Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sóc chụm (glochidion glomerulatum) và loài sóc lông (glochidion hirsutum) ở việt nam.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN VĂN THẮNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI SÓC CHỤM (GLOCHIDION GLOMERULATUM) VÀ LOÀI SÓC LÔNG (GLOCHIDION HIRSUTUM) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN VĂN THẮNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI SÓC CHỤM (GLOCHIDION GLOMERULATUM) VÀ LOÀI SÓC LÔNG (GLOCHIDION HIRSUTUM) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm 2. TS. Vũ Kim Thƣ Hà Nội – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS. TS. Phan Văn Kiệm và TS. Vũ Kim Thƣ. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Văn Thắng ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm và TS. Vũ Kim Thư - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh Biển đặc biệt là TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, TS. Hoàng Lê Tuấn Anh, TS. Bùi Hữu Tài, TS. Phạm Hải Yến và TS. Trần Hồng Quang về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Trường THPT Chuyên KHTN, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội và các đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Việt Nam (NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 104.01-2012.24. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Văn Thắng iii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................vi DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................ix DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................xi MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về chi Glochidion ........................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Glochidion ..................................................... 3 1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Glochidion .................... 4 1.1.2.1. Các hợp chất ankenyl glycoside ..................................................... 5 1.1.2.2. Các hợp chất butenolide ................................................................. 6 1.1.2.3. Các hợp chất flavonoid ................................................................... 7 1.1.2.4. Các hợp chất lignan ........................................................................ 8 1.1.2.5. Các hợp chất megastigmane ......................................................... 10 1.1.2.6. Các hợp chất phenolic và tannin ................................................... 11 1.1.2.7. Các hợp chất sesquiterpene ........................................................... 13 1.1.2.8. Các hợp chất triterpenoid .............................................................. 13 1.1.2.9. Các hợp chất khác ......................................................................... 21 1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Glochidion ..................... 23 1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ .................................................. 23 1.1.3.2. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................ 26 1.1.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật ........................................................... 27 1.1.3.4. Tác dụng chống nhiễm trùng, kháng viêm ................................... 28 1.1.3.5. Các hoạt tính khác......................................................................... 29 1.2. Giới thiệu về hai loài G. glomerulatum, G. hirsutum .................................... 31 1.2.1. Loài Glochidion glomerulatum .............................................................. 31 1.2.2. Loài Glochidion hirsutum ...................................................................... 31 1.2.3. Tình hình nghiên cứu về hai loài G. glomerulatum, G. hirsutum trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................................................... 32 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ....................................................... 34 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 34 iv 2.1.1. Loài Glochidion glomerulatum .............................................................. 34 2.1.2. Loài Glochidion hirsutum ...................................................................... 34 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 35 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất ....................................................... 35 2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc .............................................................. 35 2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào..................................... 37 2.3. Phân lập các hợp chất .................................................................................... 39 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài G. glomerulatum ..................................... 39 2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài G. hirsutum ............................................. 42 2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc .................. 44 2.4.1. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài G. glomerulatum .................................................................................................... 44 2.4.1.1. Hợp chất GG1: Glomeruloside I ................................................... 44 2.4.1.2. Hợp chất GG2: Glomeruloside II ................................................. 44 2.4.1.3. Hợp chất GG3: Glomeruloside A ................................................. 