .......................60 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài T. chantrieri ...........................61 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất TV1 và taccasuboside C (65) ....................................64 Hình 3.4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TV1.................................................................................65 Hình 3.5. Các tương tác HMBC và ROE chính của hợp chất TV1..............................................67 Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất TV1 ......................................................................................68 Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của hợp chất TV1 .....................................................................................68 Hình 3.8. Phổ DEPT của hợp chất TV1 ...........................................................................................69 Hình 3.9. Phổ HSQC của hợp chất TV1 ..........................................................................................69 Hình 3.10. Phổ HMBC của hợp chất TV1 .......................................................................................70 Hình 3.11. Phổ ROESY của hợp chất TV1 ......................................................................................70 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học TV2 và hợp chất tham khảo TV1 ...................................................71 Hình 3.13. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất TV2 .........................................72 Hình 3.14. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TV2...............................................................................74 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của hợp chất TV2 ....................................................................................74 Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của hợp chất TV2 ...................................................................................75 Hình 3.17. Phổ DEPT của hợp chất TV2.........................................................................................75 ix Hình 3.18. Phổ HSQC của hợp chất TV2 ........................................................................................76 Hình 3.19. Phổ HMBC của hợp chất TV2 .......................................................................................76 Hình 3.20. Phổ COSY của hợp chất TV2 .........................................................................................77 Hình 3.21. Phổ ROESY của hợp chất TV2 ......................................................................................77 Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của TV3 và hợp chất tham khảo TV1............................................78 Hình 3.23. Các tương tác HMBC và ROE của hợp chất TV3 ......................................................80 Hình 3.24. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TV3...............................................................................81 Hình 3.25. Phổ 1H-NMR của hợp chất TV3 ....................................................................................81 Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất TV3 ...................................................................................82 Hình 3.27. Phổ DEPT của hợp chất TV3.........................................................................................82 Hình 3.28. Phổ HSQC của hợp chất TV3 ........................................................................................83 Hình 3.29. Phổ HMBC của hợp chất TV3 .......................................................................................83 Hình 3.30. Phổ COSY của hợp chất TV3 .........................................................................................84 Hình 3.31. Phổ ROESY của hợp chất TV3 ......................................................................................84 Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất TV4 và hợp chất tham khảo TV3 ...........................85 Hình 3.33. Các tương tác HMBC chính của hợp chất TV4 ..........................................................86 Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của hợp chất TV4 ....................................................................................88 Hình 3.35. Phổ 13C-NMR của hợp chất TV4 ...................................................................................88 Hình 3.36. Phổ DEPT của hợp chất TV4.........................................................................................89 Hình 3.37. Phổ HSQC của hợp chất TV4 ........................................................................................89 Hình 3.38. Phổ HMBC của hợp chất TV4 .......................................................................................90 Hình 3.39. Phổ NOESY của hợp chất TV4 ......................................................................................90 Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất TV5 và hợp chất tham khảo TV4 ...........................91 Hình 3.41.Các tương tác HMBC, COSY và ROE chính của hợp chất TV5 ...............................92 Hình 3.42. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TV5...............................................................................94 Hình 3.43. Phổ 1H-NMR của hợp chất TV5 ....................................................................................94 Hình 3.44. Phổ 13C-NMR của hợp chất TV5 ...................................................................................95 Hình 3.45. Phổ DEPT của hợp chất TV5.........................................................................................95 Hình 3.46. Phổ HSQC của hợp chất TV5 ........................................................................................96 Hình 3.47. Phổ HMBC của hợp chất TV5 .......................................................................................96 Hình 3.48. Phổ COSY của hợp chất TV5 .........................................................................................97 Hình 3.49. Phổ ROESY của hợp chất TV5 ......................................................................................97 Hình 3.50. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất TV6.......................98 Hình 3.51. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất TV7.....................101 Hình 3.52. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất TV8.....................104 x Hình 3.53. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất TV9 ...107 Hình 3.54. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC1 và hợp chất taccalonolide M (13) ................108 Hình 3.55. Các tương tác HMBC chính của hợp chất TC1 ........................................................110 Hình 3.56. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TC1.............................................................................111 Hình 3.57. Phổ 1H-NMR của hợp chất TC1 ..................................................................................111 Hình 3.58. Phổ 13C-NMR của hợp chất TC1 .................................................................................112 Hình 3.59. Phổ DEPT của hợp chất TC1.......................................................................................112 Hình 3.60. Phổ HSQC của hợp chất TC1 ......................................................................................113 Hình 3.61. Phổ HMBC của hợp chất TC1 .....................................................................................113 Hình 3.62. Phổ COSY của hợp chất TC1 .......................................................................................114 Hình 3.63. Phổ ROESY của hợp chất TC1 ....................................................................................114 Hình 3.64. Cấu trúc hóa học của TC2 và hợp chất tham khảo plantagiolide I (46)................115 Hình 3.65. Các tương tác HMBC chính của hợp chất TC2 ........................................................116 Hình 3.66. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TC2.............................................................................117 Hình 3.67. Phổ 1H-NMR của hợp chất TC2 ..................................................................................118 Hình 3.68. Phổ 13C-NMR của hợp chất TC2 .................................................................................118 Hình 3.69. Phổ DEPT của hợp chất TC2.......................................................................................119 Hình 3.70. Phổ HSQC của hợp chất TC2 ......................................................................................119 Hình 3.71. Phổ HMBC của hợp chất TC2 .....................................................................................120 Hình 3.72. Phổ COSY của hợp chất TC2 .......................................................................................120 Hình 3.73. Phổ ROESY của hợp chất TC2 ....................................................................................121 Hình 3.74. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất TC3.....................121 Hình 3.75. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất TC4............................123 Hình 3.76. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất TC5............................125 Hình 3.77. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC6............................................................................127 Hình 3.78. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC7............................................................................128 Hình 3.79. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC8............................................................................128 Hình 3.80. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC9............................................................................129 Hình 3.81. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất TC10 ....................................130 Hình 3.82. Phổ CD của hợp chất TC10 .........................................................................................132 Hình 3.83. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC11 và hợp chất tham khảo ................................132 Hình 3.84. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC12 .........................................................................133 Hình 3.85. Cấu trúc hóa học của hợp chất TC13 .........................................................................133 Hình 3.86. Hoạt tính ức chế NO trên dòng tế bào BV2 kích thích bởi LPS của hợp chất TV3TV5, TC1 và TC2...............................................................................................................................136 1 MỞ ĐẦU Điều kiện tự nhiên và khí hậu đặc trưng và đa dạng giữa vùng miền, đã đem lại cho đất nước Việt Nam một hệ sinh thái thực vật phong phú. Bên cạnh đó, Việt Nam cũng là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Theo các nhà khoa học, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, hơn 5.000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh [1, 2]. Vai trò của nguồn tài nguyên cây thuốc ngày càng được nâng cao do có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc trong điều trị bệnh. Hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc truyền thống đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó là những nghiên cứu cơ bản về xác định thành phần hóa học và tìm ra hoạt chất thể hiện hoạt tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Cho đến nay, trên thế giới đã tìm ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng làm thuốc để điều trị và nâng cao sức khỏe. Paclitaxel (taxol) từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia), vinblastine và vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) được sử dụng trong hóa trị, điều trị bệnh ung thư [3]. Ở Việt Nam, từ kinh nghiệm chữa trị sốt rét trong đông y, hoạt chất artemisinin được chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp cung cấp cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Tuy nhiên, còn có rất nhiều cây thuốc được sử dụng trong đông y và theo kinh nghiệm dân gian chữa các bệnh như ung thư và các bệnh viêm nhiễm nhưng chưa được nghiên cứu một cách khoa học để làm rõ công dụng và phát triển trở thành thuốc. Một số loài của chi Tacca được sử dụng trong y học cổ truyền ở một số nước dùng làm thuốc chữa các bệnh như viêm loét dạ dày, viêm ruột, viêm gan, v.v,..., là một trong những đối tượng đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và đã công bố nhiều công trình nghiên cứu. Theo cơ sở dữ liệu Scifinder hiện có khoảng 60 công trình nghiên cứu công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 6 trong tổng số 17 loài thuộc chi Tacca. Ở Việt Nam, đã thống kê được 6 loài thuộc chi Tacca. Loài Tacca chantrieri đã được y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa thấp khớp. Rễ, củ loài Tacca vietnamensis được dùng làm thuốc như Tacca chantrieri, lá được dân gian dùng làm rau ăn. Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 2 của các loài thuộc chi Tacca ở Việt Nam còn rất hạn chế, mới chỉ có 3 công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học [1, 4-6]. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Tacca vietnamensis và loài Tacca chantrieri ở Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của thân rễ hai loài Tacca vietnamensis và Tacca chantrieri ở Việt Nam. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ thân rễ loài Tacca vietnamensis và Tacca chantrieri ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký; 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học; 3. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ hai loài Tacca vietnamensis và Tacca chantrieri; 4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài Tacca chantrieri. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Tacca 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Tacca Chi Tacca (Râu hùm) thuộc họ Taccaceae (Râu hùm), bộ Liliales (Hành), lớp Liliopsida (Một lá mầm), ngành Magnoliophyta (Mộc lan) [1, 7]. Theo thống kê từ trang theplantlist.org, hiện có 17 loài thuộc chi Tacca trên trên thế giới, bao gồm: T. ampliplacenta L. Zhang & Q.J.Li, T. ankaranensis Bard.Vauc. T. bibracteata Drenth, T. borneensis Ridl, chantrieri André, T. ebeltajae Drenth, lanceolata Spruce, T. leontopetaloides (L.) Kuntze, T. celebica Koord, T. integrifolia Ker Gawl., T. maculata Seem., T. T. T. palmata Blume, T. palmatifida Baker, T. parkeri Seem, T. plantaginea (Hance) Drenth, T. reducta P.C. Boyce & S. Julia và T. subflabellata P.P. Ling & C.T. Ting. Chi Tacca phân bố ở nhiều nơi nhưng tập trung nhiều ở các nước Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, Australia, nhiều đảo trên Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương,… [1, 2, 8]. Ở Việt Nam, theo thống kê có 6 loài thuộc chi Tacca [1, 7]. Thông tin về các loài được nêu trong Bảng 1.1. Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Tacca ở Việt Nam TT Tên khoa học Tên thường gọi Phân bố 1 T. chantrieri André Râu hùm Tuyên Quang, Thái Nguyên, Bắc Giang, Phú Thọ, Hà Nội, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam. 2 T. integrifolia Ker-Gawl. Ngải rợm Lào Cai, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hòa Bình, Quảng Trị, Khánh Hòa, Đồng Nai. 3 T. leontopetaloides (L.) Kuntze Huyền tinh Bình Thuận, Ninh Thuận, Bà Rịa Vũng Tàu, An Giang, Kiên Giang. 