44 2.4.1.4. Hợp chất GG4: Glomeruloside B ................................................. 44 2.4.1.5. Hợp chất GG5: Glomeruloside C ................................................. 44 2.4.1.6. Hợp chất GG6: Glomeruloside D ................................................. 44 2.4.1.7. Hợp chất GG7: Glomeruloside E.................................................. 45 2.4.1.8. Hợp chất GG8: Glomeruloside F .................................................. 45 2.4.1.9. Hợp chất GG9: Glomeruloside G ................................................. 45 2.4.1.10. Hợp chất GG10: Glomeruloside H ............................................. 45 2.4.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài G. hirsutum ............................................................................................................ 45 2.4.2.1. Hợp chất GH1: Hirsutoside A ...................................................... 45 2.4.2.2. Hợp chất GH2: Hirsutoside B ....................................................... 46 2.4.2.3. Hợp chất GH3: Hirsutoside C ....................................................... 46 2.4.2.4. Hợp chất GH4: Hirsutoside D ...................................................... 46 2.4.2.5. Hợp chất GH5: Hirsutoside E ....................................................... 46 2.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc.......... 46 2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập từ loài G. glomerutum....................................................................................... 46 v 2.5.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài G. hirsutum................................................................................... 48 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ................................................................... 49 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài G. glomerulatum ............... 49 3.1.1. Hợp chất GG1: Glomeruloside I ............................................................ 49 3.1.2. Hợp chất GG2: Glomeruloside II ........................................................... 58 3.1.3. Hợp chất GG3: Glomeruloside A ........................................................... 65 3.1.4. Hợp chất GG4: Glomeruloside B ........................................................... 73 3.1.5. Hợp chất GG5: Glomeruloside C ........................................................... 80 3.1.6. Hợp chất GG6: Glomeruloside D ........................................................... 86 3.1.7. Hợp chất GG7: Glomeruloside E ........................................................... 91 3.1.8. Hợp chất GG8: Glomeruloside F ........................................................... 97 3.1.9. Hợp chất GG9: Glomeruloside G ......................................................... 102 3.1.10. Hợp chất GG10: Glomeruloside H ..................................................... 108 3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài G. hirsutum ...................... 115 3.2.1. Hợp chất GH1: Hirsutoside A .............................................................. 115 3.2.2. Hợp chất GH2: Hirsutoside B .............................................................. 121 3.2.3. Hợp chất GH3: Hirsutoside C .............................................................. 126 3.2.4. Hợp chất GH4: Hirsutoside D .............................................................. 131 3.2.5. Hợp chất GH5: Hirsutoside E .............................................................. 137 3.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc ........................... 143 3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập từ loài Sóc chụm (G. glomerulatum) ................................................................................143 3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập từ loài Sóc lông (G. hirsutum) .......................................................................................... 144 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 145 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 147 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ....................................................... 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 149 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ................................................................................ 158 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải Ac Ara A2780 Acetyl Arabinose Human ovarian carcinoma cell line Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells Hepatocellular carcinoma cell Bovine serum albumin Benzoyl Cacbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Column chromatography 1 H-1H- correlation spectroscopy Distortionless enhancement by polarisation transfer Human primary medulloblastoma cell line Dimethylsulfoxide 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Human prostate cancer cell line Acetyl Arabinozơ Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng Dòng tế bào ung thƣ phổi A-549 BEL-7402 BSA Bz 13 C-NMR CC COSY DEPT Daoy DMSO DPPH DU-145 EBV-EA EC50 ED50 ESI-MS Epstein – Barr Virus Half maximal effective concentration Median effective dose FBS G. Gal GC GI50 Electron spray ionization mass spectra Fetal bovine serum Glochidion Galactose Gas Chromatography Growth inhibition Gl Galic acid Dòng tế bào tiền ung thƣ gan Albumin huyết thanh bò Benzoyl Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 Sắc kí cột Phổ 1H-1H COSY Phổ DEPT U nguyên tủy bào (CH3)2SO 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Dòng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến Vi rút Epstein – Barr Nồng độ có hiệu lực 50% đối tƣợng thí nghiệm Liều lƣợng có hiệu quả ở 50% đối tƣợng thử nghiệm Phổ khối ion hóa phun m điện tử Huyết thanh bò Chi Glochidion Galactozơ Sắc ký khí Nồng độ ức chế 50% sự tăng trƣởng Axit galic vii Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải Glc GLC4 Glucozơ Tế bào ung thƣ phổi nhỏ ở ngƣời Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Dòng tế bào ung thƣ đại tràng Tế bào ung thƣ cổ tử cung Tế bào ung thƣ máu cấp HT-29 IC50 Glucose Human small cell lung cancer cell line Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy human colon cancer cell line HeLa cell Human promyelocytic leukemia cell Heteronuclear mutiple bond connectivity High performance liquid chromatography High resolution electronspray ionization mass spectrum Heteronuclear single-quantum coherence Colon adenocarcinoma cell line Inhibitory concentration at 50% K562 LN CaP human leukemic cell line Prostatic carcinoma cell line LPS LU-1 MCF-7 Me MIC Lipopolysaccharide Lung carcinoma cell line Human breast carcinoma Methyl Minimum inhibitory concentration Melt point 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-Diphenyltetrazolium bromide Human lung cancer Nuclear magnetic resonance Nuclear overhauser enhancement spectroscopy 1 H-NMR HCT15 HeLa HL-60 HMBC HPLC HR-ESI-MS HSQC Mp MTT NCI-H460 NMR NOESY Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Sắc ký lỏng hiệu năng cao Phổ khối lƣợng phân giải cao phun m điện tử Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử nghiệm Tế bào ung thƣ bạch cầu Dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt Lipopolysaccharide Dòng tế bào ung thƣ phổi Tế bào ung thƣ vú ngƣời Gốc metyl Nồng độ ức chế tối thiểu Điểm nóng chảy 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-Diphenyltetrazolium bromide Tế bào ung thƣ phổi ngƣời Cộng hƣởng từ hạt nhân Phổ NOESY viii Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải OD ORAC Optical density Oxygen radical absorbance capacity Human ovarian carcinoma cell line Platelet Activating factor Polymorphonuclear leukocytes Rhamnose Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy Roswell park memorial institute Mật độ quang Khả năng hấp thụ gốc tự do OVCAR PAF PMN Rha ROESY RPMI SF-268 SKOV3 Central nervous system cancer cell Ovarian cell line SK-MEL-2 SRB SW-626 TCA TLC TMS Xyl Melanoma cell line Sulforhodamine B Ovarian cancer cell line Trichloroacetic acid Thin layer chromatography Tetramethylsilane Xylose Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng Yếu tố kích hoạt tiểu cầu Bạch cầu đa hạt nhân Rhamnozơ Phổ ROESY Môi trƣờng nuôi cấy tế bào RPMI Tế bào ung thƣ thần kinh trung ƣơng Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng Dòng tế bào ung thƣ da Sulforhodamine B Tế bào ung thƣ buồng trứng Axit tricloaxetic Sắc ký lớp mỏng (CH3)4Si Xylozơ ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Glochidion ở Việt Nam ........................................... 4 Bảng 1.2. Các loài từ chi Glochidion đã công bố về thành phần hóa học ............................ 5 Bảng 1.3. Các hợp chất ankenyl glycoside từ chi Glochidion ................................................ 6 Bảng 1.4. Các hợp chất butenolide từ chi Glochidion ............................................................ 6 Bảng 1.5. Các hợp chất flavonoid từ chi Glochidion .............................................................. 7 Bảng 1.6. Các hợp chất lignan từ chi Glochidion ................................................................... 9 Bảng 1.7. Các hợp chất megastigmane từ chi Glochidion ................................................... 11 Bảng 1.8. Các hợp chất phenolic và tannin từ chi Glochidion............................................. 12 Bảng 1.9. Các hợp chất sesquiterpene từ chi Glochidion ..................................................... 13 Bảng 1.10. Các hợp chất triterpene từ chi Glochidion ......................................................... 14 Bảng 1.11. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Glochidion ........................................ 21 Bảng 2.1. % Ức chế sự phát triển tế bào của các hợp chất GG1-GG10 tại nồng độ 100 µM ............................................................................................................................................. 47 Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất GG1-GG10......... 47 Bảng 2.3. % Ức chế sự phát triển tế bào của các hợp chất GH1 - GH5 tại nồng độ 100 µM ............................................................................................................................................. 48 Bảng 2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất GH1-GH5 .......... 48 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG1 và hợp chất tham khảo ............................. 57 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG2 và hợp chất tham khảo ............................. 64 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG3 và hợp chất tham khảo ............................. 71 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG4 và hợp chất tham khảo ............................. 76 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG5 và hợp chất tham khảo ............................. 83 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG6 và hợp chất tham khảo ............................. 88 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG7 và hợp chất tham khảo ............................. 93 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG8 và hợp chất tham khảo ............................. 99 Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG9 và hợp chất tham khảo ........................... 106 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất GG10 và hợp chất tham khảo ....................... 112 Bảng 3.11. Thống kê 10 hợp chất mới phân lập được từ loài G. glomerulatum............... 114 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất GH1 và hợp chất tham khảo ......................... 120 x Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất GH2 và chất tham khảo................................. 124 Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất GH3 và chất tham khảo................................. 128 Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất GH4 và chất tham khảo................................. 135 Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất GH5 và chất tham khảo................................. 139 Bảng 3.17. Thống kê 5 hợp chất mới phân lập được từ loài G. hirsutum.......................... 141 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của triterpene khung olean-12-ene......................................................... 19 Hình 2.1. Mẫu thực vật loài Glochidion glomerulatum (Miq.) Boerl .................................. 34 Hình 2.2. Mẫu thực vật loài Glochidion hirsutum (Roxb.) Voigt ......................................... 34 Hình 2.3. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu G. glomerulatum................................................ 40 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước loài G. glomerulatum ........................ 41 Hình 2.5. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu G. hirsutum ........................................................ 42 Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn ethyl acetate loài G. hirsutum .................... 43 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG1 và hợp chất tham khảo GG1A ................. 49 Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG1 ...................................................................... 49 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG1 ........................................................................... 50 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất GG1 .................................................. 51 Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất GG1 ............................................................................... 52 Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất GG1 .............................................................................. 52 Hình 3.7. Phổ 1H – 1H COSY của hợp chất GG1 .................................................................. 53 Hình 3.8. Phổ ROESY của hợp chất GG1.............................................................................. 54 Hình 3.9. Kết quả phân tích GC các đường chuẩn và hỗn hợp đường của hợp chất GG1 sau khi thủy phân. .................................................................................................................... 55 Hình 3.10. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chính của hợp chất GG1 ................. 56 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG2 và hợp chất tham khảo GG1 .................. 58 Hình 3.12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG2 .................................................................... 59 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG2 ......................................................................... 59 Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG2 ........................................................................ 60 Hình 3.15. Phổ HSQC của hợp chất GG2 ............................................................................. 61 Hình 3.16. Phổ HMBC của hợp chất GG2 ............................................................................ 61 Hình 3.17. Phổ 1H – 1H COSY của hợp chất GG2................................................................ 62 Hình 3.18. Phổ ROESY của hợp chất GG2 ........................................................................... 62 Hình 3.19. Các tương tác chính HMBC, COSY và ROESY của hợp chất GG2 ................. 63 Hình 3.20. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG3 .................................................................... 65 Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG3 ......................................................................... 66 Hình 3.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG3 ........................................................................ 67 xii Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất GG3 ............................................................................. 68 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG3 và hợp chất tham khảo GG1A ............... 68 Hình 3.25. Phổ HMBC của hợp chất GG3 ............................................................................ 69 Hình 3.26. Phổ 1H – 1H COSY của hợp chất GG3................................................................ 70 Hình 3.27. Phổ ROESY của hợp chất GG3 ........................................................................... 71 Hình 3.28. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROESY của hợp chất GG3 ................. 71 Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG4 và hợp chất tham khảo GG3 .................. 73 Hình 3.30. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG4 .................................................................... 73 Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG4 ......................................................................... 74 Hình 3.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG4 ........................................................................ 75 Hình 3.33. Phổ HSQC của hợp chất GG4 ............................................................................. 75 Hình 3.34. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROESY của hợp chất GG4 ................. 76 Hình 3.35. Phổ HMBC của hợp chất GG4 ............................................................................ 78 Hình 3.36. Phổ 1H – 1H COSY của hợp chất GG4................................................................ 79 Hình 3.37. Phổ ROESY của hợp chất GG4 ........................................................................... 79 Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG5 và hợp chất tham khảo GG1A ............... 80 Hình 3.39. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG5 ......................................................................... 80 Hình 3.40. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG5 ........................................................................ 81 Hình 3.41. Phổ HSQC của hợp chất GG5 ............................................................................. 82 Hình 3.42. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROESY của hợp chất GG5 ................. 83 Hình 3.43. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG5 .................................................................... 85 Hình 3.44. Phổ HMBC của hợp chất GG5 ............................................................................ 85 Hình 3.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG6 và hợp chất tham khảo GG5 .................. 86 Hình 3.46. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROESY của hợp chất GG6 ................. 87 Hình 3.47. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG6 .................................................................... 90 Hình 3.48. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG6 ......................................................................... 90 Hình 3.49. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG6 ........................................................................ 91 Hình 3.50. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG7 và hợp chất tham khảo GG5 .................. 91 Hình 3.51. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROERY của hợp chất GG7 ................. 92 Hình 3.52. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG7 .................................................................... 95 Hình 3.53. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG7 ......................................................................... 95 xiii Hình 3.54. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG7 ........................................................................ 96 Hình 3.55. Phổ HSQC của hợp chất GG7 ............................................................................. 96 Hình 3.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG8 và hợp chất tham khảo GG5 .................. 97 Hình 3.57. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROESY của hợp chất GG8 ................. 98 Hình 3.58. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG8 .................................................................. 100 Hình 3.59. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG8 ....................................................................... 101 Hình 3.60. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG8 ...................................................................... 101 Hình 3.61. Phổ HSQC của hợp chất GG8 ........................................................................... 102 Hình 3.62. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG9 và hợp chất tham khảo GG7 ................ 102 Hình 3.63. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG9 .................................................................. 103 Hình 3.64. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG9 ....................................................................... 103 Hình 3.65. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG9 ...................................................................... 104 Hình 3.66. Phổ HSQC của hợp chất GG9 ........................................................................... 105 Hình 3.67. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROESY của hợp chất GG9 ............... 105 Hình 3.68. Phổ HMBC của hợp chất GG9 .......................................................................... 107 Hình 3.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất GG10 và hợp chất tham khảo GG2 .............. 108 Hình 3.70. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG10................................................................ 108 Hình 3.71. Phổ 1H-NMR của hợp chất GG10 ..................................................................... 109 Hình 3.72. Phổ 13C-NMR của hợp chất GG10 .................................................................... 110 Hình 3.73. Phổ HMBC của hợp chất GG10 ........................................................................ 111 Hình 3.74. Các tương tác chính COSY, HMBC và ROERY của hợp chất GG10............. 111 Hình 3.76. Cấu trúc hóa học của hợp chất GH1 và hợp chất tham khảo GH1B ............. 