4 T. palmata Blume 5 T. plantaginea (Hance.) Drenth Hồi đầu Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa. 6 T. vietnamensis Thin et Hoat Râu hùm lớn Hà Nội, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thừa Thiên - Huế và Quảng Nam, Ðà Nẵng. Nưa chân vịt Kiên Giang, Bà Rịa - Vũng Tàu. 4 Râu hùm (Tacca chantrieri) Râu hùm lớn (Tacca vietnamensis) Huyền tinh (Tacca leontopetaloides) Nưa chân vịt (Tacca palmata) Hồi đầu (Tacca plantaginea) Ngải rợm (Tacca integrifolia) Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Tacca Chi Tacca là loại cây thân thảo. Lá đơn, hình bầu dục thót, nhọn về phía chóp, gốc hơi lệch, dài khoảng 25-65 cm, rộng 7-35 cm, lúc non có màu hơi tím lá già mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu lục nhạt. Cuống cụm hoa dài hơn cuống lá. Bao hoa hình ống có nhiều thuỳ, nhị. Tán hoa có lá bắc tạo thành bao chung, các lá bắc con dạng sợi dài. Hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ côn trùng. Quả nạc có cánh, chứa nhiều hạt [1]. 1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Tacca Trên thế giới, một số loài thuộc chi Tacca được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau. Ở Trung Quốc, loài T. chantrieri được sử dụng để trị viêm loét dạ dày và tá tràng, viêm gan, huyết áp cao, bỏng lửa, lở ngứa. 5 Thân rễ loài T. plantaginea được dùng làm thuốc trị đau dạ dày, viêm ruột, lao phổi, đòn ngã tổn thương, ung thũng. Loài T. integrifolia được dùng chữa viêm dạ dày và hành tá tràng, viêm dạ dày mãn tính, sưng đau vòm họng; dùng ngoài để trị mụn nhọt lở ngứa. Ở Ấn Độ, rễ củ của loài T. leontopetaloides thường được sử dụng để chế biến món ăn và sử dụng làm thuốc trị lỵ. Ngoài ra, ở Nuven Caledoni, loài T. leontopetaloides lại được dùng trị bệnh ngoài da và các vết rắn cắn. Ở Indonexia, phần củ loài T. palmata được sử dụng để làm lành vết thương và đắp vào vết rắn cắn; thân giã nát đắp vào rốn để trị đau dạ dày [1, 2, 7, 9]. Ở Việt Nam, theo thống kê các loài thuộc chi Tacca có tác dụng chữa một số bệnh, ngoài ra một số loài còn được sử dụng làm rau ăn (Bảng 1.2) [1, 2, 7, 9]. Bảng 1.2. Công dụng của các loài thuộc chi Tacca ở Việt Nam TT Tên khoa học 1 T. chantrieri André 2 T. integrifolia Gawl Ker- Tên tiếng Việt Bộ phận sử dụng Râu hùm Thân rễ Có vị cay đắng, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm chỉ thống, lương huyết tán ứ. Dùng ngoài chữa thấp khớp. Ngải rợm Toàn cây Có vị đắng, tính mát; có tác dụng lý khí chỉ thống, khư ứ sinh tân và tiết ngược. Dùng chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh và tắc kinh. Toàn cây Vị đắng, tính mát, có tác dụng lợi dạ dày và chữa thương. 3 T. leontopetaloides (L.) Huyền Kuntze tinh Tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian Bột củ Nếu chế biến kỹ dùng làm món ăn và thích hợp với người bị bệnh lỵ. Cũng dùng tốt cho người đi tiểu ra máu. 4 T. palmata Blume Nưa chân vịt Thân rễ 5 T. plantaginea (Hance.) Hồi đầu Drenth 6 T. vietnamensis Thin et Râu hùm Hoat lớn Chữa điều hòa kinh nguyệt, giống Ngải rợm. Vị đắng, hơi the, tính bình, có tác dụng bổ huyết, làm tan máu ứ, thông kinh bế, tiêu viêm, điều hòa kinh nguyệt, giúp tiêu hóa nhuận tràng, lợi mật. Thường dùng chữa tiêu hóa kém, đau bụng, vàng da do viêm gan siêu vi trùng, ỉa chảy, thần kinh suy nhược, huyết áp cao, đau dây thần kinh tọa, thấp khớp. Thân rễ Có thể sử dụng như loài Râu hùm. Lá có thể sử dụng làm rau ăn. 6 1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tacca Trong những năm gần đây, ở nhiều nước trên thế giới và các nước trong khu vực, đặc biệt là Trung Quốc và Nhật Bản, đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Tacca. Theo những công trình đã được công bố cho thấy, thành phần hóa học của chi Tacca, bao gồm các nhóm chất chính như: Taccalonolide, withanolide, withanolide glycoside, steroidal glycoside, pregnane glycoside, spirostanol saponin, furostanol glycoside, phenolic glycoside, steroidal saponin, sterol oligoglucoside, steroidal và diaryl heptanoid. Đây là các chất thuộc các lớp chất sterol, terpen, flavon, .... trong đó lớp chất sterol là lớp chất khá phổ biến trong các loài của chi Tacca đã được nghiên cứu. Các nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu tập trung nhiều ở 5 loài: T. chantrieri, T. integrifolia, T. leontopetaloide, T. plantaginea, và T. subflaellata. Taccalonolide và spirostanol saponin được tìm thấy hầu hết ở các loài thuộc chi Tacca. Withanolide và withanolide glycoside tìm thấy ở loài T. chantrieri và T. plantaginea; furostanol glycoside được phân lập từ 3 loài T. chantrieri, T. integrifolia và T. plantaginea; cholestan glycoside phát hiện có mặt ở loài T. chantrieri. 1.1.3.1. Các hợp chất taccalonolide Theo các công trình đã công bố, có 32 hợp chất taccalonolide (1-32) đã phân lập được từ các loài T. chantrieri, T. plantaginea, T. paxiana, T. paxiana và T. subflabellata (xem Bảng 1.3, Hình 1.3). Bảng 1.3. Các hợp chất taccalonolide (1-32) từ chi Tacca KH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Tên chất Taccalonolide A Taccalonolide B Taccalonolide C Taccalonolide D Taccalonolide E Taccalonolide F Taccalonolide G Taccalonolide H Taccalonolide I Taccalonolide J Taccalonolide K Taccalonolide L Taccalonolide M Taccalonolide N Taccalonolide O Taccalonolide P Bộ phận Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Thân rễ Loài T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. plantaginea T. chantrieri T. subflabellata T. subflabellata TLTK [8, 10, 11] [8, 10] [8, 12] [12] [8, 13] [13] [14] [14] [14] [14] [8, 14] [8, 15] [15] [2] [16, 17] [8, 16, 17]