115 Hình 3.77. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GH1.................................................................. 115 Hình 3.78. Phổ 1H-NMR của hợp chất GH1 ....................................................................... 116 Hình 3.79. Phổ 13C-NMR của hợp chất GH1 ...................................................................... 116 Hình 3.80. Phổ HSQC của hợp chất GH1........................................................................... 117 Hình 3.81. Phổ HMBC của hợp chất GH1.......................................................................... 117 Hình 3.82. Phổ 1H – 1H COSY của hợp chất GH1.............................................................. 118 Hình 3.83. Phổ NOESY của hợp chất GH1 ......................................................................... 118 Hình 3.84. Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của hợp chất GH1 ............... 119 Hình 3.85. Cấu trúc hóa học của hợp chất GH2 và hợp chất tham khảo GH1................ 121 xiv Hình 3.86. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GH2.................................................................. 122 Hình 3.87. Phổ 1H-NMR của hợp chất GH2 ....................................................................... 122 Hình 3.88. Phổ 13C-NMR của hợp chất GH2 ...................................................................... 123 Hình 3.89. Các tương tác chính COSY, HMBC và NOESY của hợp chất GH2 ............... 124 Hình 3.90. Phổ HSQC của hợp chất GH2........................................................................... 126 Hình 3.91. Cấu trúc hóa học của hợp chất GH3 và hợp chất tham khảo GH2................ 126 Hình 3.92. Các tương tác chính COSY, HMBC và NOESY của hợp chất GH3 ............... 128 Hình 3.93. Phổ 1H-NMR của hợp chất GH3 ....................................................................... 130 Hình 3.94. Phổ 13C-NMR của hợp chất GH3 ...................................................................... 130 Hình 3.95. Cấu trúc hóa học của hợp chất GH4 và hợp chất tham khảo GH1................ 131 Hình 3.96. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GH4.................................................................. 131 Hình 3.97. Phổ 1H-NMR của hợp chất GH4 ....................................................................... 132 Hình 3.98. Phổ 13C-NMR của hợp chất GH4 ...................................................................... 132 Hình 3.99. Phổ HSQC của hợp chất GH4........................................................................... 133 Hình 3.100. Phổ HMBC của hợp chất GH4........................................................................ 133 Hình 3.101. Phổ 1H – 1H COSY của hợp chất GH4 ........................................................... 134 Hình 3.102. Phổ NOESY của hợp chất GH4....................................................................... 134 Hình 3.103. Các tương tác chính COSY, HMBC và NOESY của hợp chất GH4............. 135 Hình 3.104. Cấu trúc hóa học của hợp chất GH5 và hợp chất tham khảo GH4.............. 137 Hình 3.105. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GH5................................................................ 137 Hình 3.106. Các tương tác chính COSY, HMBC và NOESY của hợp chất GH5............. 138 Hình 3.107. Phổ 1H-NMR của hợp chất GH5 ..................................................................... 140 Hình 3.108. Phổ 13C-NMR của hợp chất GH5 .................................................................... 140 Hình 3.109. Phổ HSQC của hợp chất GH5......................................................................... 141 Hình 3.110. Cấu trúc hóa học của 15 hợp chất phân lập được từ loài G. glomerulatum (GG1 – GG10) và loài G. hirsutum (GH1 – GH5) ............................................................. 142 1 MỞ ĐẦU Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên đa dạng, phong phú và đặc biệt quý giá bởi chúng chứa những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tốt đã đƣợc phân lập và đƣa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh. Xu hƣớng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật để sử dụng làm dƣợc phẩm chữa bệnh đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ƣu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dƣợc phẩm tổng hợp. Việt Nam là đất nƣớc có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo ƣớc tính, ở Việt Nam có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao, trong đó có khoảng hơn 4.700 loài đƣợc sử dụng làm thuốc [1, 2]. Việc sử dụng nguồn tài nguyên này để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho ngƣời dân đã có quá trình lịch sử hàng nghìn năm. Các cây thuốc đƣợc sử dụng dƣới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá. Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, chi Bọt ếch (Glochidion) ở Việt Nam có nhiều loài đƣợc sử dụng làm thuốc và dƣợc liệu chữa các bệnh nhƣ: Sóc Dalton chữa lỵ trực tr ng; Bòn bọt chữa viêm ruột và lỵ, viêm da do tiếp xúc, ngứa, viêm da tróc vảy, mày đay, eczema; ở Viện Dƣợc liệu, lá cây Sóc mốc d ng làm thuốc mạnh gân xƣơng và hàn vết thƣơng; cây Sóc lông thƣờng d ng chữa tiêu chảy, ăn uống không tiêu, sôi bụng, lá cây d ng trị rắn cắn,...[3]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy chi Glochidion chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm nhƣ terpenoid, steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid và một số dạng phenolic khác. Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết và các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính đáng quan tâm nhƣ: gây độc tế bào ung thƣ, kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa,... Tuy nhiên, theo cơ sở dữ liệu Scifinder đến năm 2014 mới có khoảng 30 công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Glochidion. Ở Việt Nam, số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Glochidion còn rất hạn chế. Chính vì vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc 2 chi Glochidion ở Việt Nam tạo cơ sở khoa học trong việc sử dụng bền vững tài nguyên cây thuốc này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) và loài Sóc lông (Glochidion hirsutum) ở Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của hai loài G. glomerulatum, G. hirsutum ở Việt Nam. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh từ các loài này. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ cành và lá hai loài G. glomerulatum và G. hirsutum ở Việt Nam bằng các phƣơng pháp sắc ký; 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý, hóa học; 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Glochidion 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Glochidion Chi Glochidion (Bọt ếch) là một chi lớn thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), với khoảng 264 loài đã đƣợc phát hiện. Trên thế giới, các loài thuộc chi Glochidion phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á, các đảo Thái Bình Dƣơng, một phần ở vùng nhiệt đới châu Mỹ và châu Phi [4]. Các loài thuộc chi Glochidion đƣợc tìm thấy thƣờng là các cây gỗ hoặc cây bụi. Lá cây xếp so le, thành hai hàng hoặc thành hình xoắn ốc. Cuống lá ngắn, lá thƣờng là lá đơn, viền lá không có răng cƣa và gân lá có cấu trúc lông chim. Hoa xuất hiện ở nách lá hoặc gần nách lá. Hoa thƣờng mọc thành cụm hoặc khóm nhỏ. Hoa đực đặc trƣng với cuống nhỏ hoặc không có cuống, có năm đến sáu lá đài, không có cánh, thƣờng có từ ba đến tám nhị. Hoa cái có cuống hoa dày, cũng có lá đài nhƣ ở hoa đực nhƣng dày hơn, nhụy hoa hình cầu. Quả thƣờng có hình cầu hoặc gần hình cầu, có các rãnh dài trên quả, quả có thể có lông. Hạt hình cầu, hoặc bị dẹt về hai bên (giống hạt đậu), nội nhũ dày và có lá mầm dẹt [5]. Ở Việt Nam, theo tác giả Phạm Hoàng Hộ [1], chi Glochidion đã ghi nhận khoảng 25 loài. Chúng đƣợc phân bố khá rộng từ miền bắc đến miền nam, từ v ng núi đến vùng đồng bằng ven biển. Các loài thuộc chi Glochidion có thể đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi nhƣ trong các khu rừng dày, rừng bán thay lá, rừng thƣa hay rừng thứ sinh, mà độ cao thƣờng không vƣợt quá 1200m; ngoài ra còn có thể bắt gặp các loài thuộc chi này ở v ng đất lầy, rừng còi ven biển, thậm chí là v ng núi đá vôi. Trong số các loài thuộc chi Glochidion, nhiều loài ghi nhận đƣợc sử dụng làm thuốc hoặc sử dụng làm thực phẩm trong đời sống. Chẳng hạn, ở Vân Nam (Trung Quốc) lá loài G. assamicum đƣợc dùng làm thuốc trị mẩn ngứa và mụn nhọt sƣng lở. Lá và rễ cây G. obscurum ở Malaixia đƣợc sắc lấy nƣớc uống để trị bệnh tiêu chảy và bệnh đau dạ dày, còn ở Inđônêxia lá của loài này và vỏ loài G. glomerulatum d ng để trị bệnh lỵ. Từ quả loài G. daltonii, ngƣời dân Vân Nam (Trung Quốc) dùng làm thuốc trị ho, còn ở Việt Nam cây này d ng để chữa lỵ trực trùng. Ở Đông Dƣơng và Inđônêxia, lá non loài G. rubrum d ng để ăn, còn lá già d ng làm thuốc long đờm. Ngoài ra, lá và rễ loài G. hirsutum d ng để tiêu viêm, giải độc, chỉ khái, thu liễm, trị ho và đòn ngã; cành và lá loài G. lanceolarium có tác dụng tiêu viêm, kháng ứ, d ng để trị viêm lợi răng, viêm xoang miệng. Thêm nữa, lá loài G. obliquum đƣợc vò ra ngâm vào 4 nƣớc có thể trị ghẻ; cành lá cùng vỏ rễ, vỏ thân loài G. zeylanicum có thể trị viêm gan, trị đau bụng, chảy máu mũi hay trị ho đòn ngã [1]. Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Glochidion ở Việt Nam STT Tên khoa học 1 G. assamicum (Muell.-Arg.) Hook. f. 2 G. balansae Belle. 3 G. coccineum (Bucg.-Ham.) Muell.-Arg. 4 G. daltonii (Muell.-Arg.) Kurz 5 G. eriocarpum Champ. 6 G. fagifolium Muell.-Arg. 7 G. gamblei Hook. f. 8 G. glomerulatum (Miq.) Boerl. 9 G. hirsutum (Roxb.) Voigt 10 G. hongkongense Benth. 11 G. hypoleucum (Miq.) Boerl. 12 G. laevigatum Muell.-Arg. 13 G. lanceolarium (Roxb.) Voigt 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 G. littorale Bt. G. molle Hook. & Arn. G. obliquum Dence G. obscurum Bl. G. pilosum (Lour.) Merr. G. rigidum Muell.-Arg. G. rubrum Bl. G. sphaerogynum (Muell.-Arg.) Kurz G. talmyanum Beille. G. triloculare Merr. G. velutinum Wight G. zeylanicum A. Juss. Tên thƣờng gọi Sóc Asam Sóc Balansa Sóc đỏ Sóc Dalton Bòn bọt, bọt ếch lông Sóc lá dẽ Sóc Gamble Sóc chụm Sóc lông Sóc Hồng Kông Sóc mốc, Sóc dƣới trắng Sóc láng Sóc thon, bòn bọt lá to, bọt ếch lƣỡi mác Bọt ếch biển, trâm bột Sóc mềm Ghẻ, Sóc xéo Sóc che Sóc nam, cơm nguội Sóc cứng Sóc đỏ, muối ăn trái Sóc cái tròn Sóc Talmy Sóc ba buồng Bọt ếch, Sóc lông Sóc Tích lan 1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Glochidion Thống kê theo cơ sở dữ liệu Scifinder năm 2016, trong khoảng 264 loài của chi Glochidion, có 15 loài đã đƣợc công bố về thành phần hóa học bao gồm: G. acuminatum, G. assamicum, G. coccineum, G. eriocarpum, G. heyneanum, G. heypoleucum, G. hirsutum, G. obliquum, G. obovatum, G. puberum, G. rubrum, G. sphaerogynum, G. sumatranum, G. wrightii, G. zeylanicum. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy, các lớp chất đƣợc phân lập từ các loài trong chi Glochidion gồm triterpenoid, triterpenoid glycoside, flavonoid, megastigmane, lignan, secquiterpene, butenolide, phenolic, tannin và một số nhóm chất khác.